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방법 논문

단계적 중배엽 유도 및 3D 자기 조직화를 통한 배아 줄기 세포에서 인간 심장 오가노이드 생성

1.3K 조회수

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DOI:

10.3791/68738

⸱

2025년 10월 7일

 , 
1Basic Medicine Research Innovation Center for Cardiometabolic Diseases, Ministry of Education, Southwest Medical University, 2Nucleic Acid Medicine, Key Laboratory of Luzhou, Southwest Medical University, 3Department of Cardiology, The Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Southwest Medical University, 4Key Laboratory of Medical Electrophysiology, Ministry of Education, Southwest Medical University, 5Institute of Cardiovascular Research, Southwest Medical University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 인간 배아 줄기 세포(hESC)로부터 기능성 인간 심장 오가노이드를 생성하기 위한 단계별 방법을 설명합니다. 여기에는 세포 해동, 분화 및 성숙 단계가 포함되어 심장 발달 및 질병 모델링을 위한 강력한 플랫폼을 제공합니다.

초록

인간 배아 줄기 세포(hESC) 유래 심장 오가노이드는 초기 인간 심장 발달 및 기능의 주요 측면을 요약하는 다세포 3차원(3D) 구조입니다. 이러한 자기 조직화 오가노이드는 자발적인 수축성, 심근세포 마커 발현 및 천연 심근을 연상시키는 조직과 유사한 구조를 나타냅니다. 여기에서, 우리는 단계적 계통 분화를 통해 H9 hESC 라인에서 심장 오가노이드를 생성하기 위한 강력하고 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. 중배엽 유도는 Activin A(50ng/mL), 뼈 형태 형성 단백질 4(BMP4, 10ng/mL), 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2, 30ng/mL), 라두비글루시브(CHIR99021, 3μM) 및 포스파티딜이노시톨 3-키나아제(PI3K) 억제제(LY294002, 5μM)로 36-40시간 동안 스페로이드를 처리함으로써 시작됩니다. 심장 계통 사양은 이후 BMP4(10ng/mL), FGF2(10ng/mL), Wnt 경로 억제제(XAV-939, 5μM) 및 레티노산(0.5μM)에 4일 동안 매일 노출되어 지시됩니다. 심근 세포의 분화 및 성숙은 BMP4(10ng/mL), FGF2(10ng/mL) 및 인슐린(10μg/mL)을 사용하여 5.5일부터 추가로 촉진됩니다. 기능 검증은 타임랩스 이미징 및 면역형광 분석을 통해 달성되어 심장 트로포닌 T(cTnT) 발현으로 표시되는 수축성 심근 세포의 생성을 확인합니다. 또한 3D 면역염색은 α-SMA와 CDH5의 존재를 드러내며, 이는 평활근 및 내피 유사 세포 집단의 출현을 나타냅니다. 이러한 심장 오가노이드는 지속적으로 리드미컬한 수축을 보여줍니다. 그러나 전기 기계 결합에 대한 직접적인 전기생리학적 검증은 수행되지 않았습니다. 알려진 한계에는 오가노이드를 통과시킬 수 없음과 확장 배양 중 잠재적인 중심 괴사가 포함됩니다. 요약하면, 이 모델은 인간의 심장신생, 약물 반응 및 선천성 심장 질환을 연구하기 위한 확장 가능하고 생리학적으로 관련된 플랫폼을 제공합니다.

서론

심혈관 질환은 전 세계적으로 이환율과 사망률의 주요 원인으로 남아 있으며, 이는 인간의 심장 발달 및 기능을 요약하는 신뢰할 수 있는 시험관 내 모델의 시급한 필요성을 강조합니다1,2. 심근 세포의 전통적인 2차원(2D) 단층 배양은 가치가 있지만 천연 인간 심장의 공간적 복잡성, 다세포 상호 작용 및 전기 기계적 통합을 재현하지 못합니다 3,4. 만능 줄기 세포에서 파생된 3D 심장 오가노이드는 이러한 한계를 해결하는 강력한 플랫폼으로 등장하여 시험관 내에서 초기 심장 형태 형성 및 기능적 성숙을 모방하는 자가 조직화 다세포 구조를 제공합니다 5.

