방법 논문

Microfluidic Double-layer Device를 사용한 미생물 단일 세포 성장 분석에서 빠른 산소 진동 생성

DOI:

10.3791/68697

⸱

2025년 7월 18일

 , 
1IBG-1: Biotechnology, Institute of Bio- and Geosciences, Forschungszentrum Jülich GmbH, 2Computational Systems Biotechnology (AVT.CSB), RWTH Aachen University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 이중층 미세유체 칩을 제작하고 급격한 산소 진동에서 미생물 성장을 분석하는 방법을 제시합니다. 이 장치의 성능은 유체 채널에서의 산소 감지와 미생물 배양을 통해 검증되었습니다.

초록

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타임 랩스 현미경 검사와 결합된 미세유체역학을 사용한 미생물 단일 세포 분석은 시공간 해상도로 제한된 환경에서 미생물 성장 거동을 조사할 수 있는 가능성을 가지고 있으며, 기존의 배양 및 분석 플랫폼에서는 얻을 수 없는 통찰력을 제공합니다. 산소는 미생물 성장을 결정하는 데 중요한 역할을 합니다. 그러나 초 범위의 시간 제어는 미세유체역학을 사용한 미생물 분석에서 구현되지 않았습니다. 최근에는 수십 초 범위의 시간 산소 제어를 가능하게 하는 이중층 PDMS 미세유체 칩을 개발했습니다. 칩은 가스 주입을 위한 상층과 배양 및 유체 관류를 위한 하단 층으로 구성됩니다. 두 층은 얇은 중간 PDMS 멤브레인으로 분리되어 두 층 간의 빠른 가스 교환을 가능하게 합니다. 이 방법론적 논문에서는 칩을 사용한 칩 제조, 특성화 및 미생물 배양 절차를 설명합니다. 대표적인 결과로, 우리는 일정하고 진동하는 산소 조건에서 수십 초 만에 빠른 산소 전환 능력, 미생물 배양 및 시간 분해 성장 분석을 입증합니다. 이 프로토콜은 미세유체 설정에서 시간적 산소 제어를 구현하는 데 관심이 있는 연구자를 지원하는 것을 목표로 합니다.

서론

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산소는 다양한 환경적 요인 중에서 미생물 성장 및 생리학과 밀접하게 연관되어 있으며, 특히 산화 스트레스 반응, 철 항상성 및 병원성 감염과 같은 세포 과정에 영향을 미칩니다 1,2,3. 전통적으로 미생물 배양은 주변 조건 하에서 또는 특정 산소 농도에서 최소한의 제어로 수행되었습니다. 반면에 현실적인 시나리오에서는 산소 환경이 많은 경우 일정하지 않고 시간이 지남에 따라 변동하는 경우가 많습니다. 예를 들어, 미생물은 수생 시스템에서 유체 이동과 미생물 운동성으로 인해 환경 주위를 이동하면서 몇 초에서 몇 분 이내에 변화하는 산소 농도에 노출될 수 있습니다 4,5,6. 마찬가지로, 산업용 바이오리액터는 부적절한 혼합으로 인해 불균일한 산소 환경을 생성하여 미생물 성장과 최종 수율에 영향을 미칩니다 7,8. 이러한 역동적인 조건에 대한 미생물 반응을 연구하는 것은 생태학적 과정을 이해하고 생명 공학 응용을 개선하는 데 필수적입니다.

대장균(E. coli)과 같은 통성 혐기성 동물은 산소 가용성에 따라 호기성 경로와 혐기성 경로 사이를 전환할 수 있습니다 9,10. 이전 연구에서는 이러한 대사 적응성을 탐구했지만 대부분의 연구는 미생물이 종종 직면하는 급격한 변화를 복제하지 못하는 기존 재배 시스템을 사용하는 단일 산소 이동에 초점을 맞추고 있습니다 9,11,12,13,14. 그 결과, 미생물이 자주 변화하는 산소 수치에 생리학적으로 어떻게 반응하는지에 대한 이해는 제한적입니다.

