미세유체공학 기반 고처리량 순환 종양 세포 분류 및 단일 세포 시퀀싱 기술

Summary

순환 종양 세포(CTC)는 암 진행 및 전이 연구에 매우 중요합니다. 이 기사에서는 CTC 농축 및 단일 CTC 시퀀싱을 위한 고처리량 통합 프로토콜을 제시하여 포획 효율성과 CTC 순도를 개선하는 동시에 오염 및 시퀀싱 비용을 줄여 정밀 종양학 연구 및 임상 응용을 발전시킵니다.

Abstract

순환 종양 세포(CTC)는 암 전이, 진행 및 재발을 추적하기 위한 유망한 바이오마커 역할을 합니다. CTC 검출을 중심으로 한 액체 생검 기술은 비침습적 특성과 종양 역학의 실시간 모니터링을 제공하는 능력으로 인해 상당한 잠재력을 입증했습니다. 그러나 기존의 대량 CTC 분석은 CTC 집단 간의 본질적인 이질성을 포착하지 못하여 종양 생물학에 대한 중요한 통찰력을 모호하게 만듭니다. 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)은 CTC 이질성의 고해상도 특성화를 가능하게 하여 정밀 종양학 및 종양 진행의 기계론적 연구를 위한 새로운 기회를 제공합니다. 이러한 장점에도 불구하고 단일 CTC 시퀀싱을 위한 기존 방법론은 낮은 회수율, 노동 집약적인 작업 흐름, 여러 수동 처리 단계와 관련된 오염 위험 등 비효율성으로 어려움을 겪는 경향이 있습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 CTC 농축, 정제 및 단일 세포 시퀀싱을 통합 워크플로우로 통합하는 통합 미세유체 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 와류 혼합 및 누적 면역자기 비드 결합을 통해 세포 손상을 최소화하면서 강력하고 처리량이 많은 CTC 분리를 가능하게 하는 헤링본 구조 칩 내에서 동적으로 제어되는 자기 포획을 사용합니다. 백혈구 항체로 코팅된 미세유체 칩을 사용한 후속 정제는 비표적 세포를 효과적으로 제거하여 음성 선택을 통해 CTC 순도를 더욱 향상시킵니다. 마지막으로, 차동 흐름 저항 원리를 기반으로 설계된 고정밀 단일 셀 시퀀싱 칩은 효율적인 단일 셀 캡처 및 고유한 바코드 마이크로비드와의 페어링을 용이하게 합니다. 이 새로운 플랫폼은 푸아송 분포 기반 방법의 한계를 극복하여 CTC 활용도를 향상시키는 동시에 마이크로비드 소비 및 시퀀싱 비용을 최소화합니다. 당사의 통합 프로토콜은 CTC 캡처 효율성, 순도 및 단일 세포 시퀀싱 처리량을 크게 향상시켜 임상 응용 및 대규모 암 연구에 매우 적합합니다. CTC 이질성에 대한 보다 정확하고 확장 가능한 분석을 가능하게 함으로써 이 방법은 조기 암 진단, 치료 모니터링 및 전이에 대한 기계론적 연구를 개선하여 궁극적으로 정밀 종양학 분야를 발전시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

Introduction

종양 전이는 전파로 시작하여 원발성 종양 내의 종양 세포에 의한 휴면 및 집락화를 거치는 복잡하고 다단계 과정입니다. 이 세포는 기저막을 통해 점진적으로 더 깊은 조직으로 침입한 후 혈관이나 림프관으로 혈관 내 침입합니다. 일단 순환에 들어가면 이 세포는 순환 종양 세포(CTC)가 되어 먼 장기로 이동할 수 있습니다¹. CTC의 출현은 원격 전이의 씨앗 역할을 하기 때문에 전이성 캐스케이드에서 중요한 단계입니다¹. 최근 몇 년 동안 CTC 기반 액체생검 기술은 시술의 비침습적이고 편리한 특성과 실시간 동적 모니터링 기능 등의 장점으로 인해 상당한 주목을 받고 있습니다. 이 기술은 종양 생물학에 대한 정확하고 실시간이며 포괄적인 평가를 촉진하여 치료 효능 모니터링, 재발 예측 및 치료 안내에 고유한 이점을 제공합니다 ^2,3,4. 또한, 연구에 따르면 CTC는 초기 암, 조기 전이 또는 재발과 같은 낮은 종양 부담 단계에서도 말초 혈액에 존재합니다 ^5,6. 결과적으로, CTC 액체 생검은 영상으로 검출 가능한 고형 종양에 국한된 기존 조직 생검의 한계를 극복합니다⁷. 이는 조기 암 진단, 재발 및 전이 모니터링, 치료 지침은 물론 종양 시작, 진행 및 전이 메커니즘 해명을 위한 새로운 관점과 기술 지원을 제공합니다. 예를 들어, 말초 혈액의 CTC 수는 암 환자의 무진행 생존 및 전체 생존 모두에 대한 독립적인 예측 인자 역할을 하는 것으로 나타났으며, CTC 수가 높을수록 예후가 좋지 않음을 나타냅니다⁸. CTC 수의 동적 변화는 또한 치료 후 질병 진행 및 종양 부하와 밀접한 관련이 있습니다 ^9,10.

최근 연구에서는 CTC 분리를 위한 혁신적인 도구로 미세유체 기반 기술을 강조했습니다. 이러한 기술은 물리적 기반 접근 방식과 생물학적 기반 접근 방식으로 크게 분류될 수 있으며, 각각은 특정 과제에 직면하면서 뚜렷한 이점을 제공합니다. 물리적 기반 방법은 크기와 변형성의 차이를 사용하여 CTC를 분리하여 높은 처리량으로 라벨 없는 분류를 가능하게 합니다. 그러나 이러한 비특이적 분리 전략은 CTC의 고유한 이질성으로 인해 포획 효율과 순도를 모두 손상시킬 수 있습니다. 예를 들어, Lu et al. CTC 농축 및 정제 측면에서 대부분의 기존의 물리적 기반 기술을 능가하는 트랩 어레이와 초점 분리 및 속도 감소 설계를 통합한 미세유체 칩을 보고했습니다¹¹. 그럼에도 불구하고 이 칩은 백혈구(WBC)의 3-4 log 고갈만 달성했으며, 이는 임상 적용에는 여전히 불충분합니다. 반면, 면역친화성 기반 CTC 분리 전략은 일반적으로 더 높은 표적 세포 회수율과 순도를 제공합니다. 그러나 포획 분자와 CTC 사이의 결합 상호 작용은 종종 이러한 접근법의 처리량을 제한합니다^12,13. 따라서 희귀한 CTC 집단이 있는 임상 샘플을 효과적으로 처리하려면 높은 농축 효율과 처리량의 균형을 이루는 분리 방법이 필수적입니다.

