방법 논문

키메라 항원 수용체-세포외 소포(CAR-EV) 기술 강화: 암 치료의 미래

DOI:

10.3791/68726

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2025년 9월 19일

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1INOVIQ Ltd., 2Centre for Clinical Research, Faculty of Medicine, The University of Queensland

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포외 소포(EV)의 치료적 적용은 암 치료 및 약물 전달에 혁명을 일으킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 분리된 키메라 항원 수용체(CAR) 세포 유래 EV(CAR-EV)는 화물 용량이 증가하여 기능적 효능을 크게 향상시킵니다. 이 연구는 생물학적 활성과 치료 가능성을 밝히기 위해 CAR-EV를 추가로 특성화합니다.

초록

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CAR 세포 치료법은 여러 혈액 악성 종양에 대한 맞춤형 치료를 크게 발전시켰습니다. 현재 림프종, 다발성 골수종 및 만성 림프구성 백혈병 치료를 위해 7개의 CAR-세포 제품이 식품의약국(FDA)의 승인을 받았고 6개의 유럽 의약품청(EMA)의 승인을 받았습니다. 사이토카인 방출 증후군(CRS)과 면역 이펙터 세포 관련 신경독성 증후군(ICANS)이 가장 중요한 몇 가지 과제와 한계가 남아 있습니다. CAR-EV와 같은 무세포 치료법은 세포 요법에 비해 실질적인 이점을 제공합니다. 여기에는 CRS, ICANS 및 기타 부작용의 위험을 최소화하면서 향상된 종양 침윤 및 반복 투여 가능성이 포함됩니다. 또한 CAR-EV의 효능은 세포독성제와 기능 변형 리보핵산(RNA)을 포함하도록 설계하여 조정할 수 있습니다. 여기에서는 조정 가능한 CAR-EV 생산을 위한 확장 가능한 CAR-EV 플랫폼 개발에 대해 보고합니다. 이 플랫폼에는 EV 생산자 세포(예: CAR-T 및 CAR-자연 살해(CAR-NK) 세포)의 엔지니어링 및 사전 컨디셔닝, GMP(Good Manufacturing Practice) 등급 이온 교환 크로마토그래피(IEX) 플랫폼을 사용한 CAR-EV의 분리 및 농축, 완전 자동화된 고처리량 EV 하위 집단 분석 및 시험관 내 분석이 포함됩니다 CAR-EV 기능적 세포독성 활성 평가. 이 플랫폼은 혈액 및 고형 종양 세포주 모두에 대해 CAR-NK-EV 및 CAR-T-EV를 사용하여 검증되었습니다. CAR-EV 플랫폼은 CAR 세포 기반 치료법과 관련된 부작용을 줄일 수 있는 잠재력을 지닌 특정 질병 적응증에 맞는 기성 치료용 CAR-EV의 신속한 개발을 위한 유망한 접근 방식을 나타냅니다.

서론

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CAR 세포 기반 치료법은 혈액 악성 종양 치료용으로 승인되었지만 상당한 과제와 한계가 남아 있습니다1. 특히, CRS 및 ICANS의 위험은 CAR 치료에 대한 환자의 적합성을 평가할 때 여전히 중요한 요소로 남아 있으며, 이는 치료 전략의 지속적인 발전의 필요성을 강조합니다2.

CAR 세포에서 파생된 EV(CAR-EV)는 보다 효과적이고 잠재적으로 안전한 동종 치료 옵션으로 부상했습니다. 이러한 EV는 면역원성 감소, CRS 위험 감소, 종양 침윤 강화, 반복 투여 적합성, 병용 요법 가능성, 효율적인 생산 및보관 공정 등 여러 가지 이점을 제공합니다3. 생물학적으로 유래된 EV는 암세포의 특정 표면 수용체에 높은 친화력으로 결합하는 암 표적 분자를 발현하도록 조작될 수 있습니다. 일단 수정되면 이러한 디자이너 EV는 표적 이탈 효과를 최소화할 수 있는 잠재력과 함께 치료용 화물을 선택적으로 전달할 수 있는 유망한 전략을 제시합니다. CAR 세포에서 파생된 이러한 무기화된 EV는 보다 정확하고 강력한 치료 전달을 가능하게 하는 향상된 기능적 특성을 나타냅니다. 이들의 고유한 기능은 치료 효능 향상에 종합적으로 기여하는 여러 가지 이점을 제공합니다.

