교모세포종 동물 모델에서 간질액의 종단적 수집을 위한 뇌 개방형 미세관류 사용

요약

생체 내에서 교모세포종(GBM)과 같은 많은 중추신경계 질환의 세포 간 통신은 측정과 특성 규명이 매우 어렵습니다. 여기서는 GBM 종단 동물 모델에서 간질성 액체 성분을 샘플링하기 위해 사용할 수 있는 뇌 개방형 유동 미세관류(cOFM) 절차를 설명합니다.

초록

중추신경계(CNS) 질환은 복잡하고 역동적인 세포 간 소통망을 통해 나타납니다. 가장 흔하고 공격적인 원발성 뇌종양인 교모세포종(GBM)은 이러한 복잡성을 상징하며, 빠른 진행과 몇 달 단위로 측정되는 암울한 예후를 보여준다. GBM의 생물학은 신생물세포와 기질 세포 간의 복잡한 신호 전달 분자 교환에 의해 구동되며, 이는 공격적인 질병 진행의 기반입니다. 여기서는 GBM 마우스 모델에서 종양 미세환경 역학을 실시간으로 종단적으로 모니터링할 수 있는 GBM 마우스 모델에서의 상세한 뇌 개방형 미세관류(cOFM) 프로토콜을 설명합니다. 우리의 접근법은 내구성이 있는 가이드 캐뉼라 헤드 마운트의 이식, 가이드를 통한 뇌내 교세포종 이식 사용, 그리고 대사 및 단백질체체 LC-MS 분석을 위한 고충실도 cOFM 샘플 수집을 설명합니다. 중요한 점은 cOFM이 전통적인 미세투석의 분자 크기 제한을 극복한다는 점입니다. GBM을 넘어, cOFM 방법론은 신경퇴행성, 간질, 신경정신과 질환 등 다양한 중추신경계 질환에 대한 변혁적 통찰을 약속하며, 해당 동물 모델 내에서 원인학적 및 치료 반응성 바이오마커를 제공할 수 있습니다.

서론

중추신경계(CNS) 질환 연구는 간질액(ISF^)1,2,3,4에 의해 매개되는 복잡하고 다중형 세포간 신호 전달 때문에 매우 어렵습니다. 이러한 복잡성은 특히 교모세포종(GBM)과 같은 뇌종양에서 두드러지는데, 세포 간 신호가 신생물세포와 기^{질 세포} 5,6,7,8,9 사이에서 전달됩니다. 많은 경우, 대사산물과 단백질 메신저를 포함한 다양한 생체분자의 비정상적인 교환이 중추신경계 병동의 근본 원인에 기여합니다. 특히 GBM에서는 ISF의 분자 구성이 시간적으로 동적이며 질병 진행 과정과 중재적 치료에 반응하여 진화한다는 점에서 이러한 연구적 도전이 더욱 심화됩니다^10,11.

전통적인 전임상 GBM 연구 방법에는 시험관 내 연구와 단일 평가 동물 모델이 포함됩니다. 이러한 접근법의 특성은 종양 미세환경의 특성과 종단적 시간 변화를 모두 포착하지 못해 광범위한 임상적 적용성을 제한합니다. 1980년대 초반의 발전은 뇌내미세투석(cMD^)의 개발로 이러한 맥락적 한계를 극복^{했습니다.} 45년 전 도입된 이래로 cMD는 살아있는 뇌 내 간질액(ISF)의 종방향 샘플링 표준 방법으로 자리매김^{했습니다.} 이는 고농도 ISF 용질이 반투과막을 통해 지속적으로 흐르는 저용질 농도의 관류물인 인공 뇌척수액(aCSF)으로 자유 확산 및 대류를 통해 이루어집니다¹⁷. 이 반투과막들은 다양한 생체적합성 고분자로 구성되며, 공통된 분자량 공극 크기 컷오프는 20 kDa에서 3 MDa¹⁸에 이릅니다. 이 최소 침습 절차는 대사산물이나 신경전달물질과 같은 소분자부터 항체와 같은 큰 단백질에 이르기까지 다양한 분석 물질을 장단적으로 현장에서 수집할 수 있게 합니다. 그러나 cMD 막의 구조적 다공성과 조성 중합자의 흡착성 특성은 지질이나 항체와 같은 특정 생화학적 또는 차원적 특성을 가진 분석물의 상대적 회수에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다(^19,20).

cMD 막의 이러한 한계를 극복하기 위한 발전은 2010년대 초 뇌 개방형 미세관류(cOFM)²¹의 개발로 시작되었습니다. cMD와 유사한 일반 원리에 따라 작동하며, 반투과성 막이 부과하는 생화학적 한계를 제거하여 약 100 μm^크기의 저흡착 거시적 개구부를 가진 플라스틱 격자 프로브로 대체합니다. 수많은 보고서가 펩타이드 호르몬, 나노바인/항체, 소량 지혈성 치료제, PEG화 리포솜 19,22,23,24,25 등 검출 가능한 ISF 성분을 수집함으로써 cMD보다 cOFM의 효용이 향상됨을 입증했습니다. cOFM 가이드 프로브 이식에 대한 생리학적 조직 반응을 조사한 이전 보고서에 따르면, 혈액-뇌 장벽의 무결성이 이식 후 15일째 되고,²⁶일째 30일까지는 교세포 흉터가 형성되지 않는다는 것이 나타났습니다. 미세투석막을 거시적 개구부로 대체함에 따라, 연구자들은 cOFM 가이드 프로브가 면역결핍 쥐의 뇌에 이종이식된 교모세포를 주입하는 혁신적인 능력을 입증했으며, 이를 통해 외상성 종양 부착과 증식이 cOFM 샘플링 영역²⁷ 주변에서 직접 일어나도록 했습니다.