더욱이, CTC 간의 상당한 이질성은 기존의 벌크 CTC 분석이 개별 세포 구별을 종종 모호하게 하기 때문에 다운스트림 분석^10,14,15에 중요한 문제를 제기합니다. 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)은 CTC 유전자 발현 이질성에 대한 포괄적인 분자 수준 특성화를 촉진하여 CTC의 분류, 상태 및 기능에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 기술은 정밀 종양학을 위한 새로운 접근 방식을 제공하고 종양 시작, 진행 및 전이 메커니즘에 대한 연구를 용이하게 합니다¹⁶. 예를 들어, Fan et al. 간세포 암종 환자의 다양한 혈관 부위로부터 단일 CTC 전사체 아틀라스를 구성하여 CTC 간의 공간적 이질성을 밝히고 면역 회피의 주요 매개체를 식별했습니다¹⁷. 동시에, Miyamotoet al. 전립선암 환자의 CTC에서 안드로겐 수용체 유전자 돌연변이와 스플라이스 변이를 확인하여 약물 내성의 기저에 있는 메커니즘을 밝혔습니다¹⁸.

그러나 단일 CTC 전사체 시퀀싱의 개발은 느리게 진행되고 있습니다. 기존 방법론은 자동화 및 통합에 결함이 있어 CTC 회수 효율성이 낮고 절차가 복잡하며 실험 성공률이 낮습니다¹⁹. 예를 들어, 현재 프로토콜에는 CTC 농축, 정제, 단일 세포 분리 및 핵산 증폭을 포함하는 순차적 프로세스가 필요합니다. 이러한 단계는 별도의 원심분리기 튜브에서 수행되므로 여러 피펫팅 및 이송 단계가 필요합니다. 노동 집약적인 절차는 효율성을 감소시킬 뿐만 아니라 CTC 손실 및 오염 위험을 증가시킵니다²⁰. 모세관 기반 세포 피킹과 같은 기존의 접근법은 단일 세포 분리 동안 처리량과 분석 효율성을 더욱 제한합니다²¹. 더욱이 전통적인 방법은 세포의 무작위 캡슐화를 설명하는 통계적 현상인 푸아송 분포에 의해 제약을 받습니다. 이로 인해 빈 액적의 비율이 높거나 물방울당 여러 세포가 발생하여 포획 효율이 제한됩니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 연구자들은 단일 세포 CTC 전사체 분석을 위한 통합 미세유체 칩을 개발했습니다. 이러한 플랫폼은 여러 단계를 단일 칩 워크플로우로 통합하여 오염 위험을 줄이고 분석 효율성을 향상시킵니다. 예를 들어, Euisik Yoon et al. 유체 역학 기반 크기 선택을 사용하여 CTC를 마이크로챔버로 분리하고 개별 CTC를 고유하게 바코드화된 마이크로비드와 효율적으로 페어링하는 Hydro-Seq 방법을 개발했습니다²². 이 접근 방식을 사용하면 여러 CTC에 대한 고처리량의 병렬 단일 세포 분석이 가능합니다. 그러나 이 방법은 크기 기반 CTC 분리에 의존하므로 CTC 순도가 낮고 처리량이 제한되는 경우가 많아 대용량 임상 샘플 처리에 적합하지 않습니다. 따라서 통합된 고처리량, 저용량 및 오염 방지 단일 세포 CTC 분석 시스템의 개발이 시급합니다.

여기에서는 CTC 분류, 정제 및 단일 세포 시퀀싱 칩의 세 가지 주요 구성 요소로 구성된 CTC 농축 및 단일 세포 시퀀싱을 위한 고처리량 및 효율적인 프로토콜을 설명합니다(그림 1). CTC 분류 미세유체 칩은 동적으로 조절되는 자기 포획력의 원리를 기반으로 설계되었습니다(그림 2A). 헤링본 구조 내에서 와류 혼합을 통해 고처리량 CTC 농축을 가능하게 할 뿐만 아니라 면역자기 비드에 의한 누적 포획을 가능하게 합니다. CTC의 비파괴 방출은 이후 자기장의 정밀한 변조를 통해 달성됩니다. 그런 다음 정제 칩을 사용하여 백혈구 항체 코팅 마이크로채널을 음성 선택에 사용하여 고도로 정제된 CTC를 생성합니다(그림 2B). 마지막으로, 차동 흐름 저항을 기반으로 하는 고효율 단일 셀 조작 플랫폼을 사용하여 푸아송 분포의 한계를 성공적으로 극복하고 효율적인 단일 셀/인코딩된 마이크로스피어 페어링 및 캡처를 가능하게 했습니다(그림 3A). 이는 마이크로비드 소비 및 시퀀싱 비용을 줄이면서 CTC의 활용도를 크게 향상시킵니다.

그림 1: 미세유체 기반 CTC 분류 및 단일 세포 시퀀싱 기술의 개략도. 이 워크플로는 종양 세포가 종양 병변에서 분리되어 혈류로 들어가 CTC를 형성하는 과정을 보여줍니다. CTC를 포함하는 말초 혈액 또는 백혈구 샘플은 CTC 캡처, 정제 및 scRNA-seq 칩을 통해 순차적으로 처리되어 궁극적으로 CTC의 전사체 시퀀싱 및 생물정보학 분석을 가능하게 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Protocol