클리닉에서 EV를 효과적으로 사용하는 데 있어 두 가지 주요 장애물은 규모와 효율성입니다. 본원에 기술된 방법론은 고유한 확장성을 나타내며 광범위한 실험 패러다임에 걸쳐 쉽게 적응할 수 있습니다. EV 생산을 임상 등급 제조로 확대하는 것은 활발히 개발 중인 분야이지만 충분한 양의 임상 등급 재료를 생산하려면 추가 최적화가 필요합니다4. 중요한 것은 최근 연구에서 인터루킨(예: IL-7, IL-15, IL-21)으로 모세포를 전처리하고 저산소(1-2% O2) 조건에서 EV를 생성하는 것과 같은 EV 효능을 개선하기 위한 유망한 접근 방식을 입증했다는 것입니다 5,6,7.

이 연구의 목적은 MCF-7 유방암 세포와 K562 골수성 백혈병 세포를 사용하여 시험관 내에서 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 및 인간 표적 CAR EV의 치료 가능성을 조사하는 것이었습니다. EV는 IEX 를 통해 CAR 세포 조절 배지(CM)에서 분리 및 농축되었으며, 나노입자 추적 및 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 특성화되었으며 기능적 분석을 수행했습니다. 내인성 세포독성 화물을 포함하는 CAR EV는 시험관 내에서 세포 사멸을 효과적으로 유도했습니다. 얻은 데이터는 치료 응용 분야를 위한 확장 가능한 표적 EV 생산의 타당성을 확립합니다.

프로토콜

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알림: 적절한 PPE(예: 장갑, 실험실 가운)를 사용하여 인증된 생물안전 레벨 2(BSL-2) 캐비닛 내의 모든 살아있는 세포를 취급하십시오. 살아있는 세포를 함유한 세포 펠릿과 같은 생물학적 위험 물질은 최종 10% 차아염소산나트륨(표백제) 용액을 사용하여 오염을 제거해야 합니다.

1. 세포 배양 및 CM 수집

  1. CAR 세포 배양
    참고: 이 연구에 사용된 렌티바이러스 형질도입 CAR 세포는 아웃소싱되었지만 프로토콜은 표준 세포 공학 기술을 통해 사내에서 생성된 CAR-T/NK 세포에 여전히 적용 가능합니다.
    1. 37°C(5% CO2, 21% O2)의 가습 챔버에서 0.5-1 x 106/mL의 밀도로 이종 없는 배양(100 IU/mL IL-2가 보충된 성장 배지)에서 CAR NK/T 세포를 유지합니다. 2-3일마다 모니터링하고 계대 용량 제약으로 인해 세포 수를 매주 3회로 제한합니다.
    2. 현미경을 통해 CAR 발현을 확인하고 세포가 형광을 띠는지 확인합니다(적절하게 태그가 지정된 경우). 건강한 덩어리의 세포는 강력한 CAR 세포 배양을 나타냅니다.
  2. CM 컬렉션
    1. 세포 배양이 80% 합류에 도달하면 Trypan blue 자동 세포 계수 분석을 통해 세포 생존력을 평가하고 살아있는 세포 밀도를 결정합니다.
    2. 세포를 300× g(실 온)에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿을 형성합니다.
    3. 상청액을 조심스럽게 수집하고 3,000 × g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 정화합니다.
    4. EV 농축이 준비될 때까지 정화된 CM을 -80°C에서 보관합니다.

2. EV 격리 및 농축

참고: 다음 방법은 세포외 소포(EV) 농축을 위한 두 가지 접근법, 즉 기능적 시험관 내 분석을 위한 EV 분리를 위해 개발된 IEX 방법과 다운스트림 특성화 연구에 최적화된 팬-엑소좀 캡처 고처리량 방법을 간략하게 설명합니다.