CNS 병리 연구에 cOFM을 사용할 때는 여전히 방법론적 한계를 인정해야 합니다. ISF 분석물의 수동 확산 및 대류에 의존하기 때문에, 이러한 한계는 분석 물질 농도와^{시료 부피 18}에 집중됩니다. 샘플링된 ISF 성분은 내인성 농도에 비해 수집된 cOFM 퍼퓨세트 내에서 희석될 예정이므로, 많은 연구가^{실험 조건 간} 상대적 분석물 비율을 비교하는 데 기여한다. 일반적인 유량은 0.1 μL/min에서 1.0 μL/min 사이로, 6 μL/h에서 60 μL/h에 해당합니다. 튜빙 데드 스페이스 클리어런스 시간을 고려할 때, 총 샘플링 시간도 고려해야 합니다. 이는 특히 마취된 동물에서 cOFM 수집을 수행할 때 중요하며, 동물 복지 문제를 신중히 다뤄야 합니다. 이러한 고려사항과 기타 고려사항에 대한 더 자세한 설명은 cOFM 개발 팀²⁹의 이전 방법 보고서에서 확인할 수 있습니다.

이 원고에서는 신경학적 질환 연구에 종단 cOFM 샘플링을 적용하기 위한 최신 프로토콜을 제공하며, 특히 GBM에 중점을 둡니다. 프로토콜에는 cOFM 가이드 캐뉼라 삽입, 종양 세포 주입, cOFM 가이드를 통한 착립 단계뿐만 아니라 각성 상태에서 자유롭게 움직이는 동물에서 두 가지 cOFM 샘플링 구성이 포함됩니다. 우리는 cOFM으로 측정된 대사체 및 단백질체 ISF 구성 요소에 대한 치료 효과, 샘플링 구성이 분석물 농도에 미치는 영향, cOFM 유도 종양 세포 이식의 효능을 보여주는 대표적인 데이터를 제시합니다.

프로토콜

이 프로토콜 내 모든 동물 시술은 노스웨스턴 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC, 프로토콜 ID: IS00021383)의 승인을 받으며, 국립보건원(NIH) 지침을 따릅니다. 이 프로토콜은 최소 8-10주 사이의 수컷과 암컷 C57BL/6J 마우스를 대상으로 개발되었습니다. 이 프로토콜에 사용된 쥐 교모종 세포주인 CT2A는 보스턴 대학교 세이프리드 연구실에서 제공되었으며, 멸균 조직 배양 조건 후 배양 및 준비되었습니다.

1. 수술 계획 및 준비

1. 동물 정보: cOFM 실험에서는 완전한 성장과 발달을 위해 최소 8-10주 된 쥐를 사용하세요. 고정 두개골 임플란트는 아직 발달 중인 두개골 및/또는 뇌에서 벗어나거나 제대로 성장하는 데 방해가 될 수 있습니다.
2. 외과적 좌표 선택: 동물 뇌 지도를 사용해 관심 영역의 직교 좌표를 브레그마에 대해 찾아냅니다. 예를 들어, 교모세포 이식은 일반적으로 선조체에 시행되어 자연 GBM 미세환경을 가장 잘 복제하고 이후 종양 발생의 효능을 극대화합니다. 이 프로토콜에서 사용되는 cOFM 가이드 이식 좌표는 중측(ML) = 2.5 mm, 전후측(AP) = 0 mm, 배복측(DV) = 3.5 mm입니다.
   참고: 입체 위치 좌표는 쥐 품종과 나이에 따라 달라질 수 있습니다. 원하는 cOFM 안내 위치를 확인하기 위해 종별 및 계통별 아틀라스 좌표를 사용해 주세요.
3. 적절한 cOFM 구성 구성 선정: 2mm에서 22mm까지의 특정 전체 길이와 1mm에서 2mm의 개방면(open surface length)으로 적절한 cOFM 구성에 대해 주문합니다.
   참고: 동물은 미용 행동을 수행하면서 부적절하게 이식된 cOFM 가이드 헤드 마운트를 떨어뜨릴 수 있습니다. 이 작업 중 헤드마운트에 가해지는 기계적 지렛대를 최소화하기 위해, 가이드는 의도된 DV 좌표 거리보다 2에서 3mm 이상 더 길지 않은 것을 권장합니다.
4. 실험 목표를 위한 수술 및 샘플링 시술 일정 계획: 관심 질환과 모델 특성에 따라 cOFM 관련 시술의 시기와 순서를 신중히 계획하여 해당 생물학을 최적으로 조사합니다.
   1. 건강한 뇌와 종양 미세환경 간 ISF 조성 차이를 조사할 때는 동일한 동물 내 종양 착상 전후로 cOFM 샘플링 절차를 수행해야 합니다.
   2. 임상 개입이 중추신경계 병리에 미치는 영향을 조사할 때는 대조군 또는 실험적 치료를 받는 병행 동물 코호트에서 투여 전후로 cOFM 샘플링 절차를 수행해야 합니다.