1. 방법 1: 미세유체 기반 CTC 분리

1. 헤링본 칩(HB-chip) 제작
   1. 마스터 금형 준비
      1. 깨끗한 실리콘 웨이퍼를 준비하고 135°C에서 밤새 구워 수분을 제거합니다. 실온으로 냉각한 후 산소 플라즈마 클리너를 사용하여 150W에서 1분 동안 웨이퍼를 처리하여 표면을 활성화합니다.
      2. SU-8 포토레지스트를 사용하여 칩의 첫 번째 레이어를 패턴화하여 지지 기둥 배열(흐름 방향을 따라 #1에서 #28까지 번호가 매겨진 28열 × 7행)을 형성합니다. 스핀 코터를 500초 동안 10rpm, 55초 동안 2350rpm, 10초 동안 500rpm으로 순차적으로 작동하도록 설정합니다. 이 층의 높이가 50μm인지 확인합니다.
      3. 첫 번째 층을 65°C에서 1분 동안 부드럽게 구운 다음 95°C에서 20분 동안 부드럽게 구워 용매를 증발시킵니다. 실온으로 식히십시오.
      4. 해당 지지 기둥 디자인과 함께 포토마스크를 사용하여 첫 번째 레이어를 노출합니다. 노출량을 130mJ/^cm2로 설정합니다.
      5. 노출 후 65°C에서 1분 동안 베이킹한 다음 95°C에서 6분 동안 굽습니다.
      6. 냉각 후 SU-8 현상액을 웨이퍼 표면에 분배하여 가교되지 않은 포토레지스트를 제거하고 바닥층을 얻습니다. 30초 동안 웅덩이를 놔둔 다음 탈이온수로 헹굽니다.
      7. 1.1.1.2단계와 동일한 스핀 매개변수를 사용하여 첫 번째 레이어 위에 두 번째 SU-8 레이어를 스핀 코팅합니다. 두 번째 레이어를 패턴화하여 채널 벽에 대해 45° 각도로 헤링본 구조를 형성하며, 홈 너비는 100μm, 피치는 200μm, 사이클당 6개의 능선이 있습니다. 이 층의 높이도 50μm인지 확인하십시오.
         참고: 미세 구조 특징(지지 기둥 어레이 및 헤링본 홈 포함)의 모든 관련 치수를 보여주는 개략도가 보충 그림 1에 제공되었습니다.
      8. 첫 번째 층을 65°C에서 1분 동안 부드럽게 구운 다음 95°C에서 20분 동안 부드럽게 구워 용매를 증발시킵니다. 실온으로 식히십시오.
      9. 헤링본 디자인의 포토마스크를 사용하여 두 번째 레이어를 노출합니다. 노출량을 130mJ/^cm2로 설정합니다.
      10. 노출 후 65°C에서 1분 동안 베이킹한 다음 95°C에서 6분 동안 굽습니다.
      11. 냉각 후 SU-8 현상액을 사용하여 가교되지 않은 영역을 제거하고 완전한 2층 미세 구조를 드러냅니다.
   2. PDMS 복제본 준비
      1. 프리폴리머와 가교제를 10:1의 중량비로 결합하여 PDMS 혼합물을 제형화합니다. 단일 칩에 대해 10-15mL의 혼합물을 준비합니다.
      2. 혼합물을 마스터 몰드에 붓고 가스 제거를 통해 갇힌 공기를 제거합니다. 금형을 95°C의 오븐에 30분 동안 넣어 PDMS를 경화시킵니다.
      3. 경화된 PDMS 복제본을 금형에서 제거합니다. 직경 1mm의 PDMS 펀처를 사용하여 입구 1개와 출구 1개를 만듭니다.
   3. HB 칩 어셈블리
      1. 산소 플라즈마 클리너를 150W 전력으로 3분 동안 설정합니다. 깨끗한 유리 슬라이드에서 PDMS 복제본과 사전 접착된 PDMS 층을 모두 처리하여 표면을 활성화합니다.
         참고: PDMS 폴리머 사슬에 풍부한 Si-O 결합이 있기 때문에 플라즈마 활성화는 PDMS와 유리, 실리콘과 같은 기판 사이의 공유 결합을 가능하게 하여 칩 밀봉을 용이하게 합니다.
      2. 처리된 PDMS 구조를 정렬하고 단단히 접착합니다. HB 칩을 완성하기 위해 지지 기둥 어레이와 헤링본 기능이 유리 기판과 완전히 통합되었는지 확인합니다.
2. 면역자기 비드(IMB)의 준비
   1. 세척 및 재현탁된 스트렙타비딘 변형 마그네틱 비드(SA-MB)(1μm≈)(mL당 4× 4 10⁸ 개 비드) 25 μL를 실온에서 20rpm으로 회전시키면서 40분 동안 배양하여 IMB를 준비합니다.
   2. 마그네틱 랙에서 자기 분리 후 상청액을 제거하고 비드를 25μL의 분리 완충액(1% BSA, 2mM EDTA, D-PBS)에 재현탁합니다.
3. 절연 칩 작동
   1. 1-2초 이내에 20μL의 마그네틱 비드 현탁액을 피펫팅하여 기포가 유입되지 않도록 합니다.
   2. 즉시 칩을 자석 위에 수직으로 놓고 비드가 방해 없이 5분 동안 가라앉도록 합니다.
   3. 혈액 샘플(말초 혈액 또는 실험용 백혈구 샘플)을 채취하고 즉시 4mL를 주사기에 넣어 기포가 제거되도록 합니다. 기포를 제거하기 위해 칩의 입구와 출구를 액체로 밀봉하십시오. 샘플 입구 및 출구 튜브를 칩에 삽입합니다.
      알림: 생물학적 샘플을 취급할 때 기본적인 개인 보호 조치가 마련되어 있는지 확인하십시오.
   4. 주사기 펌프로 1.5mL/h의 유속으로 샘플을 주입합니다.
   5. 샘플 로딩 후 60μL의 D-PBS를 0.2mL/h의 유속으로 HB-칩에 주입하여 결합되지 않은 세포를 씻어냅니다.
   6. 자석을 제거하고 1.5mL의 BSA(D-PBS에서 5% w/v)를 수동으로 주입하여 칩을 세척하고 HB 칩에서 포획된 종양 세포를 방출합니다.

2. 방법 2: 미세유체 기반 CTC 정제

1. HB 칩 수정
   1. 부피 분율(v/v)이 10%인 에탄올에 (3-메르캅토프로필) 트리메톡시실란(MPTS) 용액을 준비합니다. 즉시 20μL의 MPTS 용액을 HB 칩에 도입하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
   2. 무수 에탄올로 한 번 헹구고 100°C에서 1시간 동안 건조시킵니다.
   3. 0.5mg/mL 농도의 에탄올에 N-γ-말레이이미도부티릴-옥시숙신이미드 에스테르(GMBS) 용액을 준비합니다. 칩을 37°C로 냉각하고 GMBS 용액을 도입한 후 실온에서 30분 동안 배양합니다.
      알림: MPTS 및 GMBS를 사용할 때는 항상 장갑, 실험실 가운 및 마스크를 착용하십시오. 이러한 시약은 독성 및 점막 자극 특성을 가지고 있으므로 환기가 잘 되는 곳에서 주의해서 취급해야 합니다.
   4. ddH₂O로 두 번 헹구고 D-PBS로 두 번 헹구십시오.
   5. 즉시 15μg/mL 스트렙타비딘(SA)을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
   6. D-PBS로 두 번 헹굽니다.
   7. CD45 항체 완충액을 준비합니다: 0.2%(w/v) BSA 및 20μg/mL 비오티닐화 CD45 항체, D-PBS로 부피까지 희석합니다.
   8. 백혈구의 음성 선택을 위해 20μL의 CD45 항체 완충액을 HB 칩에 주입합니다. 실온에서 1시간 동안 배양한 다음 D-PBS로 헹굽니다.
   9. 3%(w/v) BSA 및 0.05%(w/v) Tween-20을 포함하는 차단 용액을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 샘플을 로딩하기 전에 D-PBS로 헹굽니다.
2. 샘플 로딩
   1. 주사기를 사용하여 샘플을 흡인하여 기포가 제거되었는지 확인합니다. 기포를 제거하기 위해 칩의 입구와 출구를 액체로 밀봉하십시오. 샘플 입구 및 출구 튜브를 칩에 삽입합니다.
   2. 주사기 펌프로 샘플을 주입하고 유속을 0.6mL/h로 설정합니다.
   3. 계수 및 단일 세포 시퀀싱을 위해 배출구에서 정제된 종양 세포를 수집합니다.