  1. IEX 를 통한 기능성 CAR EV 강화
    참고: 모든 체적 사양은 크로마토그래피 컬럼 내의 시약 부피와 수지 베드 부피 사이의 비례 관계를 반영하는 컬럼 부피(CV)로 표시됩니다.
    1. IEX 컬럼(사용된 컬럼에 대한 자세한 내용은 재료 표 참조)을 사용하기 전에 15분 동안 그대로 두어 실온(RT)으로 가져옵니다. 10 CV의 재생 완충액을 첨가한 다음 10 CV 등장 평형 완충액(pH 7.4에서)을 사용하여 평형화합니다(완충액에 대한 자세한 내용은 재료 표 참조).
      알림: 컬럼을 장기간 건조시키지 마십시오. 항상 기둥을 똑바로 세우십시오.
    2. CM을 해동하고 0.22μm 폴리에테르설폰(PES) 필터를 통과시킵니다.
    3. 샘플을 평형 컬럼(최대 31.2 CV)에 추가한 다음 10 CV의 등장성 세척 완충액(pH 7.4에서)을 추가합니다. 2.5 CV의 고장성 용출 완충액( 재료 표 참조)을 추가하고 EV 용출액 샘플이므로 통과 흐름을 수집합니다.
    4. 시중에서 판매되는 한외여과 원심 필터(30kDa 컷오프)와 등장성 용액을 희석제로 사용하여 EV 용출액에 대한 완충액 교환을 수행하여 최소 희석 계수 100배를 보장합니다. 완충액 교환 후 목표 부피는 실험 매개변수에 맞게 사용자가 결정할 수 있습니다.
    5. 0.22μm 필터를 사용하여 최종 여과 단계를 수행하여 시험관 내 기능 분석을 위해 농축된 EV를 멸균합니다.
    6. 나노입자 추적 분석(NTA)8,9를 사용하여 CAR-EV 크기 분포, 농도 및 수율을 결정합니다.
  2. 제한된 또는 대규모 샘플 배열의 특성화를 위한 고처리량 팬-엑소좀 EV 분리(실온(RT)에서 수행됨)10,11.
    1. 웰당 1mL의 1x PBS로 3개의 96 딥웰(DW) 플레이트를 준비합니다.
    2. 각 웰에 35μL의 1% 도데실 황산나트륨(SDS) 완충액을 첨가하여 '용출' 플레이트를 만듭니다.
    3. 웰당 1mL의 CM 샘플과 30μL의 EXO-NET 판 엑소좀 캡처 비드를 포함하는 '결합' 플레이트를 준비합니다.
    4. 자동 격리 시스템에서 다음 설정을 지정합니다.
      1. 1단계: 픽업 팁: 분리 프로세스 전반에 걸쳐 마그네틱 비드 조작을 가능하게 하기 위해 기기가 96-깊이 웰 팁 빗을 연결하는 것으로 분리 프로토콜이 시작되는지 확인합니다.
      2. 2단계: 자성 입자에 EV를 효율적으로 포획할 수 있도록 CM 샘플과 마그네틱 비드가 30분 동안 연속 저속 조건에서 혼합되었는지 확인합니다. 혼합 후 자기 비드의 포획을 보장하기 위해 각각 30초씩 5주기가 포함됩니다.
      3. 3단계: 세 가지 세척 단계 각각이 30초 저속 혼합물을 사용하여 결합된 EV의 무결성을 유지하면서 특이적으로 결합되지 않은 오염 물질을 제거하는지 확인합니다. 이전과 마찬가지로 단계는 자기 비드를 캡처하기 위해 각각 30초씩 5주기로 마무리됩니다.
      4. 4단계: EV 단백질 용출(용해): 2단계 공정을 통해 단백질 회수를 위해 결합된 EV가 용해되었는지 확인합니다. 30초 동안의 초기 혼합(바닥 혼합)은 일시 중지된 상태에서 7분 및 30초 동안 배양하기 전에 팁 위치를 웰 위에 유지하여 수행됩니다. 시간이 경과하면 두 번째 30초 동안 혼합하고 7분 30초 동안 일시 중지합니다. 마지막으로 각각 30초씩 5주기가 통합됩니다.
      5. 5단계: 이 시점에서 단백질 함량이 완충액에 있고 비드가 팁에 부착되어 있는지 확인합니다. 용출 단계 후 사용한 팁 빗을 폐기하여 프로토콜을 완료합니다.
        참고: EXO-NET Pan-Exosome Capture 비드에는 0.05%(w/w) 방부제 용액이 포함되어 있습니다. 산업안전보건청(OSHA) 규정에 따라 위험으로 분류되지는 않지만, 특히 생체액과 관련하여 취급할 때 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 사용해야 합니다.

3. 웨스턴 블로팅 을 통한 EV의 특성화

참고: CAR-EV는 대조군으로서의 세포와 비교하여 웨스턴 블롯(Granzyme B 및 Calnexin)에 의해 특성화되었습니다.