2. cOFM 가이드 수술 수술

1. cOFM을 위한 수술 도구를 조립하여 삽입 수술(재료표)을 안내하고, 필요 시 오토클레이브로 멸균 하세요.
2. 수술 현장 준비:
   1. 생물안전 캐비닛 소독: 적절히 소독된 생물안전 캐비닛 안에서 수술을 시행합니다. 바이오 안전 캐비닛 공기 흐름을 작동시키고, 기관에서 승인한 소독제 및 닦기 방법으로 내부 표면을 청소하세요. 캐비닛 하단에는 멸균된 커튼을 씌우세요.
   2. 입체 정위 기구 준비: 입체 정위 프레임을 소독제로 청소하고 생체 안전 캐비닛에 넣으세요. 마찬가지로 입체정법 장착 드릴과 가이드 홀더를 청소하고 소독한 후 생물안전 캐비닛에 보관하세요.
   3. 수술용 온열 패드: 입체 수술 단계에서 마취 중인 동물에게 보충 열을 제공하기 위해 온열 패드를 사용합니다. 온열 패드 표면을 청소하고 소독한 후, 동물이 위치할 입체 프레임 위에 올려놓으세요. 온열 패드를 약한 온도로 틀고 그 위에 1-2개의 멸균 커튼을 깔아주세요.
   4. 추가 수술 기구 및 장비 배치: 생물안전 캐비닛에 추가 멸균 장비를 무균적으로 배치합니다.
   5. 회수 케이지 설치: 깨끗한 회수 케이지를 가능한 한 낮은 온도로 설정한 온열 패드 위에 올려놓으세요. 각 동물은 완전히 회복될 때까지 개별 회복 케이지에 넣어야 하며, 전체 회복 케이지 수는 수술 성능과 회복 시간에 따라 달라집니다.
3. 수술 전 동물 준비 ( 그림 1A에 요약):
   1. 마취: 기관에서 승인한 마취제와 용량을 투여하여 적절한 마취 깊이를 달성하고, 발바닥 집는 반사 검사와 호흡 깊이/속도를 측정하여 충분한 마취를 보장합니다. 예를 들어, 케타민-자일라진 혼합물(100 mg/kg - 10 mg/kg, 식염수)을 복막 내 주사하면 C57BL/6J 마우스에 적절한 마취 깊이를 달성할 수 있습니다.
   2. 진통제: 수술 전후 통증 관리를 돕기 위해 기관에서 승인한 진통제 화합물을 투여합니다. 예를 들어, 수술 전후 통증 관리에는 멜록시캄(20 mg/kg, 식염수)을 피하 주사하는 것이 적합합니다.
   3. 제모(면도, 제모 크림): 전기 면도기 및/또는 제모 크림을 사용해 두개골 위 수술 부위에서 털을 제거합니다. 제모 크림을 사용할 때는 자극을 피하기 위해 피부에 너무 오래 두지 않도록 주의하세요.
   4. 안과 연고: 멸균된 면 팁 어플리케이터를 사용해 양쪽 눈에 부드럽게 바르어 수술 중 각막 건조를 방지하세요.
   5. 동물을 입체정위 프레임에 삽입하는 방법: 동물을 올바르게 입위 고정 프레임에 삽입하고, 귀 봉을 외이도에 단단하지만 부드럽게 삽입하며, 코 클램프를 동물의 비강 뼈에 고정합니다( 그림 1B). 적절한 위치라면 동물의 두개골은 움직임 없이 단단히 고정되어야 합니다.
   6. 무균 수술 부위 준비: 수술 부위 피부를 알코올(에틸 또는 이소프로필)과 포비돈 요오드를 번갈아 세 번 번갈아 닦아 절개 부위를 무균으로 소독합니다.
4. 절개 및 두개골 표면 준비:
   참고: 다음 모든 단계는 가능한 한 무균적으로 수행되어야 합니다. 이를 위해 주치의는 절개 수술 전에 표준 실험실 장갑 위에 멸균 수술용 장갑을 착용해야 합니다.
   1. 절개 위치 및 길이: 멸균 메스를 사용해 두개골 표면을 따라 눈 사이에서 시작해 후리로 8-10mm 방향으로 시상 중앙선 절개를 합니다( 그림 1C).
   2. 피부 후퇴: 멸균 겸자, 면촉 적용기, 또는 메스 칼날을 사용해 중앙선 절개 부위의 피부를 측면으로 당깁니다. 브레그마와 람다가 모두 보이도록 하고, 그렇지 않으면 절개 부위를 확장하세요.
   3. 골막 절개: 멸균 메스를 사용해 골막에 절개를 하고 겸자로 조직을 측면으로 당깁니다.
   4. 과산화수소 면봉: 멸균된 면촉 어플리케이터로 희석된 1%-3% 과산화수소를 사용해 두개골 표면을 세척합니다( 그림 1D). 또한 시상, 관상, 그리고 양상염 두개골 봉합선을 통해 브레그마와 람다를 식별하는 데에도 도움을 줍니다.
   5. 자가 부식 치과 접착제: 0.3mL에서 1.0 mL 인슐린 주사기를 사용해 두개골 표면에 20-40 μL의 자가 부식 치과 접착제를 고르게 바릅니다( 그림 1D). 에칭을 돕기 위해 치과용 경화광을 적용하세요. 경화되면 멸균된 면 팁 어플리케이터와 식염수를 사용해 과도한 접착제를 닦아내세요.
      주의: Bond Force와 같은 자가 부식 치과용 접착제는 잠재적으로 위험한 물질입니다: 가연성 위험(GHS02: H225), 건강 위험(GHS07 및 GHS08: H315, H319, H317, H361fd, H336), 환경 위험(GHS09: H412). 적절한 유해 폐기물 처리를 위해 지역 및 기관의 지침을 반드시 준수해 주시기 바랍니다.