3. 방법 3: 마이크로웰 기반 단일 셀 바코드 및 시퀀싱 기술

1. 시약 및 재료의 준비
   1. 칩 전처리
      1. 칩 입구에 200 μL의 1x D-PBS 및 0.5% F-68 용액을 추가합니다.
      2. 칩을 잡고 수조 초음파 처리를 수행합니다. 전체 미세 다공성 영역에서 기포가 보이면 30초 동안 초음파 처리를 계속하여 이중 우물에서 기포를 제거합니다.
   2. 바코드 비드 준비
      1. 바코드 마그네틱 비드의 원액을 완전히 혼합하고 200μL를 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 용액이 맑아질 때까지 자기 분리를 적용하고 상층액을 버립니다.
      2. 바코드 비드를 500μL의 TE-TW(10mM Tris-HCl pH = 8.0, 1mM EDTA, 0.01% Tween-20)로 두 번 세척합니다.
      3. 바코드 비드를 200μL의 20x TE(10mM Tris-HCl pH = 7.5, 1mM EDTA) 및 50mM DTT 용액에 세척하고 재현탁한 다음 얼음 위에 놓습니다.
   3. 단일 세포 현탁액의 제조
      1. 정제된 종양 세포를 1.5mL 원심분리기 튜브로 옮기고 실온에서 3 분 동안 400×g에서 원심분리합니다. 펠릿을 1mL의 1x D-PBS에 세척하고 재현탁합니다.
      2. 세포 계수를 수행하고 그에 따라 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 샘플 로딩 부피는 200μL여야 하며 총 80,000개의 세포(400개 세포/μL)가 있어야 합니다.
   4. 식염수 구연산나트륨(SSC) 1개, 0.5M LiCl, 0.6% Triton X-100, 10 mM EDTA, 5 mM DTT 및 1 U/μL RNase 억제제를 포함하는 세포 용해 완충액을 준비합니다.
2. 미세유체 칩 작동
   1. 세포 캡처
      1. 종양 세포 현탁액 200μL를 칩(듀얼 웰 60000개)에 주입한 다음 탈색 셰이커에서 5분 동안 10rpm으로 흔들어 세포가 중력에 의해 캡처 웰에 정착되도록 합니다.
      2. 칩의 세포 현탁액을 위아래로 두 번 부드럽게 피펫팅합니다. 그런 다음 칩을 탈색 셰이커에 10rpm에서 5분 동안 놓아 포획되지 않은 세포를 재현탁시키고 다시 침전시킵니다.
      3. 입구를 통해 200μL의 1x D-PBS 및 0.5% F-68 용액을 첨가하고 출구에서 용액을 흡인합니다. 칩을 총 세 번 세척하기 위해 두 번 반복합니다.
   2. 바코드 비드 캡처
      1. 바코드 비드 현탁액을 재현탁한 다음 즉시 200μL의 현탁액을 주입구를 통해 칩에 주입합니다. 10rpm에서 20초 동안 흔듭니다.
      2. 비드 현탁액을 부드럽게 두 번 피펫팅한 다음 10rpm에서 20초 동안 흔듭니다. 이 단계를 한 번 반복합니다.
      3. 배출구에서 바코드 비드 현탁액을 빼내고 200μL의 20x TE(pH = 7.5) 및 50mM DTT 용액을 첨가한 다음 배출구에서 액체를 빼냅니다. 이 단계를 두 번 반복하여 총 세 번 세탁합니다.
   3. 세포 용해 및 mRNA 포획
      1. 입구를 통해 칩에 200μL의 세포 용해 완충액을 천천히 추가합니다. 그 직후 200μL의 미네랄 오일을 천천히 첨가하여 이중 웰을 밀봉합니다.
         알림: 오염을 방지하기 위해 즉시 밀봉해야 합니다.
      2. 칩 배출구에서 폐기물 저장소로 흘러나오는 용액을 제거합니다. 칩을 수평으로 놓고 실온에서 5분 동안 그대로 둡니다.
   4. 바코드 비드 복구
      1. 용해 후 입구를 통해 200μL의 6x SSC를 천천히 첨가하고 폐액을 제거한 다음 칩 배출구에서 남은 용액을 흡인합니다.
      2. 칩을 채우기 위해 200μL의 6x SSC를 천천히 추가합니다. 자석을 칩 표면 가까이에 대고 입구에서 출구로 천천히 움직여 포집 웰에서 바코드 비드를 수집합니다. 그런 다음 칩에서 용액과 바코드 비드를 6x SSC가 미리 로드된 원심분리기 튜브로 빠르게 흡인합니다.
      3. 200μL의 6x SSC로 3회 세척한 다음 1x RT 완충액으로 1회 세척합니다( 재료 표 참조).
3. 역전사(RT), 엑소뉴클레아제 I 치료 및 PCR
   1. RT
      1. 1× RT 완충액, 1mM GTP, 1mM dNTP, 5% PEG 8000, 2.5μM 템플릿 스위치 올리고( 재료 표 참조), 1 U/μL RNase 억제제 및 10 U/μL 역전사 효소를 포함하는 100 μL의 역전사 반응 혼합물에 바코드 비드를 재현탁합니다. 용액을 42°C에서 120분 동안 배양합니다.
   2. 엑소뉴클레아제 치료
      1. 역전사 후, 200μL의 1x TE-SDS(10mM Tris-HCl pH = 8.0, 1mM EDTA, 0.5% SDS)로 비드를 한 번, 200μL의 1x TE-TW로 한 번, 200μL의 10mM Tris-HCl(pH = 8.0)으로 한 번 세척합니다.
      2. 1x 엑소뉴클레아제 I 완충액과 1 U/μL 엑소뉴클레아제 I을 포함하는 엑소뉴클레아제 혼합물 100μL에 비드를 재현탁하고 37°C에서 45분 동안 배양합니다.
   3. 두 번째 가닥 합성
      1. 200μL의 1x TE-SDS로 비드를 한 번 세척합니다. 비드를 200μL의 0.1M NaOH에 재현탁하고 실온에서 30rpm으로 회전하면서 5분 동안 배양하여 mRNA-cDNA 하이브리드 산물을 변성시킵니다. 그런 다음 200μL의 1x TE-TW로 한 번, 200μL의 10mM Tris-HCl(pH = 8.0)으로 한 번 비드를 세척합니다.
      2. 1x RT 완충액, 1mM dNTP, 5% PEG 8000, 0.5μM 두 번째 가닥 합성 프라이머( 재료 표 참조) 및 0.125U/μL의 Klenow 단편을 포함하는 반응 혼합물 100μL에 비드를 재현탁합니다. 용액을 37°C에서 60분 동안 배양합니다.
   4. cDNA 증폭
      1. 200μL의 1x TE-SDS로 한 번, 200μL의 1x TE-TW로 한 번, 200μL의 10mM Tris-HCl(pH = 8.0)으로 한 번 세척합니다.
      2. 1x PCR 반응 혼합물 및 0.8μM의 ISPCR 올리고를 포함한 150μL의 PCR 혼합물에 비드를 재현탁합니다( 재료 표 참조). PCR 프로그램을 다음과 같이 설정합니다: 95°C에서 3분; 20초 동안 98°C, 30초 동안 65°C, 3분 동안 72°C의 4주기; 20초 동안 98°C, 20초 동안 67°C, 3분 동안 72°C의 8사이클; 72°C에서 5분 동안
      3. 제조업체의 지침에 따라 DNA 정제를 위해 0.6x SPRI(Solid Phase Reversible Immobilization) 마그네틱 비드로 PCR 산물을 두 번 정제하고 20.5μL의 H₂O에서 용리합니다. 형광 기반 DNA 정량 분석을 사용하여 정제된 PCR 산물의 농도를 측정합니다.
      4. 1x PCR 반응 혼합물과 0.8μM의 ISPCR 올리고를 포함하는 PCR 혼합물을 사용하여 정제된 PCR 산물의 두 번째 증폭을 수행합니다( 재료 표 참조). PCR 프로그램을 다음과 같이 설정합니다: 98°C에서 3분 동안; 20초 동안 98°C, 20초 동안 67°C, 3분 동안 72°C의 5사이클; 72°C에서 5분 동안
      5. 제조업체의 지침에 따라 DNA 정제를 위해 0.6x SPRI 마그네틱 비드로 PCR 산물을 두 번 정제하고 20.5μL의 H₂O로 용리합니다. 형광 기반 DNA 정량 분석을 사용하여 정제된 PCR 산물의 농도를 측정합니다²³.
   5. cDNA 라이브러리 구축
      1. 제조업체의 지침에 따라 표준 DNA 라이브러리 준비 키트( 재료 표 참조)로 라이브러리를 구성합니다.
      2. 프라이머 쌍 N70X/P5를 사용하여 PCR로 라이브러리를 증폭합니다( 보충표 참조). PCR 프로그램을 다음과 같이 설정합니다: 72°C에서 3분 동안; 30초 동안 98°C; 15초 동안 98°C, 30초 동안 58°C, 3분 동안 72°C의 12사이클; 72°C에서 5분 동안
      3. 제조업체의 지침에 따라 DNA 정제를 위해 0.6x SPRI 마그네틱 비드로 라이브러리를 정제하고 20μL의 H₂O에서 용리합니다. 형광 기반 DNA 정량 분석을 사용하여 정제된 PCR 산물의 농도를 측정합니다.
         참고: 일반적으로 최종 DNA 라이브러리 농도는 ≥ 2ng/μL이고 총량은 ≥ 50ng로 허용되는 것으로 간주됩니다²⁴.