  1. 10× 6 세포당 10 μL의 1x 방사성 면역침전 분석(RIPA) 완충액(프로테아제 억제제 포함)을 첨가하여 세포 용해물을 준비합니다. 얼음 위에서 30분 동안 배양한 다음 14,000×g(4°C)에서 15분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다. EV는 동일한 완충액 또는 1% SDS를 사용하여 용해할 수 있습니다.
  2. 비신코닌산(BCA) 분석(또는 적절한 나노 분광 광도계)을 사용하여 단백질 양을 정량화합니다.
  3. 제조업체의 프로토콜에 따라 전기영동 장치에 4-12% SDS-폴리아크릴아미드 겔을 조립합니다. Laemmli의 완충액을 사용하여 단백질 용해물을 준비합니다.
    알림: 젤 시스템은 브랜드에 따라 다를 수 있습니다.
  4. 각 웰에 5μg의 샘플을 로드하고 200V에서 20분 동안 겔을 실행합니다.
  5. 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인을 사용하여 웨스턴 전이를 수행하고, 그 후 0.1% 트윈 20(1x TBST)이 포함된 1x 트리스 완충 식염수에서 5% 소 혈청 알부민(BSA)으로 블롯을 차단합니다.
  6. 블롯을 1차 단클론 항체(Granzyme B 및 Calnexin, 1x TBST의 5% BSA 용액에서 500분 1 희석)에서 정체(흔들리지 않음)하고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
  7. 다음날, 2차 항체에서 배양하기 전에 블롯을 각각 5분 동안 10-15mL의 1x TBST로 3회 세척합니다(종에 따라 1,000% BSA 용액에서 1,000분 중 1 희석액 1x TBST RT에서 1시간 동안 함). CCD(Ed-Coupled Device) 디지털 카메라 를 통해 캡처한 이미지와 함께 향상된 화학발광(ECL)을 사용하여 밴드를 감지합니다.

4. 기능 분석(MTS를 통해 )

참고: 세포독성은 시험관 내 MTS[(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨] 분석에 의해 평가되었으며, 여기서 세포는 테트라졸륨 화합물을 490nm 흡광도에서 측정 가능한 가용성 유색 포르마잔 생성물로 환원합니다. MCF-7 유방암 및 K-562 혈액암 세포는 CAR-EV의 농도(0-500,000 입자/세포)를 증가시키는 3개의 독립적인 실험에서 최대 3일 동안 처리되었습니다.

  1. 다중 채널 피펫을 사용하여 96웰 플레이트에 웰당 5,000개의 수혜자 세포(50μL/웰)를 시드합니다. 빈 배지를 위해 하나의 컬럼을 예약합니다(MTS 시약 배경 빼기용). 가장자리 우물을 피하고 200μL의 멸균수로 채웁니다.
    참고: 부착 세포는 치료 전에 플레이트 표면에 세포가 부착되도록 하루 전에 도금해야 합니다.
  2. EV를 점점 더 많이 추가합니다(예: 셀당 2.5 x 105 및 4.5 x 105 또는 0.5, 0.75 및 100만 EV). 대조군 포함: 'EV 없음', 1x PBS 'EV 완충액' 및 양성 세포 사멸 대조군(예: 표적 특이적 소분자 억제제 또는 0.1% TX-100).
  3. 37°C(5% CO2, 21% O2)의 가습 챔버에서 2-3일 동안 세포를 배양합니다.
  4. 지정된 치료 시점에서 현미경을 통해 세포를 검사합니다. MTS 시약을 추가합니다(웰당 100μL 배양당 20μL). 1-4시간 동안 배양하고 490nm에서 플레이트 리더를 사용하여 매시간 흡광도를 측정합니다.
  5. 데이터 분석을 위해 빈 매체 흡광도 판독값을 뺍니다. 두 그룹 비교의 경우 스튜던트의 t-검정을 사용하거나 세 개 이상의 그룹에 대한 다중 비교를 사용하는 일원 분산 분석을 사용하여 통계량을 계산합니다.

결과

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CAR T/NK 세포 배양에 이어 EV 분리, 특성화 및 기능적 분석에서 EV 활용의 일반적인 워크플로우가 그림 1에 나와 있습니다. CAR T/NK 세포 배양에서 CM을 수집하고, EV 농축 및 다운스트림 특성화(나노입자 추적 분석 포함) 및 멀티웰 플레이트 MTS 분석을 통해 기능적 활성을 평가하기 전에 수집됩니다(그림 1).