5. 버 홀 위치 및 드릴링:
   1. 멸균된 0.7mm 드릴 비트를 마이크로드릴에 삽입하고, 적절한 홀더를 장착해 입체 정위 프레임에 드릴을 설치하세요.
   2. 브레그마를 시상선과 관상선이 만나는 지점에 위치시키고, 입체정위 미세조작기를 사용해 드릴 비트를 그곳에 위치시키세요.
   3. 드릴 비트를 cOFM 가이드 좌표(ML = 2.5, AP = 0.0)로 재배치하고, 드릴을 15,000 rpm으로 작동시키며, DV 마이크로매니퓰레이터 다이얼을 조정하여 버 홀을 조심스럽게 드릴링합니다(그림 1E). 드릴을 할 때 두개골 두께를 자주 관찰하여 뇌 손상을 방지하세요. 드릴링 중에는 생리식염수를 사용해 뼈 이물질을 씻어내고 드릴 비트와 두개골 사이의 열을 줄이세요.
   4. 각 앵커 스크류 좌표에 대해 시추 절차를 반복합니다(그림 1E). 권장되는 앵커 스크류 위치는 ML = 2.5, AP = -2.5, ML = -2.5, AP = -2.5입니다.
   5. 버 구멍을 뚫은 후에는 마이크로드릴과 드릴 홀더를 입체 정위 프레임에서 분리합니다.
   6. 30G 바늘을 사용해 cOFM 가이드 버 홀 아래 경막을 부드럽게 찔러 주세요.
6. 무균 겸자 한 쌍과 적절한 크기의 무균 드라이버를 사용해 앵커 스크류를 설치하세요(그림 1F). 나사의 피치에 따라, 나사를 1에서 2 길이 깊이로 삽입하면 고정 고정이 충분합니다. 피질에 손상을 주지 않도록 앵커 스크류를 너무 깊게 박지 않도록 주의하세요.
7. cOFM 가이드와 cOFM 더미 어셈블리를 가이드 홀더와 마운트 홀더에 입체 고정 프레임에 장착하세요. cOFM 가이드 팁을 버 홀 위(ML = 2.5 mm, AP = 0.0mm)에 위치시키고, Bregma 높이와 같은 DV 높이로 cOFM 가이드를 버 홀을 통과해 적정 깊이까지 천천히 내려가세요( 그림 1F). 예를 들어, 종양 세포 이식이 예정된 cOFM 가이드 위치 깊이는 DV = -3.5 mm입니다.
8. 두개골 표면에 시멘팅제를 바르고, cOFM 가이드와 앵커 스크류 아래와 주변 부위를 얇고 균일한 층으로 덮도록 합니다. 치과용 경화등으로 각 층의 시멘트제를 경화시키고 다음 층을 덧칠하세요( 그림 1G). 시멘팅제를 계속 발라서 각 부품 사이의 두개골 표면이 덮이고, 앵커 나사가 완전히 덮이며, cOFM 가이드 아래 홈 주변까지 부분이 덮입니다. 시멘팅제를 잠금 쐐기 위나 근처에 두지 않도록 주의하세요.
   주의: Tetric EvoFlow와 같은 시멘팅 물질은 잠재적으로 유해 물질, 즉 건강 위험 물질입니다 (GHS07: H317, H319, H335, H360). 적절한 유해 폐기물 처리를 위해 지역 및 기관의 지침을 반드시 준수해 주시기 바랍니다.
9. 가이드 홀더를 cOFM 가이드에서 분리한 후, 마이크로매니퓰레이터의 DV 조정 노브로 가이드 홀더를 천천히 들어 올립니다. 입체정정 프레임에서 미세조작기를 제거하세요.
10. 먼저 귀바를 느슨하게 하고 제거한 뒤, 코 클램프를 풀고 당겨 동물의 앞니를 물림 차단에서 들어 올려 동물을 입체 고정 프레임에서 분리시킵니다.
11. 치과 시멘트 위에서 봉합 피부가 닫혀 cOFM 가이드 바디가 노출된 상태를 유지합니다. 폴리글리콜산(PGA) 또는 폴리글락틴(Vicryl)과 같은 흡수성 4-0 봉합사가 권장됩니다(그림 1H).
12. 원래 절개 부위 인접 피부에 3회 항생제 연고를 발라주세요.
13. 동물 회복 및 지원:
    1. 동물을 격리된 회수 케이지(케이지당 한 마리)로 옮기고, 약하게 설정한 온열 패드로 보충 열을 제공합니다.
    2. 선택 사항: 회복을 가속화하기 위해 동물에게 마취 역전제를 투여하세요. 예를 들어, 아티파메졸(1 mg/kg, 생리식염수에 피하 주사)은 마취 회복 시간을 약 1시간에서 약 20분으로 단축시킵니다.
    3. 동물이 충분히 의식을 회복하고 흉골 누워 있을 때까지 지속적인 관찰과 지원을 제공합니다. 동물이 수술과 마취에서 완전히 회복될 때까지 동물을 혼자 두지 마세요.
    4. 동물이 완전히 회복되면 다른 동물들과 함께 공동 우리로 돌아갈 수 있습니다.
    5. 수술 다음 날에는 멜록시캄과 같은 기관에서 승인한 진통제를 투여하여 추가 진통 지원을 제공합니다(2.3.2단계 참조).
14. cOFM 가이드 이식 수술 후 혈액-뇌장벽이 완전히 치유될 수 있도록 14일간의 회복 시간을 두고, 이후 추가 시술을 시행해야 합니다.