앞서 언급했듯이 기존 실험실 설정은 급격한 산소 변동을 모방하는 데 필요한 정밀도와 속도가 부족하고 지속적인 고해상도 모니터링을 지원하지 않습니다. 이 문제를 해결하기 위해 최근에는 이중층 폴리디메틸실록산(PDMS) 칩을 갖춘 특수 미세유체 플랫폼을 개발하여 신속한 산소 제어 및 단일 세포 이미징을 가능하게 했습니다15. 여기에서는 빠른 산소 진동을 생성하고 제어된 산소 조건에서 미생물 단세포 성장 분석을 가능하게 하는 이중층 미세유체 칩을 제조하기 위한 프로토콜을 제공합니다. 이 칩은 가스 관류를 위한 최상층과 유체 관류 및 미생물 배양을 위한 최하위 층의 두 가지 층으로 구성됩니다. 두 층 사이의 중간 얇은 멤브레인은 빠른 가스 교환을 가능하게 합니다. 실증으로, 개발된 칩에서 대장균 MG1655를 배양하였다. 일정하고 진동하는 산소 조건에서의 성장을 분석했습니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 금형 준비

  1. 3D 프린팅으로 최상층용 금형을 준비합니다. 생성된 PDMS 최상층의 매끄러운 표면을 보장하기 위해 표면이 매끄러운 최상층 금형을 제작합니다. SLA(Stereolithography) 3D 프린팅을 사용하는 것이 좋습니다.
    1. 3D CAD 소프트웨어를 사용하여 금형을 설계합니다(그림 1A). 설계에 하단 유체 채널과 겹치는 가스 채널이 포함되어 있는지 확인합니다. 이 설계 프로세스는 맨 아래 계층을 설계하는 것과 병행하여 수행합니다(단계 1.2.1).
    2. SLA 3D 프린팅을 사용하여 금형을 인쇄합니다. 인쇄된 금형에서 남은 수지를 제거하고 이소프로필 알코올(IPA) 수조에서 30분 동안 세척합니다(그림 1B).
    3. 수지 유형 및 형상에 따라 적절한 지속 시간과 온도로 금형을 405nm 광에 노출시켜 후경화를 수행합니다.
    4. 금형을 초음파 수조에서 IPA에 15분 동안 담가두어 금형에 남아 있는 경화되지 않은 수지를 제거하여 PDMS 경화를 억제할 수 있습니다.
  2. 바닥 층에 대한 실리콘 웨이퍼 몰드를 준비합니다.
    1. CAD 레이아웃 편집기로 미세유체 칩을 설계합니다(그림 1C). 설계에 입구, 유체 채널 및 출구가 포함되어 있는지 확인합니다.
    2. 이전 논문(그림 1D)16에서 설명한 대로 2층 포토리소그래피를 사용하여 실리콘 웨이퍼 금형을 만듭니다.
      참고: 맨 아래 레이어의 채널은 μm 크기이며 정밀한 제작이 필요한 반면 맨 위 레이어의 채널은 mm 크기입니다. SLA 3D 프린팅은 제작 시간이 짧고 프로토타이핑 속도가 빠르기 때문에 SLA 프린팅은 최상층 금형의 다소 큰 구조를 제작하는 데 사용되었습니다. 바닥층은 정확한 제작을 보장하기 위해 포토리소그래피로 제작되었습니다. 최상층의 채널도 μm 범위에 있고 정밀도가 필요한 경우 포토리소그래피를 사용하여 금형을 제작하는 것도 고려하십시오.