Results

CTC 캡처 인터페이스의 조립 및 해제는 현미경으로 평가할 수 있습니다. 자기장 아래 HB 칩 하단에 있는 마그네틱 비드(MB)의 균일한 분포는 성공적인 조립을 나타내는 반면, 잔류 MB가 최소화되거나 전혀 없으면 성공적인 방출을 확인합니다(그림 2C). 이 단계는 포획된 CTC의 수율과 순도를 결정하는 데 중요합니다. CTC 분리 칩의 캡처 효율을 검증하기 위해 스파이크인 실험을 수행했습니다. EpCAM 발현이 높은 소수의 종양 세포(PC3 또는 LNCaP)를 낮은 EpCAM 발현을 나타내는 많은 Jurkat 세포 집단을 포함하는 PBS에 스파이크하여 순환 중인 풍부한 혈액 세포의 존재를 시뮬레이션했습니다. CTC 분리 칩은 1mL 및 10mL 샘플 모두에서 종양 세포를 효율적으로 포착하여 높은 처리량과 효율적인 CTC 분류 기능을 입증했습니다(그림 2D). IMB 기반 포획의 특이성을 평가하기 위해 EpCAM 항체 접합이 없는 SA-MB로 변형된 대조군 칩을 사용했습니다. 유의미한 종양 세포 포획의 부재는 IMB 매개 CTC 분리의 특이성을 확인했습니다(그림 2D).

포집 효율성 외에도 순도는 CTC 분리 플랫폼을 평가하는 또 다른 중요한 매개변수입니다. 캡처 칩 또는 정제 칩 단독을 사용하여 분리된 종양 세포의 순도와 순차적 양성 및 음성 선택을 통해 달성된 순도를 비교했습니다(그림 2E). 두 칩 모두 대조군에 비해 종양 세포 순도를 크게 향상시켜 CTC 분리 효과를 입증했습니다. 더 중요한 것은 양성 선택과 음성 선택을 함께 사용하면 단일 방법을 사용하는 것에 비해 종양 세포의 순도와 수율이 더욱 향상되었다는 것입니다.

임상 환경에서 CTC 포획 및 분류 칩의 성능을 추가로 평가하기 위해 6명의 건강한 기증자로부터 말초 혈액(PB) 샘플을 수집하고 스파이크 실험을 수행했습니다. 임상 샘플에서 CTC의 풍부도가 극히 낮다는 점을 감안할 때, 약 500-1000개의 LNCaP 세포를 PB 샘플 10mL당 스파이크했습니다. 수집된 모든 PB 샘플의 WBC 수는 정상 범위(4-10 × 10⁶ cells/mL) 내에 있었습니다. 결과는 CTC 분류 시스템이 임상 샘플을 처리할 때에도 종양 세포의 높은 포획 효율과 순도를 유지한다는 것을 보여주었습니다(그림 2F-G 및 보충 그림 2).