3. cOFM 가이드에 의한 두개내 종양 세포 착상

1. 세포 배양 및 준비:
   1. 세포 유형별 프로토콜에 따라 세포를 배양하고 증식합니다. 예를 들어, CT2A와 같은 합성 마우스 교모세포는 10cm 접시나 T-75 플라스크에 DMEM을 들어 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신 보충제를 함께 배양할 수 있습니다.
   2. 세포 유형별 프로토콜에 따라 배양된 세포를 착상을 준비하세요.
      1. 예를 들어, 공동 CT2A 교모종 세포의 경우, 성장 배지를 제거하고 잠시 PBS로 세척한 후 0.05% 트립신(0.53 mM EDTA)에서 37 °C에서 5분간 세포를 배양합니다.
      2. 1% FBS 함유 DMEM의 동일한 부피로 트립신을 중화하고, 세포를 15 mL 원뿔관에 옮긴 후 300 x g 원심분리기에서 4 °C에서 5분간 펠릿 세포로 옮깁니다.
      3. 상정액을 제거하고 세포 펠릿을 1mL의 PBS(또는 생리식염수)에 재현탁합니다. 수동 또는 자동 혈구계를 사용하여 mL당 총 세포 수를 측정합니다. 세포 현탁액을 다시 300 x g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리한 후 상원액을 제거한 뒤, 적절한 양의 PBS(또는 생리식염수)에 재현탁하여 μL당 50,000 세포를 달성합니다. 세포 현탁액을 착이식 준비 때까지 얼음 위에 올려두세요(3.5.2단계).
2. 두개내 종양 세포 이식 수술을 위한 수술 도구를 조립하고(재료표), 필요 시 오토클레이브로 멸균하세요.
3. 수술 작업 공간 준비
   1. 생물안전 캐비닛 소독: 2.2.1 단계를 참조하세요.
   2. 입체 정위 기기 준비: 입체 정위 프레임을 소독제로 청소하고 생체 안전 캐비닛에 넣으세요. 마찬가지로 입체 정위 주사기 홀더를 청소하고 소독하여 입체 정위 프레임에 부착하세요.
   3. 2.2.3.-2.2.5 단계를 수행하세요. 남은 준비 단계에 머무르기 위해서입니다.
4. 수술 전 동물 준비:
   1. 2.3.1, 2.3.2, 2.3.4, 2.3.5 단계를 수행하세요. 동물 준비를 위해서요.
5. 종양 세포 착상:
   1. 주사기 및 주입 삽입물 조립체 ( 그림 2에 요약)
      1. 플랜지가 있는 튜빙 커넥터를 최소 5분 이상 70% 에탄올에 담가세요.
      2. 멸균된 10 μL 또는 25 μL 가스 밀폐 유리 주사기의 팁을 플랜지가 있는 튜빙 커넥터의 한쪽 끝에 삽입합니다.
      3. cOFM 인퓨전 인서트의 입구를 튜빙 커넥터의 반대편 끝에 넣으세요.
      4. 주사기 주입 삽입 부품을 입체 고정 주사기 홀더에 고정하세요.
   2. 주사기 주입 삽입물 조립체에 적절한 양의 세포 현탁액을 채우세요. 예를 들어, 50,000 세포 단위 3 μL 부탁액을 투여해 총 150,000 세포 주입 시 150,000 세포를 투여합니다.
   3. 더미 인서트를 주입 인서트로 교체하기:
      1. 겸자를 사용해 cOFM 가이드와 더미 어셈블리에서 잠금 쐐기를 제거한 후, cOFM 더미를 부드럽게 가이드에서 들어 올립니다.
      2. 마이크로매니퓰레이터의 ML과 AP 조정 노브를 사용해 cOFM 가이드 위에서 주사기 주입 인서트 조립을 조작하세요. DV 조절 노브를 사용해 주입 삽입물을 cOFM 가이드에 조심스럽게 내리고, 고정 쐐기를 겸자로 단단히 다시 삽입하여 고정하세요.
   4. 주사기에서 세포 현탁액 3 μL을 분당 1 μL 속도로 주입합니다. cOFM 가이드와 주입 인서트 주변 지역을 주의 깊게 관찰하여 세포 현탁액이 조립체에서 유출되지 않도록 하세요. 전체 부피를 주입한 후에는 두개내 압력이 평형이 될 때까지 추가로 1분간 기다립니다.
   5. 인퓨전 인서트를 더미 인서트로 교체하세요.
      1. 겸자를 사용해 cOFM 가이드와 주입 인서트 어셈블리에서 잠금 쐐기를 제거한 후, 마이크로매니퓰레이터의 DV 조절 노브를 부드럽게 조절해 cOFM 주입 인서트를 가이드에서 들어 올립니다.
      2. cOFM 더미를 가이드에 끼우고 겸자로 잠금 쐐기를 다시 꽂아 고정하세요.
6. 먼저 귀바를 느슨하게 하고 제거한 뒤, 코 클램프를 풀고 당겨 동물의 앞니를 물림 차단에서 들어 올려 동물을 입체 고정 프레임에서 분리시킵니다.
7. 동물 회복 및 지원:
   1. 동물을 격리된 회수 케이지(케이지당 한 마리)로 옮기고, 약하게 설정한 온열 패드로 보충 열을 제공합니다.
   2. 선택 사항: 회복 시간을 단축하기 위해 동물에게 마취 역전제(예: 아티파메졸)를 투여할 수 있습니다. 자세한 내용은 2.13.2 단계를 참조하세요.
   3. 동물이 충분히 의식을 회복하고 흉골 누워 있을 때까지 지속적인 관찰과 지원을 제공합니다. 동물이 수술과 마취에서 완전히 회복될 때까지 동물을 혼자 두지 마세요.
   4. 동물이 완전히 회복되면 다른 동물들과 함께 공동 우리로 돌아갈 수 있습니다.
   5. 수술 다음 날에는 멜록시캄과 같은 기관에서 승인한 진통제를 투여하여 추가 진통 지원을 제공합니다(2.3.2 단계 참조).
      참고: 루시퍼레이스 양성 세포주를 사용할 경우, 세포 착상 후 1-2주 후에 생물발광 영상(BLI)을 수행하여 종양 착립 성공을 확인할 수 있습니다. 동물 털이나 머리 장착 여부와 같은 신체적 특성이 발광 감지를 방해할 수 있지만, 종양의 존재 여부에 대한 대략적인 추정에는 여전히 활용될 수 있습니다. 또는 cOFM 가이드 설치에 사용되는 앵커 스크류가 비강자성 및 MRI 호환 상태일 경우 MRI를 수행할 수 있습니다.