H9 계통과 같은 hESC는 심근세포, 내피 세포 및 심장 섬유아세포를 포함한 모든 체세포 유형으로 분화하는 본질적인 능력을 가지고 있습니다6. 통제된 배양 조건에서 hESC는 중배엽 유도, 심장 중배엽 사양 및 심근세포 분화의 순차적 단계를 통해 안내될 수 있습니다 5,7. 이 단계적 과정은 Activin A, BMP4, FGF2, PI3K 억제제, CHIR99021, Wnt 억제제 및 레티노산 5,8을 포함한 특정 신호 분자 및 억제제를 사용하여 조절될 수 있습니다. 배아 심장 발달의 생체 내 신호 전달 환경을 밀접하게 모방함으로써 이러한 단서는 시험관 내에서 효율적이고 재현 가능한 심장신생을 촉진합니다 5,7.

Matrigel과 같은 세포외 기질(ECM) 구성 요소에 포매해야 하는 많은 오가노이드 시스템과 달리 심장 오가노이드는 매트릭스 지지대 없이 낮은 접착 조건에서 자가 조립될 수 있습니다 5,9. 현탁액에서 분화 hESC의 응집은 분화 첫 주 이내에 자발적인 박동을 나타내는 구형 3D 구조를 생성합니다10. 이러한 오가노이드는 기능적으로 관련된 심장 세포 집단을 포함하고 육종 조직, 칼슘 일시적 현상 및 리드미컬한 수축과 같은 특징적인 특징을 나타내며11,12, 초기 인간 심장 조직의 생리학적으로 관련된 모델을 제공합니다.

hESC 유래 심장 오가노이드를 생성하는 능력은 발달 생물학, 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 심장 독성 테스트를 위한 흥미로운 기회를 제공합니다13,14. 또한 게놈 편집 기술 및 환자 특이적 유도만능줄기세포(iPSC)와의 통합을 통해 유전성 심장 질환에 대한 맞춤형 질병 모델링 및 치료 탐색이 가능합니다.

이 기사에서는 인간 배아 줄기 세포에서 심장 오가노이드를 생성하기 위한 상세한 단계별 프로토콜을 제시하고 분화의 주요 단계, 배양 조건 및 검증 기술을 강조합니다. 이 플랫폼은 인간의 심장 발달을 요약하고 향후 중개 연구를 위한 기반을 구축하기 위한 강력하고 확장 가능한 시스템을 제공합니다.

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프로토콜

인간 배아 줄기 세포(H9)와 관련된 모든 절차는 기관 지침에 따라 수행되었으며 사우스웨스트 의과대학 의생명 윤리 위원회의 승인, 승인 20241023-031의 승인을 받았습니다. 아래에 자세히 설명된 모든 조직 배양 작업은 Class II 층류 후드에서 수행되어야 합니다. 매체와 시약이 사용 전에 항상 실온에 있고 자연적으로 평형을 이루는지 확인하십시오. 매체를 데우기 위해 수조를 사용하지 마십시오.