2. PDMS 이중층 미세유체 칩 제작

  1. 베이스와 경화제를 10:1의 비율로 철저히 혼합하여 PDMS 사전 경화 용액을 준비합니다. 건조제에서 혼합물을 1시간 동안 가스를 제거합니다.
  2. IPA로 최상층 금형을 청소하고 압축 공기를 사용하여 건조시킵니다.
  3. PDMS를 최상층 금형에 붓고 80°C에서 20분 동안 열처리 경화합니다(1차 경화 단계, 그림 1E). 1차 경화 단계에서는 PDMS가 완전히 경화되지 않은 상태에서 PDMS의 박리, 절단 및 펀칭이 가능합니다.
  4. 20분 가열 후 손이나 핀셋으로 PDMS 점착도를 확인합니다. PDMS가 여전히 끈적거리면 가열 시간을 조정하십시오.
  5. 최상층 금형에서 PDMS를 떼어내고 단일 조각(여기서는 20mm x 18mm)으로 자릅니다. 가스 주입구용 펀치 구멍(직경 = 0.75mm)(그림 1F). IPA로 헹구고 압축 공기로 건조시킨 후 접착 테이프를 부착하여 최상층의 바닥면을 청소합니다.
  6. IPA로 하단 레이어 금형을 청소하고 압축 공기를 사용하여 건조시킵니다. 스핀 코팅기에 하단 레이어 금형을 고정하고 금형 중앙에 PDMS를 붓습니다. PDMS를 웨이퍼 가까이에 부어 기포를 줄입니다. PDMS를 주입한 후 기포가 발견되면 깨끗한 핀셋이나 바늘을 사용하여 바깥쪽으로 옮깁니다.
  7. PDMS를 1000rpm에서 60초 동안 바닥층 금형에 스핀 코팅한 다음 80°C에서 10분 동안 열 경화합니다(1차 경화 단계, 그림 1G). 10분 후 손이나 핀셋으로 PDMS 끈적임을 확인하고 필요한 경우 가열 시간을 조정합니다.
  8. 상층 PDMS 조각을 금형의 하단 PDMS 층에 놓고 상단에서 단단히 눌러 상단 및 하단 레이어의 표면 부착을 확인합니다(그림 1H).
  9. PDMS를 80°C에서 최소 1시간 동안 완전히 열처리합니다(2차 경화 단계). 2차 경화 단계에서는 상층과 하부층이 비가역적으로 결합되는 최종 PDMS 경화가 가능합니다(그림 1H).
  10. PDMS 바닥 층을 조각으로 부드럽게 자릅니다. 금형에서 전체 PDMS 칩을 조심스럽게 떼어냅니다(그림 1H).
    참고: PDMS 칩이 금형에서 벗겨지기 어려운 경우 박리 절차를 용이하게 하기 위해 실란화 및 화학적 표면 코팅과 같은 하단 층 금형의 추가 표면 처리를 고려하십시오. 벗겨내는 동안 상층과 하층이 분리되는 경우, 1차 경화 단계의 시간을 단축하는 것을 검토해 보십시오.
  11. 유체 채널의 양쪽 끝에 있는 유체 입구 및 출구를 위한 펀치 구멍(직경 = 0.5mm)(그림 1H). IPA로 헹구고 압축 공기로 건조시킨 다음 스카치 테이프를 부착하여 칩의 바닥 표면을 조심스럽게 청소합니다.
  12. 플라즈마 산화로 표면을 활성화한 후 0.175mm 두께의 커버 유리로 칩을 접착합니다(25초, 그림 1H).
  13. 유리 기판에 칩을 놓은 후 압축 공기로 상단 층을 세척하여 PDMS 멤브레인 하단 층이 유리에 제대로 부착되었는지 확인합니다.
  14. 본딩 칩을 80°C에서 10초에서 1분 동안 가열하여 본딩 안정성을 높입니다.
    참고: 앞서 언급한 PDMS 경화 단계와 필요한 경화 시간은 금형 두께, 장비 및 주변 조건과 같은 다양한 매개변수의 영향을 받을 수 있습니다. 따라서 제안된 프로토콜이 응용 분야에 적합하지 않은 경우 그에 따라 경화 시간을 조정하십시오.

3. 실험 설정

참고: CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor) 카메라, FLIM(Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) 카메라(주파수 도메인) 및 온도 인큐베이터가 장착된 도립 현미경이 표준 실험 설정으로 사용됩니다. 변조된 여기 레이저 소스(445nm, 100mW)가 FLIM 카메라에 연결됩니다. 가스 제어에는 3개의 질량 유량 컨트롤러(질소, 산소 및 이산화탄소)가 사용됩니다. 주사기 펌프는 중간 관류에 사용됩니다.

  1. 가스(입구) 및 유체(입구 및 출구) 관류를 위한 튜브를 준비합니다. 실험 전에 원하는 온도(여기서는 37°C)에 도달하도록 인큐베이터를 켭니다.
  2. 원하는 대물 렌즈(여기서는 산소 감지용 20x, 미생물 관찰용 100x)를 선택하고 필요한 경우 이멀젼 오일을 추가합니다. 접착제로 칩 홀더에 이중층 칩을 고정합니다.