4. 뇌 간질액의 cOFM 샘플링

참고: 수동적 분석물 확산에 의존하기 때문에, cOFM 샘플은 내인성 ISF 환경에 비해 희석된 분석 물질 농도를 포함하고 있습니다. 이로 인해, 현장 농도를 더 잘 반영하기 위해 시료 측정을 보정하기 위한 여러 방법들이 이전에 제안^{되었습니다.} 이 절에서는 두 가지 서로 다른 표본 추출 방식을 설명합니다. 4.1단계. 제조사가 권장하는 구성 모드(이하 분획형이라고 함)를 설명하며, 이는 시간적 민감도를 높이지만 분석물 농도는 희생됩니다. 4.2단계. 우리가 개발한 대체 구성 방식(여기서는 리서큘레이션이라고 부름)을 상세히 설명하는데, 이는 시간적 해상도 감소를 대가로 분석물 농도를 높일 수 있습니다.

1. 분획 cOFM 샘플링( 그림 3A에 요약):
   1. 플랜지가 있는 튜빙 커넥터를 최소 5분 동안 에탄올에 담가서 튜빙 및 샘플링 인서트에 쉽게 부착할 수 있도록 하세요.
   2. 충분한 aCSF 투입액을 담은 퍼퓨세이트 백을 넣으세요. 예를 들어, 680 μL은 10 μL/min에서 20분 라인 플러시와 1 μL/min에서 8시간 샘플링 모두에 최소 충분합니다. 하지만 퍼퓨서트 백의 붕괴와 오작동을 방지하기 위해 최소 2mL 용량이 권장됩니다.
   3. 밀폐 유리 주사기를 사용해 적절한 양의 aCSF로 푸시와 풀 튜브 라인을 미리 채웁니다. 예를 들어, Universal Push-Pull Low-Bind 튜빙은 내경이 0.25mm이고 개별 튜빙 길이는 100cm입니다. 이는 약 2 cm당 1 μL에 해당하며, 따라서 푸시 튜빙에서는 약 55 μL, 풀 튜빙에서는 약 100 μL에 해당합니다.
   4. 그림 3A에 나와 같이 미세관류 펌프의 펌프 헤드에 연동 조절 구간을 올바르게 설치하세요.
      참고: 추가 지침은 BASi 설명서를 참고하세요.
   5. 루어 락 커넥터(그림 3A, 구성 요소 i)를 사용해 퍼퓨세이트 백을 튜빙의 푸시 섹션에 연결하세요.
   6. 플랜지가 있는 튜빙 커넥터를 사용해 샘플링 인서트를 튜빙 라인에 연결하세요. 샘플링 인서트 인렛(더 긴 샤프트 길이)은 푸시 튜빙의 출력 끝, 즉 퍼퓨세이트 백 튜브 선과 반대편에 부착되어야 합니다(그림 3A, 왼쪽 상단). 샘플링 인서트 출구(짧은 축)는 풀 튜빙의 입력 끝에 부착되어야 하며, 퍼퓨지트 백 튜브 라인과 평행하게 해야 합니다(그림 3A, 오른쪽 상단). 연결된 샘플링 인서트를 750 μL aCSF가 들어 있는 멸균 마이크로 원심분리관에 넣어 시스템 플러시 준비를 합니다.
   7. 분획 수집기 바늘을 플랜지가 있는 튜빙 커넥터로 풀 튜브 출력선(샘플링 인서트 출구의 반대 쪽 끝)에 연결합니다.
   8. 튜빙 시스템에 갇힌 가스 기포를 제거하기 위해 분당 10 μL로 20분간 세척 작업을 수행합니다.
   9. 분획 수집기 구성:
      1. 분획 수집관에 라벨 및 무게를 표시하여 각 무게에 주석을 달아 이후 비교 및 채취된 샘플 부피의 검증을 위해 사용한다. 분획 수집기 회전목마의 해당 슬롯에 진공관을 배치합니다.
      2. 분수 수집기를 켜고 원하는 값으로 설정을 설정하세요. 예시 설정으로는 샘플 #, 샘플 시간(m), 지연(시간), 리프리그 냉각, _cannula 모드 등이 있습니다.
         참고: 정착성 ISF와 접촉하지 않은 당김관 내 죽은 공간 유체 부피의 폐기는 i) 튜빙 길이와 부피(OFM-PP2-100-LB의 경우 약 2 cm/μL), ii) 유량, iii) 지연(시간)으로 근사됩니다. 이러한 매개변수들은 수집 시스템을 설정할 때 신중히 고려해야 하며, 이를 통해 적절한 분획 수집을 보장해야 합니다.