GFP 태그가 부착된 CAR 세포는 현미경을 통해 시각화하여 배양에서 CAR 구조물의 발현을 확인할 수 있습니다. 현미경 검사는 충분한 형질도입 효율을 보장하기 위해 CM 수집 전과 수집 중에 일상적인 단계로 수행되어야 합니다. 효율성을 평가할 때 잠재적인 자가형광을 포착하기 위해 명시야 및 GFP 채널을 오버레이하는 것이 중요합니다. 주목할 점은 T 세포가 자연적으로 뭉치는 경향이 있으며(NK 세포에서도 유사하게 관찰됨, 데이터는 표시되지 않음), 세포가 응집된 표현형을 나타낼 때 형광을 명확하게 관찰할 수 있다는 것입니다(그림 2).

EV 농축 후 EV는 NTA 및 웨스턴 면역블로팅을 통해 특성화될 수 있습니다. NTA를 사용하여 입자 수율 분석을 통해 CM에 비해 분리된 EV에서 농도가 증가했음을 확인할 수 있습니다(그림 3A). 웨스턴 블롯 데이터는 CAR 세포 및 EV에서 세포용해 마커 그랜자임 B의 발현과 후자에서 칼넥신의 부재를 추가로 확인하여 제제에 세포 물질이 없음을 확인합니다. HEK293T 세포는 CAR 음성 대조군으로 포함됩니다(그림 3B).

세포 생존력/증식 능력을 결정하기 위해 MTS 분석을 통해 EV 기능 분석을 수행했습니다. MCF-7 유방암 및 K562 혈액암 세포 생존력 및 성장에 대한 EGFR 및 HER2 표적 CAR-EV의 효과는 490nm의 흡광도(배경 신호 제거 후)에서 비색 MTS 시약을 측정하여 결정됩니다. 이 예에서 CAR-EV를 표적으로 하는 EGFR은 MCF-7 및 K562 세포 생존력을 각각 70% 및 40% 감소시켰습니다. CAR-EV를 표적으로 하는 HER-2는 MCF-7을 ~10% 감소시켰습니다(스튜던트 t-테스트를 통해 결정됨). 실험 레이아웃을 고려할 때 비모수 테스트(예: Mann-Whitney U)를 사용하면 후속 연구에서 보다 강력한 통찰력을 제공할 수 있습니다(그림 4).

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그림 1: CAR-EV 생성, 강화, EV 특성화 및 기능 판독. 기능 분석 전에 강화된 CAR-EV 샘플의 EV 생성, 생산 및 특성화의 일반적인 워크플로를 보여주는 개략도입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: HER2 표적 CAR-T 세포에서 GFP 발현 확인에 의한 대표적인 현미경 분석. 이미지는 20x 대물렌즈를 사용하여 형광 현미경 을 통해 캡처되었습니다. 흰색 스케일 바는 50μm의 길이를 나타냅니다. T 세포는 단일 세포로 분리되기 전에 덩어리로 성장하는 자연스러운 경향이 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: CAR 세포 및 EV의 특성화. (A) CAR-T CM 및 농축된 EV의 나노 추적 입자 분석. EV의 입자 농도는 CM보다 1.6-2.1배 더 높았고, 단백질 농도는 >80% 감소했습니다. 통계적으로 유의미한 차이는 일원 분산 분석과 Tukey의 다중 비교 테스트로 테스트되었습니다. 피≤ 0.001, **** 피≤ 0.0001. (B) 형질도입된 T 세포 및 농축된 CAR-EV의 웨스턴 블롯 분석은 CAR 세포와 EV 모두에서 세포용해성 그랜자임 B의 존재를 확인한 반면, HEK293T 비-CAR 세포에서는 부재가 나타났습니다. 칼넥신은 CAR-EV에서 검출되지 않았으며, 이는 소포체 입자에 의한 오염이 적다는 것을 나타냅니다. 레인당 단백질 부하 = 5μg. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 표적 세포 생존력(MCF-7 유방암 세포 및 K562 만성 골수성 백혈병 세포주)에 대한 CAR-EV의 효과. 표적 세포를 최대 3일 동안 4.5 x 105 및 2.5 x 105 EVs/세포(각각 EGFR 또는 HER2 CAR) 또는 대조군(EV 완충액)의 단일 용량으로 처리했습니다. (A) EGFR 표적 CAR-EV 세포. (B) HER2 표적 CAR-EV. 흡광도 판독값(치료 효능을 나타냄)의 감소가 두 세포주 모두에서 관찰되었습니다. 데이터는 양측 짝이 없는 스튜던트 t-테스트를 사용하여 분석된 SD(n = 3)± 평균 흡광도를 나타내며 p-값은 통계적 유의성을 나타냅니다. ** 피≤ 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CAR 요법의 입증된 효능과 세포외 소포(EV) 기반 요법의 유망한 이점을 결합하면 유방암 및 폐암을 표적으로 하는 연구에서 입증된 바와 같이 암 치료의 효과를 향상시킬 수 있습니다12,13. CAR-EV 치료 접근법은 EV의 생체 적합성 및 표적 지정 기능을 활용하면서 전달 문제 및 관련 독성과 같은 CAR 요법의 현재 한계를 해결합니다. 이러한 양식을 통합하면 암에 대한 새로운 치료 전략의 개발이 촉진되어 임상 환경에서 EV를 적용할 수 있는 기회가 확대될 수 있습니다. 또한, 기능성 EV의 엔지니어링 및 농축은 특히 종양 코어, 골수 및 혈액-뇌 또는 혈액-고환 장벽과 같은 장벽으로 보호되는 영역과 같은 까다로운 위치에 치료 화물을 전달하기 위한 더 안전한(세포용해 화물의 캡슐화를 통해) 보다 정확한 방법(즉, 표적 도메인 추가)을 제공합니다 14,15,16. 초원심분리를 사용한 EV 농축 방법이 잘 확립되어 있음에도 불구하고 몇 가지 한계가 남아 있습니다. 주목할만한 제약 조건에는 확장성, 불순물의 공동 분리 및 제한된 생산 후 수율이 포함됩니다17. 치료용 EV를 대규모로 생산하기 위한 개선된 프로세스가 분명히 필요합니다.

