중적외선 현미경 유도 질량 분석 이미징을 사용한 다중 모드 공간 대사체학

요약

우리는 공간적으로 분해된 대사 및 생화학적 분석을 위해 동일한 조직 절편에 질량 분석 이미징(MSI)과 중적외선(MIR) 이미징을 통합하는 다중 모드 공간 대사체학 워크플로를 제시합니다.

초록

공간 대사체학은 조직, 기관, 심지어 단일 세포 내에서 대사산물의 분포를 매핑하기 위해 빠르게 발전하는 분야입니다. 이 접근 방식은 생물학적 시스템의 생화학적 이질성을 이해하는 데 중요한 맥락 대사 정보를 제공합니다. 중적외선(MIR) 이미징 및 질량 분석 이미징(MSI)은 공간 대사체학을 위한 강력한 접근 방식으로 등장했으며 각각 고유하고 보완적인 이점을 제공합니다. 이 연구에서는 실험 절차, 이미징 공동 등록, 데이터 통합 및 생물정보학 분석을 포함하여 동일한 조직 절편에서 MIR 이미징 및 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 MSI(MALDI-MSI)를 수행하기 위한 워크플로를 제시합니다. MIR 이미징은 업스트림 양식으로 사용되어 조직의 비파괴 생화학적 분석을 허용합니다. 그 후, MIR 이미징에서 얻은 공간 정보에 따라 MALDI-MSI용 조직에 매트릭스가 증착됩니다. 이미지는 공동 등록 후 통합되어 Seurat와 같은 고급 생물정보학 도구를 사용하여 다중 모드 공간 대사체학 분석을 가능하게 합니다. MIR 이미징과 MSI의 통합은 공간 대사체학의 혁신적인 발전을 나타내며, 건강과 질병 모두에서 대사 과정의 공간적, 화학적 복잡성을 탐구할 수 있는 전례 없는 기회를 제공합니다. 이러한 다중 모드 접근 방식은 바이오마커 발견, 질병 진단 및 치료법 개발 분야의 혁신을 주도할 수 있는 상당한 잠재력을 가지고 있습니다.

서론

공간 대사체학은 질량 분석 이미징(MSI) 또는 기타 공간적으로 분해된 기술을 대사 분석과 통합하여 대사 분석과 통합하여 대사 산물을 기본 조직 맥락 내에서 매핑하는 것을 포함하며, 조직하, 세포 또는 세포 내 해상도에서 대사에 대한 통찰력을 제공합니다 1,2,3,4,5,6,7,8 . 이러한 이미징 기법 중에서 중적외선(MIR) 현미경은 분자 진동 대비 4,7,9,10,11,12를 기반으로 생체 분자를 화학적으로 매핑하는 능력으로 인해 점점 더 주목을 받고 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜은 푸단대학교 실험동물자원센터의 기관동물관리이용위원회(IACUC)가 승인한 동물실험프로토콜(DSF-2024-004)에 따라 수행됐다.

참고: 이 연구는 동일한 조직 절편에서 MIR 이미징 및 MALDI-MSI를 수행하기 위한 워크플로를 제공합니다. 이 통합 접근 방식에는 실험 절차, 이미지 공동 등록, 데이터 융합 및 다운스트림 생물정보학 분석이 포함됩니다(그림 1C). MIR 이미징은 업스트림 양식으로 활용되어 조직의 비파괴적이고 라벨이 없는 생화학적 매핑을 가능하게 합니다. MIR 이미징의 공간 정보에 따라 MALDI-MSI 획득을 위해 매트릭스가 적용됩니다. 정확한 공동 등록 후 데이터 세트는 다변량 공동 분석을 위해 통합되며(그림 4), 고급 계산 도구를 통해 포괄적인 공간 대사체학을 가능하게 합니다.

1. 샘플 준비

1. 조직 샘플 준비
   1. 마우스 조직 수집
      1. 특정 병원체 없는(SPF) 조건에서 C57BL/6J 마우스(20주령, 4....