그림 2: 헤링본 구조의 CTC 포획 및 정제 플랫폼. (A) CTC 분리 칩의 워크플로우. 첫째, 안정적인 자기장과 EpCAM 항체 접합 IMB가 캡처 인터페이스를 조립합니다. 다음으로, HB 칩 내의 와류 혼합은 CTC와 IMB 간의 물질 전달 효율을 향상시켜 축적된 포획을 촉진합니다. 마지막으로, 자기장을 제거함으로써 CTC의 부드러운 방출이 달성됩니다. (B) CTC 정제 칩의 워크플로. HB-칩은 음성 선택 항체로 변형되며, 소용돌이 혼합은 백혈구-항체 상호작용을 더욱 촉진하여 궁극적으로 고도로 정제된 CTC를 산출합니다. 스케일 바, 100μm. (C) 현미경 이미징은 캡처 칩의 성공적인 조립 및 방출을 보여줍니다. (D) 막대 플롯은 기능화되지 않은 SA-MB를 대조군으로 사용하여 다양한 샘플 부피에 걸쳐 분리 플랫폼의 CTC 포획 효율을 비교합니다. 오차 막대, 평균 ± SD, n = 3. (E) 막대 플롯은 단일 HB 칩만을 사용하여 얻은 CTC의 순도와 순차적 포획 및 정제를 거친 CTC의 순도를 비교합니다. 대조군은 처리되지 않은 CTC 순도를 나타냅니다. 오차 막대, 평균 ± SD, n=3. (F) CTC 분리 칩의 세포 식별. LNCaP 세포는 Hoechst 및 Calcein AM으로 염색되었고 혈액 세포는 Hoechst로만 염색되었습니다. 스케일 바, 100μm. (G) 1mL 또는 10mL의 말초 혈액을 사용한 스파이크 실험에서 종양 세포 순도 및 포획 효율. 오차 막대, 평균 ± SD, n = 3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

분리된 종양 세포는 이후 고처리량 단일 세포 시퀀싱을 거쳤습니다. 우리의 프로토콜은 60,000개의 중첩된 마이크로웰로 구성된 단일 셀 바코드 시스템을 통합합니다(그림 3A-B). 하부 정사각형 모양의 마이크로웰은 개별 세포를 캡처하는 역할을 하는 반면, 상부 마이크로웰은 비드 로딩을 위해 설계되었습니다. 각 하부 마이크로웰의 길이, 너비 및 높이는 25μm로 대부분의 세포 유형에 적합합니다. 상부 육각형 우물은 일반적으로 30 내지 50 μm 범위의 비드를 수용하기 위해 내접 된 원 직경과 높이가 50 μm입니다. 이 시스템은 크기 배제 마이크로웰을 통해 세포 이중선을 피하면서 누적 캡처를 기반으로 세포 포획 효율성을 향상시킵니다. 세포 로딩 프로토콜을 최적화하기 위해 다양한 세포 입력 조건에서 세포 포획 효율과 마이크로웰 점유율을 조사했습니다(그림 3C). 결과는 세포 입력을 증가시켜도 포획 효율이 감소하지 않는 것으로 나타났습니다. 오히려 점유율을 크게 향상시켰습니다. 60,000웰 캡처 칩의 경우, 마이크로웰 점유율은 셀 입력이 80,000에 도달했을 때 정체되었으며, 추가 입력으로 인해 더 이상 증가하지 않았습니다. 과도한 셀 로딩으로 인한 이중항의 발생을 최소화하기 위해 80,000개의 셀을 최적의 투입으로 선택했습니다. 그림 3D에서 볼 수 있듯이 단일 셀 바코드 칩은 85.6%의 셀과 95.7%의 바코드 비드 점유율을 달성하여 81.9%의 페어링률을 달성했습니다. 또한, 프로토콜에 따라 여러 번의 정착이 수행되었으며, 이는 누적 포획 효과를 통해 포획 효율과 페어링 속도를 크게 향상시켰다(그림 3D). 특히, 세포와 비드 사이의 점유율에서 관찰된 차이는 세포에 비해 비드의 밀도와 질량이 더 크기 때문에 중력 하에서 마이크로웰에 더 효율적으로 정착할 수 있습니다. 따라서 최적화된 적재 조건에서는 일반적으로 약 80%의 페어링 점유율이 이상적인 것으로 간주됩니다.

그림 3: Microwell 기반 고처리량 단일 셀 바코드 및 시퀀싱 기술. (A) 단일 CTC 시퀀싱 프로토콜의 워크플로. (B) 현미경 사본은 미세유체 단일 세포/바코드 비드 캡처 웰 구조를 보여줍니다. 세포 포획, 비드 포획 및 비드 회수 과정이 왼쪽에서 오른쪽으로 표시됩니다. 스케일 바 30 μm. (C) 라인 플롯은 다양한 셀 입력 조건에서 단일 셀 바코드 칩(60000 듀얼 웰)의 셀 포획 효율 및 마이크로웰 점유율을 보여줍니다. (D) 최적화된 세포 입력 조건에서 세포 및 바코드 비드의 점유율과 해당 세포-비드 쌍 비율. 왼쪽 및 오른쪽 패널은 각각 다중 정착 시도와 단일 정착만을 활용하는 캡처 접근 방식을 보여줍니다. 오차 막대, 평균 ± SD, n = 3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

마지막으로, CTC 분류 및 scRNA-seq를 위한 통합 프로토콜을 검증하기 위해 PC3, LNCaP 및 Jurkat 세포를 1:3:4000의 추정 비율로 혼합하고 종양 세포 캡처, 정제 및 단일 세포 시퀀싱을 위해 미세유체 칩에 로드했습니다. 효율적인 종양 세포 분리 플랫폼을 통해 고순도 EpCAM 양성 종양 세포를 얻었습니다(그림 4B). 동시에 미세유체 기반 scRNA-seq 칩은 t-SNE(Distributed Stochastic Neighbor Embedding) 분석을 통해 결과를 시각화하여 정밀한 세포 유형 프로파일링 기능을 입증했습니다(그림 4A). 우리는 세 가지 별개의 세포 집단을 성공적으로 식별했으며, 각 세포집단은 고유한 마커로 구별될 수 있습니다(그림 4C). 또한 최종 출력의 세포 비율은 정제된 입력의 비율과 거의 일치하여 단일 세포 바코드 프로세스가 편향되지 않고 오염이 없음을 확인했습니다(그림 4B). 하나의 클러스터는 TRBC1, IGLL1, CD1E 및 CD3D의 특정 발현을 기반으로 Jurkat 세포로 확인되었습니다(그림 4D). 경로 농축 분석은 이 분류의 견고성을 추가로 확인했습니다(그림 4E). 또한, 두 개의 전립선암 세포주는 차등적으로 발현된 유전자(DEG)에 따라 개별 클러스터로 뚜렷하게 분리되었습니다(그림 4F-G). PC3 클러스터는 PC3 분비 미세단백질이라고도 알려진 미세미노단백질(MSMP)의 높은 발현을 특징으로 합니다. 한편, LNCaP 클러스터는 NEDD4, CTNNA1(α-catenin 1) 및 RBBP7과 같은 세포 접착, 증식 및 다능성과 관련된 마커를 고유하게 발현했습니다.