4. 온칩 산소 제어 및 감지

  1. 적절한 농도의 산소에 민감한 염료 용액을 준비합니다 (여기서는 3mM tris (2,2'-bipyridyl) dichlororuthenium (II) hexahydrate, RTDP).
  2. 알려진 수명(여기서는 3.75ns)을 가진 참조 슬라이드를 사용하여 FLIM 카메라를 보정합니다. FLIM 카메라로 신호 강도를 측정하고 노출 시간 또는 현미경 조리개를 조정하여 더 나은 보정을 위해 0.68 - 0.72 신호 강도를 달성합니다.
  3. 현미경 스테이지에 칩 홀더를 고정합니다. 유체 입구와 출구에 적절한 튜브를 연결합니다. 주사기 펌프(여기서는 100nL/min)를 사용하여 일정한 유속으로 산소에 민감한 염료 용액을 관류하기 시작합니다.
  4. 가스 주입구와 질량 유량 컨트롤러를 적절한 튜브로 연결합니다. 제어된 산소 농도(여기서는 0% 또는 21% 산소, 총 질량 유량 600mL/분)로 가스 플러싱을 시작합니다.
  5. 산소가 없는 경우(τ0) 및 다른 알려진 산소 농도(여기서는 21%)에서 위상 수명을 측정합니다. 다음과 같이 Stern-Volmer 방정식을 사용하여 담금질 상수(Kq)를 계산하며, 이는 산소가 있는 상태에서 형광 담금질을 설명합니다. 대안적으로, 형광 강도 (I)를 사용할 수 있습니다. 그러나 Intensity-based measurement는 light source intensity, photo bleaching 등의 변화에 영향을 받을 수 있습니다.
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    알림: 특히 산소 고갈 수준을 0%만큼 낮게 목표로 하는 경우 정확한 보정을 보장하기 위해 가스 플러싱을 시작한 후 몇 분 동안 기다리는 것이 좋습니다. 정밀도를 향상시키려면 산소 제거제 사용 또는 추가 밀폐 챔버 설정과 같은 추가 산소 고갈 방법으로 공정을 보완하는 것이 좋습니다.
  6. 위상 수명을 측정하고 Stern-Volmer 방정식을 사용하여 해당 산소 농도를 계산합니다. 진동 산소 조건을 생성하려면 기기 제어 시스템을 사용하여 질소 및 산소에 대한 체적 유량 조정을 자동화할 수 있습니다.

5. 세균 배양 준비

  1. . 원하는 배지(여기서는 10g/L 펩톤, 5g/L 효모 추출물 및 10g/L NaCl을 포함하는 LB 배지)에 원하는 유기체(여기서는 E. coli MG1655, 플라스크당 극저온 바이알에서 바로 사용할 수 있는 단일 비드)를 접종하고 하룻밤(여기서는 150rpm에서 37°C)하여 배양하여 전배양을 시작합니다.
  2. 600nm(OD600)에서 광도계를 사용하여 결과 광학 밀도를 측정합니다.
  3. 사전 배양을 접종하여 LB 배지에서 다음 배양을 시작합니다(여기서는 초기 OD600 = 0.3 또는 0.0001). 기하급수적 성장 단계에 도달할 때까지 배양을 배양합니다.
    참고: 온-칩 배양을 위한 배지가 제1 전배양 배지와 다른 경우, 유기체가 새로운 배지(16)에 익숙해질 수 있도록 온-칩 배양을 위한 배지로 두 번째 전배양을 수행하는 것이 바람직하다.
  4. 배양물을 적절한 광학 밀도로 희석하여 파종액을 준비합니다. 다음 단계를 위해 시딩 용액을 1mL 주사기에 옮깁니다. E. coli의 경우 파종 용액의 광학 밀도(OD600)는 약 0.5였습니다.