이 개념 증명 연구는 IEX가 CAR 발현 세포의 명확한 CM을 입력으로 사용하여 기능성 CAR-EV를 생산, 분리 및 농축하기 위한 확장 가능하고 효과적인 방법임을 보여줍니다. IEX는 높은 처리량 처리를 가능하게 하고 연구 및 cGMP 규모 생산을 모두 지원하므로 EV 세대부터 최종 의약품 테스트에 이르기까지 워크플로 전반에 걸쳐 품질 관리가 가능합니다18,19. EV 특성화는 기능을 확인하는 데 필수적이지만 수율은 시료 부피, 입력 농도, 표면 전하 및 결합 특성과 같은 EV 특정 특성의 차이로 인해 크게 달라질 수 있습니다. MCF-7 세포를 사용한 사내 데이터는 평균 사전 정제 수율이 ~2.85 × 108 입자/mL임을 보여주며, 정제 후 농도는 일반적으로 3 × 1011에서 1 × 1012 입자/mL 사이입니다. 이러한 수준은 다운스트림 요구 사항에 맞게 버퍼 교환 중에 재현탁 부피를 수정하여 조정할 수 있습니다. 이러한 가변성을 감안할 때 사용자는 실험 설정과 관련된 CM을 사용하여 프로토콜을 최적화하여 재현 가능하고 강력한 수율을 보장하는 것이 좋습니다.

프로토콜 내의 여러 단계는 CAR-EV의 성공적인 생산에 매우 중요하며, 특히 샘플 로딩 및 용출 단계에 중점을 둡니다. 이러한 단계는 컬럼에 의한 EV 포집 효율성과 결과적으로 전체 수율에 직접적인 영향을 미칩니다. 과도한 용질을 불완전하게 제거하면 EV 안정성이 저하되어 시간이 지남에 따라 성능이 저하될 수 있으므로 완충액 교환 단계가 중요합니다. 그런 다음 NTA 또는 단백질체 프로파일링과 같은 방법을 사용하여 EV를 특성화할 수 있습니다. CAR-EV가 세포 흡수 연구나 치료 개입과 같은 기능적 분석을 위한 것이라면 무균성이 가장 중요합니다. 최종 '말단'(0.22μm) 멸균 단계는 실험 결과를 혼란스럽게 하거나 생물학적 안전 위험을 초래할 수 있는 미생물 오염을 방지하는 데 필수적입니다. 이러한 요인을 감안할 때 사용자는 최종 EV 준비의 재현성과 기능적 무결성을 유지하기 위해 이러한 단계에서 특별한 주의를 기울이는 것이 좋습니다.