결과

위에서 설명한 다중 모드 공간 대사체학 전략을 검증하기 위해 암의 마우스 모델에서 구현했습니다. 종양 세포는 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하도록 유전자 변형되어 형광 이미징을 통해 종양 부위의 정확한 위치 파악이 가능했습니다. 그림 2A는 "지문 영역"으로 알려진 950-1800cm-1의 스펙트럼 범위를 가진 무표지 QCL-MIR 이미징 결과를 보여줍니다. 대표적인 MIR 밴드는 P=O 스트레칭 (1240 ^cm-1, 핵산 및 인산염 지질), Amide II (1550 ^cm-1, 단백질), Amide I (1650 ^cm-1, 단백질) 및 에스테르 C=O 스트레칭 (1740 ^cm-1, 글리세로지질)과 같은 도 2A에 표시된다.

GFP 형광 신호는 종양 영역의 공간적 대응을 평가.......

토론

여기에서는 MSI와 MIR 이미징을 통합하여 동일한 표본에 대해 고처리량, 분자 특이적 대사 프로파일링을 가능하게 하는 다중 모드 공간 대사체학 전략을 제시합니다. MIR 이미징은 분자 진동을 기반으로 라벨이 없는 비파괴 화학 매핑을 가능하게 하여 상세한 구조 및 작용기 정보를 제공합니다. 대조적으로, MSI는 대사산물 식별 및 정량화에 대한 높은 민감도와 특이성을 제공하여 대사체학 연구의 초석으로 자리매김했습니다. 이 두 가지 양식을 통합함으로써 MIR 이미징의 화학적 특이성과 MSI의 분자 정밀도의 상호 보완적인 강점을 활용하여 대사 이질성에 대한 보다 포괄적인 이해를 제공할 수 있습니다.

제안된 다중 모드 플랫폼의 주요 이점은 표적 MSI 획득을 위해 공간적으로 분해된 관심 영역(ROI) 식별을 수행할 수 있다는 것입니다. 고처리량 MIR 이미징은 ROI 선택을 안내하는 신속하고 라벨이 없는 비침습적 양식 역할을 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
4% 파라포름알데히드, 조직 고정액	Sangon Biotech	E672002
소 혈청 알부	민 Sigma Aldrich	126615
C57BL/6JNifdc 마우스	Charles River	219
CaF2 슬라이드	Crystran	CAFP25-1
Cryostat 마이크로톰	Dakewe Biotech	CT520
Cytospec	Peter Lasch	버전 2.10.01	기준선 보정, 정규화, 이미지 생성 및 초분광 분석을 포함한 MIR 데이터 분석을 위한 소프트웨어입니다.
DPBS 버퍼	피셔 사이언티픽	14-190-250
태아 소 혈청	Gibco	10270106
동결 건조기	LABCONCO	FreeZone
젤라틴	Sigma-Aldrich	G1890	Type A, 돼지 피부
HBSS 완충액	Sangon Biotech	에서 추출; A003210
고포도당 DMEM	ThermoFisher Scientific	10564011
기준선 보정, 정규화, 이미지 생성 및 초분광 분석을 포함한 MIR 데이터 분석을 위한	Matlab	MathWorks	Matlab R2024a
매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 질량 분석 이미징(MALDI-MSI) 시스템	Bruker Daltonics GmbH	timsTOF fleX MALDI-2
메탄올	시노팜 화학 시약	10014108
mMass	충학 연구소, 체코 과학 아카데미 생물학 센터, 체코 공화국	버전 5.5.0	MSI 데이터 분석용 소프트웨어. 전처리를 위해 원시 MSI 데이터를 SCILS Lab으로 가져옵니다.  상대 강도 0.01%> mMass 단위로 피크 피킹을 수행합니다.
N-(1-나프틸) 에틸렌디아민 디하이드로클로라이드(NEDC) 매트릭스	시그마 알드리치	222488
페니실린-스트렙토마이신	써모피셔 사이언티픽	15140122
양자 캐스케이드 레이저  중적외선(QCL-MIR) 현미경	Bruker Optics GmbH	LUMOS II ILIM
적린	Sigma-Aldrich	8.0727
SCiLS Lab	Bruker Daltonics	SCiLS Lab 2024b	MSI 데이터 분석용 소프트웨어. 전처리를 위해 원시 MSI 데이터를 SCILS Lab으로 가져옵니다.  상대 강도 0.01%> mMass 단위로 피크 피킹을 수행합니다.
분무기	HTX Technologies	TM
트립신, 0.25% EDTA	ThermoFisher Scientific	C25200072

소프트웨어입니다. 곤