6. 통제된 산소 조건 하에서 온칩 미생물 배양 및 타임랩스 이미징

  1. 현미경 스테이지에 칩 홀더를 고정합니다. 칩 홀더와 PDMS 칩을 인큐베이터(여기서는 37°C)에서 몇 시간 동안 예열하면 온도 관련 변위로 인한 타임 랩스 이미징 중 초점 흐리기 위험이 줄어듭니다.
  2. 재배를 시작하기 전에 총 유량과 이산화탄소 유량을 일정하게 유지하면서 산소 및 질소 질량 유량의 체적 백분율을 조정하여 원하는 초기 산소 농도로 가스 주입을 시작하십시오.
  3. 칩의 가스 주입구와 질량 유량 컨트롤러를 연결합니다.
  4. 시린지 용액이 있는 주사기를 유체 배출구에 연결하고 주사기를 수동으로 밀어 유기체를 칩에 파종합니다. 현미경을 통해 세포가 배양실에 성공적으로 갇혔는지 확인하십시오.
  5. 세포 접종 후 주사기를 제거하고 새 배지가 있는 다른 주사기를 유체 주입구에 연결합니다. 주사기를 수동으로 밀어 매체 공급 채널에 남아 있는 세포를 씻어냅니다.
  6. 주사기 펌프를 사용하여 일정한 유속(여기서는 100nL/min)으로 매체를 관류하기 시작합니다. 부적절한 속도로 인해 챔버가 건조될 수 있으므로 충분한 유속을 확보하십시오. 충분한 유량은 유체 채널의 형상 및 최상층 채널의 가스 유량을 포함한 여러 요인에 따라 달라질 수 있습니다.
  7. 타임랩스 이미지 획득을 시작합니다. 진동하는 산소 조건에서 재배하려면 이미지 획득이 시작되는 동시에 질량 유량 컨트롤러의 자동 제어를 시작하십시오. 가스 제어 및 이미지 획득 시작이 지연되는 경우 나중에 이미지 데이터 분석을 위해 지연을 고려하십시오.

7. 이미지 데이터 분석

  1. 타임랩스 이미지를 위치당 하나의 이미지 스택으로 저장합니다.
  2. 이미지를 전처리하여 이미지 분석 프로그램을 사용하여 경작된 군체를 회전, 정렬 및 자릅니다. 전처리된 . TIF 이미지는 여기에서 볼 수 있습니다: https://doi.org/10.5281/zenodo.1398274715
  3. 세포를 분할하고 세포 수, 길이, 면적, 형광 강도 등과 같은 관련 값을 추출합니다. 성장 행동을 추가로 분석합니다. 예제 Python 스크립트는 https://github.com/JuBiotech/Supplement-to-Kasahara-et-al.-202515에서 사용할 수 있습니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PDMS 이중층 칩 제작
제작된 이중층 칩은 그림 2A에 시각화를 위한 컬러 가스 채널(빨간색)과 유체 채널(파란색)이 있는 것으로 묘사되어 있습니다. 이 칩에는 3개의 동일한 유체 채널과 중첩된 가스 채널이 있어 병렬 실험이 가능합니다. 유체 채널에는 일련의 배양 챔버가 있는 배양 영역이 있습니다(그림 2A(i)). 세포는 배양실 내부에 갇혀 단층 형태로 성장할 수 있으며, 이를 통해 높은 이미지 획득 속도로 고해상도 타임 랩스 이미징을 수행할 수 있습니다. 칩의 단면은 3mm 두께의 상층과 65μm 두께의 하부층을 보여주며, 중간 PDMS 멤브레인을 통해 기체 채널에서 유체 채널로 기체를 빠르게 확산할 수 있습니다(그림 2A (ii-ii')).

온칩 산소 제어
개발된 칩의 가스 교환 능력은 FLIM 및 산소에 민감한 염료15를 사용하여 테스트되었습니다. 그림 2B에서 볼 수 있듯이, 유체 채널의 산소 농도는 산소 농도가 21%와 0% 사이에서 이동했을 때 수십 초 이내에 해당 감소 또는 증가를 보였습니다. 이러한 산소 측정 결과는 수십 초의 빠른 산소 진동이 개발된 이중층 미세유체 칩에서 복제될 수 있음을 보여줍니다.