CAR-EV 생산 중에 발생하는 일반적인 문제를 해결하기 위해 몇 가지 프로토콜 수정이 필요할 수 있습니다. 낮은 수율은 컬럼의 결합 용량을 초과하거나 부족한 CM의 최적이 아닌 로딩으로 인해 가장 일반적으로 발생합니다. 최적의 입력량을 결정하려면 CM 적정 연구를 수행하여 부하를 점진적으로 증가시켜 최대 EV 회복 지점을 식별하는 것이 좋습니다. 일반적으로 최종 멸균 여과 단계에서 관찰되는 필터 막힘은 과도한 시료 농도와 점도로 인해 발생하는 경우가 많으며, 이는 EV 응집을 촉진할 수 있습니다. 이러한 경우 최종 EV 제제를 희석하는 것이 좋습니다. 희석이 가능하지 않은 경우 완충액 교환 전에 멸균 여과를 수행할 수 있습니다. 그러나 이 접근 방식에서는 멸균 상태를 유지하기 위해 모든 후속 단계를 엄격한 무균 조건에서 수행해야 합니다.

암 치료제로서 EV를 개발하려면 재현 가능한 생산 공정과 표적 암세포주에 대한 효능에 대한 강력한 검증이 필요합니다. EV 농축에서 IEX의 일반적인 한계는 비 EV 입자의 공동 분리이며, 이는 EV 특이적 마커의 다운스트림 분석을 통해 식별할 수 있고 추가 CM 최적화 를 통해 감소할 수 있는 문제입니다. EV의 제어 방출 특성화에는 다음이 포함되어야 합니다: 입자 수 및 크기를 결정하기 위한 NTA, 농축 후 EV 농도; CAR 구조 발현의 유전적 및 전사체 분석; CAR의 세포 및 EV 단백질 발현, 표준 EV 바이오마커 및 세포용해 마커(예: 그랜 자임 B 및 퍼포린)의 결정; 그리고 온타겟 및 오프타겟 효과. 투과전자현미경(TEM)과 같은 추가 기술을 통합하면 크기 기반 특성화를 보완하기 위한 형태학적 검증을 제공하여 보다 포괄적인 분석을 지원할 수 있습니다. 품질 관리를 유지하기 위해 EV 제품은 마이코플라스마 및 내독소 오염 테스트를 거쳐 무균성과 임상 생산 적합성을 확인해야 합니다. 기능성 CAR-EV의 장기 보관에 적합한 제형을 사용하면 품질, 수량 및 치료 효능 유지를 포함하여 안정성을 향상시킬 수 있는 기회를 제공할 수 있습니다. 제품 무결성을 보장하려면 기능 성능에 대한 일관된 평가가 필수적입니다. 특히, 본 연구에 활용된 MTS 분석은 대사 활성 측정 을 통해 세포독성에 대한 간접적인 평가를 제공합니다. 향후 연구에서는 젖산 탈수소효소(LDH) 방출, Annexin V/PI 염색 또는 카스파제 활성화 프로파일링과 같은 표준화된 세포독성 분석을 통합하여 세포독성 효과를 보다 정확하게 설명하는 것이 도움이 될 것입니다. 또한, CAR 세포 비교제(소싱 제한으로 인해 현재 연구에 통합되지 않음)를 단독으로 또는 CAR-EV와 조합하여 통합하고 대조군 비암 세포주의 병렬 치료를 포함하면 연구 결과의 해석적 가치를 심화할 수 있습니다.

이 연구는 특정 암에 대한 실행 가능한 치료 전략으로서 EGFR/HER2 CAR EV의 잠재적 사용을 강조합니다. CAR EV의 효능 향상은 세포독성을 증강하기 위해 모 T 세포를 여러 번 투여하거나 사전 활성화함으로써 달성할 수 있습니다. 또한, siRNA 화물과 같은 새로운 접근법의 발전과 EGFR/HER2 결합 능력의 개선은 이러한 치료 플랫폼의 설계를 개선할 수 있는 기회를 제공합니다20,21. 세포 치료에서 이중 키메라 항원 수용체(dual-CAR)의 유망한 적용은 추가적인 발전 기회를 제공합니다. 치료에 EV 대응물을 활용하여 이중 CAR의 사용을 확장하는 것은 치료 범위를 넓히고 치료 방식을 향상시키는 데 중추적인 단계가 될 수 있습니다22,23. CAR EV 기반 암세포 세포독성(예: 카스파제 3/7 활성화, 임피던스 판독)의 실시간 모니터링은 최적의 투여 요법을 결정하는 데 귀중한 통찰력을 제공하여 향후 생체 내 응용 분야로의 간소화된 번역을 촉진합니다.