1. HESC의 해동 및 일상 배양(H9)

  1. 배양 플레이트의 비트로넥틴 코팅
    1. 얼음 위에서 Vitronectin 스톡을 해동하고 차가운 E8 배지를 사용하여 작동 농도 10μg/mL로 희석합니다.
    2. 희석된 비트로넥틴 용액의 웰당 1mL를 6웰 플레이트에 첨가합니다. 사용하기 전에 플레이트를 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 1-4시간 동안 배양합니다.
    3. 세포를 파종하기 전에 과도한 비트로넥틴을 흡인하고 헹구지 마십시오.
      참고: 세포 배양 인큐베이터에서의 배양은 코팅 균일성을 향상시키고 세포 부착을 향상시키며, 특히 민감한 hESC에 중요합니다. 코팅액이 건조되지 않도록 하십시오. 이 프로토콜은 hESC 해동 및 팽창 단계 동안에만 비트로넥틴 코팅 플레이트를 사용하여 정의된 표면 결합 ECM 대체물을 제공합니다. 심장 오가노이드는 이후 ECM이 필요 없이 접착력이 낮은 현탁 조건에서 자가 응집을 통해 형성됩니다.
  2. 동결 보존 HESC(H9) 해동
    1. 최소 30-60분 전에 필요한 모든 배지 및 시약(예: E8 배지, E8 + ROCK 억제제, PBS)이 실온으로 자연적으로 평형을 이루도록 합니다.
    2. 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 액체 질소 저장고에서 H9 인간 배아 줄기 세포의 냉동 세포 1개를 회수합니다. 즉시 극저온 수조를 37°C 수조에 담급니다. 바이알을 부드럽게 휘저고 면밀히 모니터링합니다.
    3. 작은 얼음 결정이 남아 있으면(~90% 해동, ~1-2분) 즉시 바이알을 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다. 개봉하기 전에 75% 에탄올로 냉동 외부를 소독하십시오.
    4. 10μM Y-27632(ROCK 억제제)가 보충된 실온 E8 배지 5mL가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브에 냉동 농도의 내용물을 천천히 옮깁니다. 넓은 구경의 피펫 팁으로 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.
    5. 실온에서 200× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 조심스럽게 흡인하고 세포 펠릿을 2mL의 E8 + Y-27632 배지에 재현탁합니다.
    6. 원하는 시딩 밀도(일반적으로 150,000-200,000 세포/웰)로 Vitronectin으로 코팅된 6웰 플레이트(미리 준비됨)에 세포를 플레이트합니다. 플레이트를 부드럽게 흔들어 세포를 고르게 분포시키고 37°C, 5%CO2 인큐베이터로 옮깁니다.
      참고: ROCK 억제제(Y-27632)의 사용은 해동 후 처음 24시간 동안 아노이키를 예방하고 생존을 지원하기 위해 중요합니다.
  3. 일상적인 유지 보수 및 통과
    1. 웰당 2mL의 신선한 E8 배지를 사용하여 매일 배지를 교체하십시오.
    2. 위상차 현미경으로 매일 모니터링합니다. 일반적으로 3-4일마다 ~70-80% 컨플루언에 도달하면 세포를 계대합니다.
      1. 계대: 배지를 흡인하고 DPBS 1mL로 부드럽게 헹굽니다.
      2. 줄기 세포 해리 시약 0.5mL를 첨가하고 실온에서 3-5분 동안 배양합니다. 플레이트를 가볍게 두드려 콜로니를 제거합니다.
      3. 세포 현탁액을 수집하고 10μM Y-27632를 포함하는 E8 배지에서 1:3-1:4 분할 비율로 비트로넥틴 코팅 웰에 다시 도금합니다. 24시간 후 배지를 ROCKi가 없는 E8로 교체합니다.
        참고: 최적의 회수 및 후속 분화 효율을 위해 HESC는 2-10개 세포의 작은 클러스터로 계대되어야 합니다.
        전단 응력을 최소화하기 위해 와이드 보어 팁을 사용하는 것이 좋습니다. 5mL 피펫 팁 또는 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 혼합할 수 있습니다.