일정한 산소 조건에서의 미생물 배양
이 칩은 다양한 산소 농도의 일정한 기체 상태에서 통성 혐기성 대장균 성장을 특성화하기 위해 처음 사용되었습니다. 예비 실험에서 이산화탄소가 고갈되면 대장균의 성장이 제한되는 것을 관찰했기 때문에 항상 공급 가스에 이산화탄소가 추가되었습니다(데이터는 표시되지 않음). 그림 3A와 그림 3B는 각각 호기성(21% 산소 공급) 및 혐기성(0% 산소 공급) 조건에서 대장균의 대표적인 위상차 이미지를 보여줍니다. 배양 3시간 후, 호기성 조건에서 자란 대장균은 혐기성 조건에 비해 더 큰 군체를 생성했습니다. 또한 정량적 분석은 그림 3C의 성장 곡선에서 볼 수 있듯이 산소 가용성에 따라 군집 크기(A군체)의 증가율이 다르다는 것을 보여줍니다. 콜로니는 다른 콜로니와 조건을 비교할 수 있도록 초기 영역으로 정규화됩니다. 기하급수적 성장률 μ은 다음과 같이 성장 곡선에서 결정할 수 있으며 그림 3D에 요약되어 있습니다.

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그 결과 목표 농도에서 산소를 제어하고 획득한 타임 랩스 이미지에서 해당 미생물 성장을 효과적으로 분석하는 장치의 기능을 검증했습니다.

진동하는 산소 조건에서의 미생물 배양
마지막으로, E. coli는 진동 산소 조건에서 배양되어 스위칭 간격 T'로 호기성 및 혐기성 가스 처리 단계 사이를 전환했습니다. 진동 산소 조건과 관련하여 시간 분해 성장 분석 기능을 테스트하기 위해 60분에서 1분 사이의 다양한 T'를 검사했습니다. 그림 4는 T' = 60, 30, 10, 5, 2, 1분의 진동 산소 조건에서 정량화된 대장균 성장을 보여줍니다. A군체를 기반으로 한 성장 곡선 외에도 Δt μ 순간 성장률도 다음과 같이 시간 분해 통찰력을 얻기 위해 결정됩니다.

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일정한 호기성 및 무산소 조건에서의 성장률은 그림 4의 성장 참조로 점선(μ21%, μ0%)으로 표시됩니다. 대장균 성장은 진동하는 기체 상태에 반응하여 뚜렷한 역학을 나타냈습니다. 예를 들어, 가스 발생 단계가 호기성에서 혐기성 조건(T' = 60분)으로 전환된 후 성장은 (i) 반응 단계: 성장률의 급격한 감소, (ii) 회복 단계: 성장률의 점진적인 증가, (iii) 안정화 단계: 약 μ0%의 성장 안정화를 보였습니다. 대장균 성장 역학은 1분 정도의 짧은 다양한 T' 하에서 시간적으로 성공적으로 해결되었으며, 여기서 대장균은 변화하는 기체 상태에 성장을 적응할 수 있는 시간이 제한되어 있기 때문에 단조로운 성장 속도를 보였다. 또한, 성장 행동은 군집 수준뿐만 아니라 단세포 수준에서도 분석할 수 있습니다. 그림 5는 다양한 스위칭 간격 T'에서 산소 진동하의 단일 세포 영역의 발달을 보여줍니다. 단일 세포 성장은 추적 분석 없이 인접 플롯을 따라 추론할 수 있습니다. 단세포 수준에서의 성장 행동은 그림 4의 군체 수준에서 관찰된 것과 유사합니다. 호기성 가스 주입 단계에서 더 빠른 면적 증가와 가스 전환 이벤트에서 성장 속도의 명확한 변화. 여기서의 결과는 진동하는 기체 조건에서 미생물을 배양하고 시간 분해 방식으로 산소 가용성과 상관 관계에 있는 미생물 성장을 분석할 수 있는 능력을 보여줍니다.