공개 사항

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Asari K, Chelvaretnam C, Mom KT, Bhuiyan S, Pham Q, Fitri A, Palma C, Shojaee M, Khanabdali R, Hinch L 및 Rice G는 INOVIQ Ltd.의 직원입니다.

감사의 글

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저자는 실험실에 기여한 Siena Barton, Hiba Rashid, Sara Nikseresht, Shayalini Wignarajah 및 Abel Sujeev에게 감사를 표하고 싶습니다. 저자는 이 연구가 INOVIQ Ltd.의 지원 및 자금 지원을 통해 모든 내부 및 외부 협력자에게 감사를 표합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
<강함>재료
1x 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4깁코10010049EV 강화
1% 도데실 황산나트륨(SDS)시그마L3771-100GSDS 분말 1g을 초순수 10mL에 녹입니다.
Tween-20이 포함된 트리스 완충 식염수 1개(TBST)Thermo Scientific ChemicalsJ77500입니다. 케이2초순수로 희석하여 1x 용액을 만듭니다(또는 1x 트리스 완충 식염수에 0.1% 폴리소르베이트-20/트윈-20 용액을 준비합니다).
96웰 투명 평바닥 폴리스티렌 TC 처리 마이크로플레이트, 멸균코 닝3595시험관 내 기능 분석
Bolt Bis-Tris Plus 미니 단백질 젤, 4-12%, 1.0 mm, WedgeWell 형식인비트로젠셀/EV 특성화
소 혈청 알부민시그마-알드리치A9647-100G셀/EV 특성화
칼넥신 항체세포 신호 전달2433초셀/EV 특성화
CAR-NK/T 세포프로마브 바이오테크놀로지다릅니다CAR 세포외 리간드 결합 도메인은 수용자 세포의 선호하는 표적에 따라 달라집니다.
CellTiter 96 AQueous One Solution 세포 증식 분석(MTS)프로메가지3580시험관 내 기능 분석
cOmplete, 미니, EDTA가 없는 프로테아제 억제제 칵테일로슈11836170001세포 용해
ECL 웨스턴 블로팅 검출 시약아머샴RPN2232셀/EV 특성화
용출 완충액이노빅EV 강화/격리
평형 버퍼이노빅EV 강화/격리
EXO-ACE IEX 컬럼이노빅다운스트림 기능 분석을 위한 EV 농축/분리
특허 ID AU2024901931
EXO-NET 판 엑소좀 캡처 비드이노빅다운스트림 특성화를 위한 EV 절연
특허 ID WO/2014/011673
그랜자임 B 항체세포 신호 전달4275셀/EV 특성화
인간 IL-2 IS, 프리미엄급밀테니 바이오텍130-097-744T/NK 세포의 이종 없는 배양
iBlot 2 전사 스택, PVDF인비트로젠셀/EV 특성화
면역컬트-XF(cGMP)줄기세포 기술100-0956T/NK 세포의 이종 없는 배양
K-562ATCCCCL-243시험관 내 기능 분석
MCF-7 시리즈ATCCHTB-22시험관 내 기능 분석
Millex-GP 주사기 필터 장치, 0.22 및 마이크로; m머크 밀리포어SLGPR33RS터미널 여과
재생 버퍼이노빅EV 강화/격리
RIPA 버퍼(10X)세포 신호 전달 기술9806세포 용해
트리판 블루 용액, 0.4%깁코15250061세포 생존력 및 밀도 평가
세척 완충액이노빅EV 강화/격리
장비
자동 셀 카운터인비트로젠백작부인 2세 플로리다세포 생존력 및 밀도 평가
벤치탑 자동 추출 기기인비트로젠KingFisher Apex 시스템고처리량 자동 정제 시스템
프로토콜 세부 정보는 링크 참조: https://www.inoviq.com/site/technology/resources
형광현미경자이스액시오 옵저버 7세포 배양
나노입자 추적 분석(NTA)입자 Metrix GmbH제타뷰 PMX-130입자 분석
플레이트 리더BMG 랩텍스펙트로스타 나노시험관 내 기능 분석
냉장 탁상용 원심분리기베크만 쿨터아반티 J-15R세포 배양 & EV 농축 처리
SDS-PAGE 미니 젤 탱크인비트로젠A25977셀/EV 특성화
웨스턴 블롯 전사 시스템인비트로젠아이블롯 2셀/EV 특성화

참고문헌

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CARGMPRNAEVEGFR CARHER2 CAR

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