2. HESC(H9)의 심장 계통으로의 분화

  1. 중배엽 분화 유도(0-1.5일)
    참고: 갓 해동된 HESC(H9)를 심장 오가노이드로 직접 분화하지 마십시오. 최적의 세포 생존력과 건강한 분화를 보장하려면 분화를 시작하기 전에 세포를 먼저 계대하고 최소 한 번의 계대 동안 유지하는 것이 중요합니다. 해동 직후 세포를 분화시키면 세포 건강이 손상되어 결과가 좋지 않을 수 있습니다.
    1. 사전 유도 파종: hPSC가 약 70% 합류에 도달하면 적절한 해리 시약을 사용하여 세포를 작은 클러스터로 부드럽게 해리시킵니다. 10μM ROCK 억제제(Y-27632)가 보충된 E8 배지 2mL에 클러스터를 재현탁합니다.
    2. 응집: 200μL의 세포 현탁액(일반적으로 12,000-15,000개 세포)을 96웰 초저부착 플레이트의 각 웰에 시드한 다음 실온에서 3 분 동안 200×g에서 플레이트를 원심분리하여 각 웰의 바닥에서 세포 응집을 용이하게 합니다.
    3. 배양: 플레이트를 37°C, 5% CO2 인큐베이터에 넣고 24시간 동안 배양하여 조밀하고 균일한 배아체(EB)를 형성할 수 있도록 합니다.
    4. 50% IMDM, 50% F12 영양 혼합물, 15μg/mL의 인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS-G), 450μM의 모노티오글리세롤 및 5mg/mL의 소 혈청 알부민 분획 V를 혼합하여 기초 배양 배지(BC-M)를 준비합니다.
    5. BC-M에 Activin A(50ng/mL), BMP4(10ng/mL), CHIR99021(3μM), FGF2(30ng/mL) 및 LY294002(5μM)를 보충하여 MD-M을 준비합니다.
    6. 중배엽 유도: 응집 24시간 후, MD-M으로 36시간 동안 EB를 유도합니다.
      참고: 심장 오가노이드의 유도 효율과 일관성을 보장하기 위해 H9 hESC의 사용을 해동 후 3개 계대 이내로 엄격하게 제한했습니다. 이 전략은 높은 차별화 효율성과 전반적인 실험 신뢰성을 유지하는 데 중요합니다.
      매체 교환 중 부드럽게 취급하는 것은 형성된 골재의 무결성을 보존하는 데 중요합니다. EB의 구형 형태를 방해하지 마십시오.
  2. 심장 중배엽 분화 유도(1.5-5.5일)
    참고: Wnt 신호 전달 억제제(XAV-939)는 후방 중배엽 신호를 억제하고 심장 계통 사양을 촉진하는 데 중요합니다. 레티노산은 전후 패턴화에서 용량에 민감한 역할을 합니다. 과도한 RA는 전장 사양으로 이어질 수 있습니다.
    1. BC-M(2.1단계에 자세히 설명된 조성물)에 BMP4(10ng/mL), FGF2(10ng/mL), 레티노산(0.5μM) 및 XAV-939(5μM)를 보충하여 심장 중배엽 분화 배지(CMD-M)를 준비합니다.
    2. 중배엽 유도 36-40시간 후, MD-M을 조심스럽게 흡인하고 매일 중간 변화로 4일 동안 CMD-M으로 교체합니다.
      참고: 기계적 파괴나 스트레스로 인한 세포사멸을 피하기 위해 배지 변화 중에 응집체를 부드럽게 다루십시오.
      이 기간 동안 스페로이드는 더욱 컴팩트하고 조직화됩니다. 심장 계통 헌신의 초기 징후는 5일차까지 명시야 현미경으로 관찰할 수 있습니다.
  3. 심장 오가노이드 사양(5.5-7.5일)
    1. BC-M(2.1단계에 자세히 설명된 조성물)에 BMP4(10ng/mL), FGF2(10ng/mL) 및 인슐린(10mg/mL)을 보충하여 심장 오가노이드 사양 배지(COS-M)를 준비합니다.
    2. 5.5일째에 CMD-M을 부드럽게 흡인하고 매일 중간 정도의 변화로 2일 동안 COS-M으로 교체합니다.
      참고: BMP4 및 FGF2는 시너지 효과를 발휘하여 심장 전구 확장을 촉진하고 이 단계에서 비심장 운명을 억제합니다. 인슐린은 분화 심근 세포의 대사 활동과 구조적 발달을 지원합니다.
  4. 심장 오가노이드 성숙
    참고: 전달 중에 스페로이드의 완전한 해리 또는 피펫팅을 피하십시오. 심근 세포는 전단 응력에 매우 민감합니다.
    1. BC-M(2.1단계에 자세히 설명된 조성물)에 인슐린(10mg/mL)을 보충하여 심장 오가노이드 성숙 배지(COM-M)를 준비합니다.
    2. 7.5일차부터는 COM-M으로 전환합니다. 스트레스를 최소화하면서 영양 수준을 유지하고 대사 노폐물을 제거하기 위해 매일 매체 교체를 수행하십시오.
    3. 8일차부터 12일차까지 일반적으로 광학 현미경으로 명백해지는 심장 오가노이드의 자발적인 박동을 찾습니다.
    4. 12+일까지 수축 리듬이 규칙적이고 지속되는지 확인합니다.
      참고: 박동 속도와 형태는 타임랩스 현미경 및 이미지 분석 도구를 사용하여 정량화할 수 있습니다.
      전기생리학적 분석(예: 칼슘 이미징 또는 MEA)은 기능적 성숙도를 평가하기 위해 12일째부터 수행할 수 있습니다.