그림 4: 스파이크인 실험을 사용한 CTC 분류 및 단일 세포 시퀀싱의 검증. (A) 포획 및 정제된 세포의 세포 유형 프로파일링을 보여주는 t-SNE 플롯. (B) 초기 입력, 정제 후 및 최종 시퀀싱 출력의 세 단계에서 세 가지 세포 유형의 비율을 나타내는 막대 플롯. (C) 서로 다른 세포 클러스터에 걸쳐 고유한 마커 유전자의 발현을 보여주는 도트 플롯. (D) 모든 세포에서 TRBC1, IGLL1, CD1E 및 CD3D의 발현 수준. (E) Jurkat 클러스터에서 차등적으로 발현된 유전자(DEG)의 GO 및 KEGG 경로 농축 분석. (F) 모든 세포에서 NEDD4 및 MSMP의 발현 패턴. (G) PC3와 LNCaP 클러스터 사이의 DEG를 보여주는 화산 플롯. 빨간색 점은 PC3에서 상향 조절된 유전자를 나타냅니다. 파란색 점은 LNCaP에서 상향 조절된 점을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

마스터 믹스	시약	최종 희석	버퍼 유형
0.5% F-68	F-68	0.50%	DEPC 처리수
	PBS	1×
테-TW	트리스-HCl(pH=8.0)	10 밀리미터	DEPC 처리수
	EDTA	1 밀리미터
	트윈-20	0.01%
20× TE(pH=7.5)	트리스-HCl(pH=7.5)	200 밀리미터	DEPC 처리수
	EDTA	20 밀리미터
TE-SDS	트리스-HCl(pH=8.0)	10 밀리미터	DEPC 처리수
	EDTA	1 밀리미터
	SDS	0.50%

표 1: 단일 CTC 시퀀싱 준비를 위한 시약 혼합물의 구성. scRNA-seq에 필요한 시약의 일부가 표시되어 있으며, 빠르고 원활한 프로세스를 보장하기 위해 칩 작동 전에 준비할 수 있습니다.

보충 그림 1: HB 칩을 위한 설계. (A) 2층 미세유체 구조의 개략도. 상단: 헤링본 구조가 특징인 최상층. 확대된 삽입물은 채널 벽에 대해 45° 각도로 방향이 지정되고 홈 너비가 100μm이고 피치가 200μm인 헤링본의 상세한 형상을 보여줍니다. 하단: 흐름 방향을 따라 #1에서 #28까지 번호가 매겨진 지지 기둥 어레이(28열 × 7행)로 구성된 하단 레이어. (B) 헤링본 칩의 측면도. 헤링본 홈의 너비는 100μm입니다. 헤링본 구조와 지지 기둥의 높이는 모두 50μm입니다. (C) 헤링본 칩의 평면도. 각 지지대는 너비가 500μm, 길이가 1150μm이며 인접한 기둥 사이에는 550μm의 간격이 있습니다. (D) 조작된 HB 칩의 사진. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: CTC 분리 칩의 출구에서 수집된 폐액에 존재하는 형광 염색된 종양 세포 및 혈액 세포를 보여주는 대표 이미지. LNCaP 세포는 Hoechst 및 Calcein AM으로 염색되었고 혈액 세포는 Hoechst로만 염색되었습니다. 스케일 바 100 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충표: 역전사 및 라이브러리 준비에 사용되는 올리고뉴클레오티드 서열 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

CTC는 암 진단, 치료 지침 및 종양 시작, 진행 및 전이에 대한 연구를 위한 귀중한 바이오마커 역할을 합니다²⁵. 그러나 기존의 CTC 분리 방법은 고효율과 높은 처리량을 모두 달성하지 못합니다²⁶. 또한 CTC의 낮은 방출 효율은 종종 낮은 순도와 높은 세포 손상을 초래하여 다운스트림 분석과의 호환성을 제한합니다²⁷. 여기에서 우리는 CTC 캡처, 정제 및 scRNA-seq의 세 가지 주요 절차로 구성된 고처리량 CTC 분류 및 단일 CTC 시퀀싱을 위한 통합 프로토콜을 제안했습니다.

이 미세 유체 기반 플랫폼은 유연성과 확장성을 제공합니다. HB 칩의 병렬 채널 수와 바코드 칩의 캡처 웰은 다양한 샘플 요구 사항에 따라 조정할 수 있으므로 높은 처리량 요구 사항을 충족할 수 있습니다. CTC 캡처 칩에서는 특정 암 유형에 따라 IMB를 최적화할 수 있습니다. 예를 들어, 전립선암 환자의 샘플에서 IMB는 EpCAM 및 PSMA 항체의 칵테일로 기능화되어 포획 효율성을 향상시킬 수 있습니다. 더욱이, EpCAM 기반 포획에만 의존하면 상피-중간엽 전이(EMT)를 겪은 중간엽 CTC가 손실될 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 열충격 단백질 70(HSP-70) 또는 세포 표면 비멘틴(CSV)에 대한 추가 항체를 통합하여 다양한 EMT 단계에서 CTC를 포획할 수 있습니다.

CTC 포획 및 정제를 위한 HB 칩은 미세유체 기반이므로 실험 중에는 주의 깊은 취급이 필수적입니다. 칩 입구에 시약을 도입하기 전에 모든 기포를 제거해야 하며 입구와 출구를 모두 밀봉하여 갇힌 공기를 제거할 수 있습니다. 또한 갇힌 기포가 IMB와 세포의 통과를 방해하여 포획 효율과 순도를 크게 감소시킬 수 있으므로 시약을 신속하게(1-2초 이내) 도입해야 합니다. 또한 앞서 언급했듯이 성공적인 CTC 포획을 위해서는 IMB의 균일한 분포가 중요합니다. IMB를 로드한 후 자기장의 변화로 인해 IMB 분포가 방해되는 것을 방지하기 위해 칩을 자석에 수직으로 놓고 최소 5분 동안 제자리에 고정해야 합니다. 특히, 프로토콜에 지정된 세포 로딩 유량은 다양한 샘플 유형에 따라 최적화되어야 합니다. 예를 들어, 백혈구 샘플은 높은 수준의 백혈구 농도와 점도를 나타냅니다. 유속이 너무 빠르면 CTC와 IMB 간의 효율적인 상호 작용을 방해하여 축적된 자기 포획을 방지하여 CTC 순도를 감소시킬 수 있습니다. 임상 혈액 샘플 처리에서 CTC 분리 및 정제 플랫폼의 성능을 평가하기 위해 여러 건강한 기증자로부터 PB를 수집하고 소수의 LNCaP 세포(mL당 약 50-100개 세포)를 샘플에 스파이크했습니다. 특히, 플랫폼은 PB 샘플에서 종양 세포에 대해 높은 포획 효율과 순도를 나타냈지만 그 성능은 PBS 기반 세포 샘플에서 관찰된 것보다 약간 낮았습니다(그림 2D, 그림 2E 및 그림 2G). 이러한 불일치는 PBS에 비해 혈액의 점도가 높고 적혈구와 혈소판이 풍부하기 때문이라고 추측합니다. 따라서 임상 혈액 샘플을 취급할 때 적혈구 용해 또는 PBMC 추출과 같은 전처리 단계를 고려하여 성능을 향상시킬 수 있습니다.