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그림 1: 이중층 칩 제조 절차. 절차는 (A, C) 금형 설계, (B, D) 금형 제작, (E-G) PDMS 성형 및 (H) 칩 조립으로 시작됩니다. 이 수치는15에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 제작된 이중층 칩과 산소 제어 기능. (A) 제작된 칩의 대표 이미지가 제시되며, 시각화를 위해 유색 가스 채널(빨간색)과 유체 채널(파란색)이 특징입니다. SEM 이미지는 (i)에 나와 있으며, 양쪽의 유체 채널(스케일 바 100μm)에 연결된 일련의 배양 챔버를 묘사합니다. 칩의 단면은 (ii-ii')에 표시되어 있으며, 3mm 두께의 상층과 65μm 두께의 하부층을 나타냅니다. (B) 호기성(21% 산소)과 무산소(0% 산소) 조건 사이의 전환 후 유체 채널에서 측정된 산소 농도. 이 수치는15에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 일정한 산소 조건에서의 대장균 배양. (A) 세포는 3시간 동안 호기성으로(21% 산소 공급) 배양되고 위상차 현미경을 사용하여 타임랩스 이미지를 획득합니다. (B) 세포는 혐기성으로 배양되고(0% 산소 공급) 3시간 동안 타임랩스 이미지를 획득합니다.(C) 다양한 일정한 산소 조건에서의 세포 성장은 A콜로니를 기준으로 플롯됩니다. (D) 기하급수적 성장률을 계산하고 요약합니다. 모든 스케일 바 = 5μm. 데이터는 평균 ± n = 35 콜로니(0%), 27(0.1%), 21(0.5%), 16(1%), 13(5%), 13(10%), 29(21%)로 표시됩니다. 이 수치는15에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 진동 산소 조건에서의 대장균 배양. 다양한 진동 산소 조건에서의 세포 성장을 조사합니다(T', 호기성과 무산소 조건 사이의 전환 간격). A콜로니 를 기반으로 한 세포 성장은 시간 경과에 따라 표시되고(위), μΔt는 시간 경과에 따라 표시되어 시간 분해 데이터 해석이 가능합니다(아래). 데이터는 평균 ± S.D. n = 5 콜로니(60분), 3(30분), 4(10분), 4(5분), 4(2분), 5(1분)로 표현됩니다. 이 수치는15에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 진동하는 산소 조건에서 배양된 대장균의 단일 세포 영역(단일 세포). 데이터는 각 스위칭 간격 T'의 대표 콜로니에서 가져온 것입니다. 이 수치는15에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이중층 미세유체 시스템을 제작하고 운영하기 위한 프로토콜은 높은 시공간 분해능으로 빠르게 진동하는 산소 조건에서 미생물 성장을 관찰하기 위해 제공되었습니다. 타임 랩스 이미징과 결합된 이 플랫폼은 제어된 산소 조건에서 미생물의 온칩 배양 및 실시간 모니터링을 가능하게 하여 산소 가용성과 관련된 미생물 성장을 분석할 수 있습니다.

이 프로토콜에서는 상단 및 하단 레이어를 별도로 준비한 다음 단일 칩으로 조립합니다. 이 모듈식 개념은 2계층 구성을 대체하는 것만으로도 다양한 칩 설계를 가능하게 합니다. 상부 및 하부 레이어 금형에 대해 각각의 크기와 정확도 요구 사항에 따라 다양한 제조 방법(상부의 경우 SLA 3D 프린팅, 하단의 경우 포토리소그래피)이 사용되었습니다. 이 접근 방식은 제조 공정의 전반적인 효율성을 향상시킵니다. 두 층의 조립은 2단계 PDMS 경화 공정을 통해 이루어집니다. 금형 두께와 국소 가열 조건이 PDMS 경화 결과에 영향을 미칠 수 있으므로 설계에 따라 첫 번째 경화 단계의 가열 시간을 최적화하는 것이 필수적입니다.