3. 냉동 보존 준비

  1. 기계적 스트레스를 피하기 위해 와이드 보어 피펫을 사용하여 배양 플레이트에서 심장 오가노이드를 조심스럽게 옮깁니다. 이를 15mL 원추형 튜브에 넣고 오가노이드가 원심분리 없이 3-5분 동안 중력에 의해 자연적으로 침전되도록 합니다.
  2. 다음 성분(최종 농도)으로 냉동 보존 배지(Cryo-CM)를 준비합니다: 80% CM-M, 10% FBS, 10% DMSO.
  3. 냉동 바이알당 500μL의 Cryo-CM에 심장 오가노이드를 부드럽게 재현탁합니다.
  4. 냉동 바이알을 이소프로판올 기반 냉동 용기에 넣습니다. ~1°C/min에서 점진적으로 냉각되도록 -80°C에서 12-24시간 동안 보관합니다.
  5. 하룻밤 냉동 후 장기 보존을 위해 바이알을 액체 질소 저장고로 옮깁니다.
    참고: 우리는 냉동 보존 배지 1mL에 현탁된 냉동 바이러스당 약 20-30개의 성숙한 오가노이드의 밀도로 심장 오가노이드를 동결 보존했습니다.

4. 심장 오가노이드 회복 및 해동

  1. 오가노이드를 회수하려면 수조에서 바이알을 빠르게 해동하고, 심장 오가노이드를 CM-M 배지로 옮기고, 부드럽게 원심분리하여 DMSO를 제거하고, 오가노이드를 신선한 CM-M에 재현탁합니다.
    참고: 해동 후 박동은 일반적으로 오가노이드의 성숙도 및 취급 품질에 따라 24-48시간 이내에 재개됩니다.

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결과

H9 hESC를 심장 오가노이드로 성공적으로 분화하는 것은 만능 줄기 세포의 강력한 부활과 유지에서 시작됩니다. 해동 시 hESC는 ROCK 억제제가 보충된 E8 배지의 비트로넥틴 코팅 플레이트에 도금될 때 높은 생존력과 접착력을 나타냅니다. 24-48시간 이내에 정의된 가장자리와 높은 핵 대 세포질 비율을 가진 조밀한 콜로니를 관찰할 수 있으며, 이는 전형적인 미분화 형태의 회복을 나타냅니다(그림 1A). 해동 후 hESC는 빠르게 증식 단계에 들어가 강력한 콜로니 확장 및 만능 특성의 재확립을 보여줍니다(그림 1A).