HB 칩과 유사하게 미세유체 기반 단일 셀 바코드 칩은 기포 형성을 방지하기 위해 조심스럽게 취급해야 합니다. 관련된 시약의 다양성을 감안할 때 일부 시약은 칩 작업을 시작하기 전에 미리 준비할 수 있습니다(표 1). 셀과 비드를 로딩할 때 셀은 밀도가 낮고 바코드 비드는 밀도가 높기 때문에 균일한 분포를 보장하기 위해 주입 속도를 신중하게 제어해야 합니다. 일반적으로 세포 현탁액은 3~5초에 걸쳐 천천히 첨가한 후 1~2초 이내에 비드 현탁액을 빠르게 첨가해야 합니다. 셀과 비드를 로드한 후 두 차례의 흡인 및 분배를 수행한 다음 칩을 셰이커에 올려 누적 캡처 프로세스를 완료합니다. 이 단계는 점유율과 페어링률을 개선하는 데 매우 중요합니다. 세포 용해 중에 오일 밀봉 방법을 사용하여 마이크로웰 표면을 분리하여 웰 간의 교차 오염을 방지합니다. 특히, 미네랄 오일은 용해 직후 지체 없이 첨가해야 합니다. 용해 후 높은 비드 회수율을 보장하기 위해 자석을 입구에서 출구로 천천히 움직여 바코드 비드 회수를 수행합니다. 필요한 경우 이 단계를 여러 번 반복할 수 있습니다. 마지막으로, 원심분리기 튜브에서 회수된 자기 비드는 RT, 2차 가닥 합성, PCR 증폭 및 라이브러리 구성을 거친 후 차세대 시퀀싱(NGS)을 거칩니다.

이 통합 미세유체 플랫폼은 임상 응용 분야에 상당한 잠재력을 가지고 있습니다. CTC 분리의 효율성과 처리량을 향상시킴으로써 종양 부하가 낮은 단계에서 CTC 검출을 증가시켜 CTC 수를 종양 병기 결정과 연결하는 분류 모델을 확립할 수 있습니다. 이러한 발전은 암 진단, 치료 모니터링, 예후 평가 및 재발 예측을 위한 새로운 접근 방식을 제공합니다. 또한 CTC의 단일 세포 전사체 분석을 통해 필수 유전자 경로, 상호 작용 네트워크 및 바이오마커 유전자를 포함한 주요 분자 특징을 식별할 수 있습니다. 이 분석은 초기 암 전이를 유발하는 중요한 요인에 대한 통찰력을 제공하고 전이성 병변 형성의 기저에 있는 분자 메커니즘을 밝혀 재발성 또는 전이성 암 환자에게 잠재적인 치료 표적을 제공합니다. 또한 이 플랫폼은 확장성이 뛰어납니다. 특정 분석 요구 사항을 충족하도록 조정할 수 있으며, 전사체학 및 유전체학을 포함한 다중 오믹스 분석을 지원하도록 확장될 수 있습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-머카토프로필) 트리메톡시실란	시그마 올드리치	175617-100G	MPTS 해법
20번, SSC 버퍼	상곤 바이오텍	B548109-0200
5× RT 버퍼	상곤 바이오텍	B610020-0500
비오틴화 CD45 단클론 항체	e바이오사이언스	13-0459-82	2°에 저장; C에서 8도까지; 참고;
비오티닐화 EpCAM 단클론 항체	e바이오사이언스	13-9326-82	2°에 저장; C에서 8도까지; 참고;
소 혈청 알부민 (BSA)	상곤 바이오텍	A600332-0100	2°에 저장; C에서 8도까지; 참고;
디코더 카트리지 칩	동적 생태계	2203106	2°에 저장; C에서 8도까지; 참고;
디코더 카트리지 시약 키트	동적 생태계	2203206	2°에 저장; C에서 8도까지; 참고;
DEPC 처리수	상곤 바이오텍	B501005-0500
D-PBS	상곤 바이오텍	E607009-0500	함량: NaCl 136.89mM; KCl 2.67 mM; Na2HPO4 8.10 mM; KH2PO4 1.47 mM. pH=7.2-7.4
DTT	써모 사이언티픽	R0861	2°에 저장; C에서 8도까지; 참고;
다이나비즈 마이원 SA T1	인비트로젠	65602	SA-MBs, 1 및 mu; m
EDTA	상곤 바이오텍	B540625-0500	0.5 M, pH=8.0
KAPA 하이파이 핫스타트 레디믹스	로슈	KK2601	2× PCR 반응 혼합물
염화 리튬 강전.	인비트로젠	AM9480	0.2 & 마이크로; M 필터링
N-&감마;-말레이미도부티릴-옥시신니마이드 에스터	써모 사이언티픽	22309	GMBS 솔루션
플루로닉 F-68	상곤 바이오텍	A600749-0025
큐비트 1× dsDNA HS 분석 키트	써모 사이언티픽	Q33231
SDS 솔루션	상곤 바이오텍	B648118-0100	SDS 10%
스트렙타비딘	시그마 올드리치	189730	2°에 저장; C에서 8도까지; 참고;
SU-8 포토레지스트	미세화학	SU-8 3050
SYLGARD 184 실리콘 엘라스토머 키트	다우 코닝	4019862
트리스-HCl (pH 7.5)	리젠	NR0072	1 mol/L, pH=7.5, RNase 자유
트리스-HCl (pH 8.0)	리젠	NR0073	1 mol/L, pH=8.0, 자유 Rnase
트리톤 X-100	상곤 바이오텍	A600198-0500
Trueprep DNA 라이브러리 준비 키트 V2 Illumina	바지임	TD502	DNA 라이브러리 준비 키트
트윈-20	상곤 바이오텍	A600560-0500
VAHTS DNA 클린 비즈	바지임	N411	DNA 정제를 위한 고상 가역적 고정(SPRI) 자기 구슬