2. 재순환 cOFM 샘플링( 그림 3B에 요약):
   1. 플랜지가 있는 튜빙 커넥터를 70% 에탄올에 담가 튜브 및 샘플링 인서트에 쉽게 부착할 수 있도록 하세요.
   2. 적절한 양의 aCSF를 가스 밀폐 유리 주사기로 미리 풀어주세요.
   3. 미세관류 펌프의 펌프 헤드에 튜빙의 연동 부분을 올바르게 설치하세요.
   4. 플랜지가 있는 튜빙 커넥터를 사용해 샘플링 인서트를 튜빙 라인에 연결하세요. 샘플링 인서트 인렛(더 긴 샤프트 길이)은 풀 튜빙의 출력 끝에 부착되어야 합니다. 샘플링 인서트 출구(짧은 샤프트)는 풀 튜빙의 입력 끝에 연결되어야 합니다. 연결된 샘플링 인서트를 750 μL aCSF가 들어 있는 멸균 마이크로 원심분리관에 넣어 시스템 플러시 준비를 합니다.
   5. 튜빙 시스템에 갇힌 가스 기포를 제거하기 위해 분당 10 μL로 20분간 세척 작업을 수행합니다.
3. 회전 케이지 시스템 설치:
   참고: 라턴 시스템과 같은 회전식 동물 케이지 시스템은 푸시와 풀 튜브의 과도한 코일링과 엉킴을 방지하여 깨어 있는 동물의 cOFM 샘플링을 용이하게 합니다. 또한 깨어 있는 cOFM 채취 시 튜브를 수동으로 풀 필요가 없어, cOFM 샘플링 자동화에도 도움이 됩니다.
   1. 깨끗한 우리 침구를 회전하는 우리 바닥에 고르게 깔고, 쉽게 접근할 수 있는 음식과 물원을 설치하세요.
   2. 케이지 회전 컨트롤러를 켜고 매달린 테더를 회전시켜 작동을 테스트하세요. 케이지는 테더에 부여된 회전 방향에 대해 반대 방향으로 회전해야 합니다. 회전 컨트롤러를 동물이 테더에 고정될 때까지 대기로 설정하세요.
4. 동물을 cOFM 시스템에 연결하는 방법:
   참고: 동물을 cOFM 시스템에 연결하고 분리하는 작업은 동물이 임시 이소플루란 마취를 받을 때 가장 쉽게 수행됩니다. 올바르게 수행된다면 이 과정은 동물당 5분을 넘지 않으며; 하지만 안과 연고 사용은 강력히 권장됩니다.
   1. 동물 마취: 동물을 이소플루란 마취 유도실에 넣습니다. 마취를 시작하면 산소 흐름은 분당 2L, 이소플루란은 3%로 설정하세요. 동물이 적절한 마취 수준(숨 약 1/s의 움직임 상태)에 도달할 때까지 관찰합니다. 유도실에서 마취 마스크로 옮기고, 분당 산소 유량 2L, 이소플루란 3%로 설정하세요.
   2. 동물 재킷: 동물을 적절한 크기의 재킷에 입히고, 팔 구멍을 완전히 통과시키며, 재킷을 동물의 등에 단단히 고정합니다( 그림 3C에 표시됨).
   3. 더미 인서트를 샘플링 인서트로 교체하기: 겸자를 사용해 가이드와 더미 어셈블리에서 잠금 쐐기를 제거하고 더미를 조심스럽게 가이드에서 들어 올립니다. 샘플링을 조심스럽게 설치한 후 가이드에 삽입한 뒤, 잠금 쐐기를 다시 넣으세요.
   4. 마취에서 동물을 제거하고 회전 케이지 시스템에 넣으세요. 우리 줄을 동물 재킷에 연결하고 회전 우리 시스템을 작동시키세요.
5. cOFM 샘플링 수행:
   1. 미세관류 펌프를 5 μL/min으로 설정하고, cOFM 샘플링 인서트 설치 과정에서 생겼을 수 있는 미세기포를 제거하기 위해 2분간 플러시를 수행합니다.
   2. 미세퍼류 펌프 설정을 펌프 모드에 맞는 올바른 유량(예: 1 μL/min)으로 변경하세요.
   3. 펌프 모드를 활성화해. 분별 cOFM 샘플링을 수행할 경우, 분획 수집기를 활성화합니다.