H9 hESC에서 심장 오가노이드를 생성하기 위한 전체 워크플로우는 그림 1B에 설명되어 있으며, 줄기 세포 유지에서 3D 오가노이드 형성 및 성숙에 이르는 각 단계를 자세히 설명합니다. hESC를 심장...

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토론

H9 hESC에서 심장 오가노이드의 성공적인 생성은 초기 심장 발달을 모방하기 위한 주요 신호 전달 경로의 정확한 시간적 및 공간적 조절에 의존합니다. 이 프로토콜은 중배엽 유도, 심장 계통 사양 및 화학적으로 정의된 시스템에서 3D 수축 구조로 자기 조직화의 중요한 단계를 요약합니다. 이 방법은 인간의 심장 발달, 선천성 심장병 및 심장 독성 스크리닝을 모델링하기 위한 강력하고 재현 가능한 플랫폼을 제공합니다.

이 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나는 분화 5 전에 H9 hESC의 건강과 품질을 보장하는 것입니다. 세포는 약 70% 컨플루멘트로 배양되어야 하며 분화가 시작되기 전에 해동 후 적어도 한 번 계대되어야 합니다15,16. 계대 없이 갓 해동된 hESC를 사용하면 생존력이 저하되고 심장 유도가 비효율적...

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공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

친절하게 hESC(H9)를 제공해 주신 Junfeng Ji(중국 절강대학교 기초의과대학)와 Tao Luo(중국 절강대학교 기초의과대학)에게 감사드립니다. 이 작업은 중국 국립자연과학재단(C.Z.에 대한 보조금 번호 U23A20398), 쓰촨성 과학 기술 프로그램(C.Z.에 대한 보조금 번호 2022YFS0578 및 2022YFS0614), 서남의과대학 연구 창업 재단(C.Z.에 대한 보조금 번호 00040155), 서남의과대학 연구 창업 재단(B.W.에 대한 보조금 번호 00170071), 루저우시 인민정부와 서남의과대학의 과학기술 전략적 협력 프로그램(B.W.에 보조금 번호 2024LZXNYDJ088), 서남의과대학의 과학기술전략협력 프로젝트(BW에 보조금 번호 2024PZXNYD01), 서남의과대학 재단(B.W.에 보조금 번호 2024ZKZ014).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.02% EDTA비요타임C0198
6 우물  접시코 닝3516
7.5% 소 혈청 알부민ACMECAC11954
96웰 초저부착판코 닝7007
Alexa Fluor 488 당나귀 안티 마우스 IgG예센34106ES60
Alexa Fluor 555 염소 토끼 방지인비트로젠A-21428
CHIR-99021 모노하이드로클로라이드예센52965ES10
DMSO 솔라바이오D8370
덜베코 인산염 완충 식염수(D-PBS)예센60152ES76
FBS깁코10099141C
FGF2 단백질, 인간, 재조합타겟몰TMPY-00749-50 &무; g 
햄의 F-12 영양 믹스라이프 테크놀로지11765054
hPSC-CDM(Essential 8 배지)콜리셀400105
인간 BMP-4 재조합 단백질깁코PHC9534
IMDM, 글루타맥스 보충제라이프 테크놀로지31980030
인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS -G)깁코41400045
LY294002셀렉S1105-50mg
모노티오글리세롤시그마-알드리치M6145
마우스 안티&알파;SMA압마트MN50104
ProLong 다이아몬드 퇴색 방지 마운팅제(DAPI 포함)인비트로젠P36966
토끼 안티 CDH5압마트TA6265
토끼 항-cTNT인비트로젠701620
재조합 인간 BMP-4 단백질예센92053ES20 시리즈
재조합 인간 인슐린 예센40112ES25
재조합 인간/마우스/쥐 액티빈 A 단백질예센91702ES10
리레SR줄기세포100-0483
레티노산시그마-알드리치R2625
비트로넥틴깁코A14700
XAV-939셀렉에스1180
Y-27632 2HCl(ROCK 억제제)셀렉S1049

참고문헌

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