우리는 공기 투과성이 높은 PDMS의 특성을 활용하여 신속한 산소 전환을 달성합니다. 다른 한편으로, 산소 제어의 정밀도는 특히 낮은 산소 농도에서 PDMS를 통한 산소의 수동 확산에 의해 영향을 받을 수도 있습니다. 이러한 제한을 보완하기 위해 프로토콜에 추가 개선 사항을 추가할 수 있습니다. 예를 들어, 산소 센서의 교정 방법에는 개선의 여지가 있습니다. 시연된 프로토콜에서 센서는 PDMS 이중층 칩을 사용하여 0% 및 21% 산소 수준의 두 가지 기준점에서 보정됩니다. 결과적으로 산소 감지의 정밀도는 교정을 위한 정확한 산소 고갈 조건을 생성하는 능력에 달려 있습니다. 프로토콜에서 언급했듯이 특히 산소 고갈 수준을 0%로 낮추는 경우 정확한 보정을 보장하기 위해 가스 플러싱을 시작한 후 몇 분 동안 기다리는 것이 좋습니다. 그럼에도 불구하고 이 작업은 공기 투과성 PDMS 칩의 잠재적인 누출 또는 공기 저류로 인해 까다롭습니다. 교정 정확도는 산소를 제거하는 화학 물질을 사용하거나 단단히 밀봉된 가스 고갈 챔버17,18에 칩을 포함함으로써 더욱 향상될 수 있습니다. 이러한 보충제는 엄격한 혐기성 및 저산소 조건에서 미생물 거동을 보다 강력하고 정확하게 분석할 수 있습니다.

시연된 장치는 다양한 연구 분야에서 관심을 가질 것입니다. 예를 들어, 산소 가용성이 시공간적으로 불균일하다고 가정되는 산업용 생물 반응기에서 산소 조건을 복제하는 데 유용할 것입니다 7,8,19,20. 이중층 칩을 사용하여 연구원들은 기존의 배양 환경에서는 불가능했던 빠르게 변동하는 산소 환경에서 미생물 거동을 특성화하고 이해할 수 있습니다.

공개 사항

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감사의 글

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KK는 일본학생지원기구(JASSO)의 교환학생 지원 프로그램(G2130401003N)과 독일 연구 재단(DFG)의 지원을 받았습니다 - SFB1535 - 프로젝트 ID 458090666.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
클레인 5WieWeb 소프트웨어, 네덜란드해당 사항 없음레이아웃 편집기
CMOS 카메라Nikon, 일본DS-Qi2
커버 유리Schott AG, 독일D263 바이오39.5mm x 34.5mm x 0.175mm
펨토 플라즈마 클리너Diener Electronics, 독일-칩 플라즈마 본딩
양식 3BFormlabs, 미국-3D 프린터
수명 참조Starna Scientific, 영국움-SFG
질량 유량 컨트롤러Vö gtlin Instruments GmbH, 스위스GSC-A9SA-BB22 시리즈질소, 산소
질량 유량 컨트롤러Vö gtlin Instruments GmbH, 스위스GSC-A9SA-BB21 시리즈이산화탄소
모델 v3 수지Formlabs, 미국RS-F2-DMBE-033D 프린트 수지
나크롬Carl Roth, 독일3957.1LB 중간 성분
니콘 이클립스 Ti-E 2Nikon, 일본-도립 현미경
pco.flim 카메라PCO AG, 독일-
pco.flim 레이저Omicron-Laserprodukte GmbH, 독일-
펩톤Carl Roth, 독일8986.1LB 중간 성분
계획 Apo & 람다;Nikon, 일본-오일 100배, 20배
폴리디메틸실록산(PDMS)미국 다우케미컬컴퍼니Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트
펀칭 도구, Φ 0.50 밀리미터World Precision Instruments, 미국504528
펀칭 도구, Φ 0.75 밀리미터World Precision Instruments, 미국504529
ROTI Store 크라이오 바이알Carl Roth, 독일-
Solidworks 2016 x64 에디션Dassault Systems, 프랑스해당 사항 없음3D CAD
기판 스핀 코터APT Automation, 독일스핀150iPDMS 스핀코팅
주사기 펌프CETONI, 독일네메시스
온도 인큐베이터Okolab, 이탈리아-현미경 장비
트리스(2,2'-비피리딜)디클로로루테늄(II)육수화물, (RTDP)Acros Organics, 벨기에208750010
배관Saint-Gobain, 프랑스타이곤 F-4040-A가스 흡입구 튜브
배관Saint-Gobain, 프랑스타이곤 AAD04103유체 튜브
효모 추출물Carl Roth, 독일2363.3LB 중간 성분

참고문헌

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