   4. cOFM 샘플링 초기 단계에서는 가스 기포가 없는지 확인하기 위해 푸시와 풀 튜빙을 면밀히 관찰하세요. 가스 기포는 기계의 정상적인 기능과 샘플 채취를 방해하고 동물을 위험에 빠뜨릴 수 있습니다. 가스 기포가 관찰되면 시스템 부품을 중단하고, 동물을 cOFM 시스템에서 분리한 뒤, aCSF 플러시로 튜브를 통해 가스 기포를 제거합니다.
   5. cOFM 샘플링 과정 동안 cOFM 튜빙과 동물 행동을 더 자주 관찰하세요. 동물 행동이 갑작스러운 건강 변화를 나타내면 즉시 시스템 구성 요소를 중단하고 동물 건강 문제를 해결하세요. 필요하다면 기관 수의사와 상담하세요.
6. cOFM 시스템에서 동물을 분리하기:
   1. 회전식 우리 시스템을 비활성화하고 동물 재킷에서 우리 끈을 분리하세요.
   2. 샘플링 인서트와 cOFM 튜브가 연결된 상태로 동물을 이소플루란 마취 유도 챔버로 옮깁니다. 마취를 시작하면 산소 흐름은 분당 2L, 이소플루란은 3%로 설정하세요. 동물이 적절한 마취 수준(숨 약 1/s의 움직임 상태)에 도달할 때까지 관찰합니다. 유도실에서 마취 마스크로 옮기고, 분당 산소 유량 2L, 이소플루란 3%로 설정합니다.
   3. 샘플링 인서트를 더미 인서트로 교체하기: 핀셋을 사용해 가이드와 샘플링 인서트 어셈블리에서 잠금 쐐기를 제거하고, 조심스럽게 샘플링 인서트를 가이드에서 빼냅니다. 더미 인서트를 조심스럽게 가이드에 다시 끼운 뒤, 잠금 웨지를 다시 넣으세요.
   4. 재킷 제거: 동물 재킷 뒷면에서 고정 장치를 분리하고 부드럽게 재킷을 동물에서 제거합니다.
   5. 동물 회복 및 관찰: 동물을 아이소플루란 마취에서 제거하고 깨끗한 회복 케이지에 넣어 동물이 완전히 의식을 회복하고 흉골 누워 있을 때까지 지속적으로 관찰합니다. 동물이 완전히 회복되면 집 케이지로 재입양하세요.
7. 샘플 채취 및 보관:
   1. 분획 표본추출:
      1. 분획 수집관을 분획 수집관에서 제거하고 단기 운반을 위해 얼음 위에 올려놓습니다.
      2. 각 채집관을 무게로 재고 채집 전 무게와 비교하여 샘플 부피를 확인하세요.
      3. cOFM 샘플의 후속 분석으로 진행하거나 장기 보관을 위해 -80 °C 냉동고에 보관하세요.
   2. 재순환 샘플링:
      1. 풀 튜브를 cOFM 샘플링 인서트 출구(짧은 샤프트)에 연결한 채, 나머지 세팅에서 분리하여 튜브와 샘플링 인서트를 새롭고 깨끗한 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다.
      2. 멸균된 18G 바늘을 1mL에서 5mL 사이 멸균 주사기에 연결하고 공기를 채우세요.
      3. 바늘을 조심스럽게 풀 튜브 입력 끝의 플랜지가 있는 튜빙 커넥터에 꽂으세요.
      4. cOFM 샘플링 인서트가 마이크로 원심분리기 튜브 내에 머무르도록 한 후, 주사기 플런저를 눌러 공기와 함께 풀 튜브에서 재순환된 cOFM 샘플 부피를 배출합니다. 전체 cOFM 샘플이 풀 튜브에서 마이크로 원심분리관으로 배출되도록 하고, 필요하면 주사기를 분리하고 공기를 다시 채우세요.
      5. 재순환된 cOFM 샘플을 단기 운반을 위해 얼음 위에 올려두세요.
      6. 하류 분석으로 진행하거나 장기 보관을 위해 -80°C 냉동고에 보관하세요.
8. 동일한 동물에서 cOFM 샘플링을 반복할 경우 cOFM 소품 저장:
   참고: 샘플링 인서트나 입구-배출 튜브와 같은 cOFM 일회용 재사용은 제조사에서 권장하지 않습니다.
   1. cOFM 푸시풀 튜빙을 약 500 μL 무균 aCSF 또는 식염수로 분당 10 μL을 넘지 않는 속도로 세척합니다. 이어서 70% 에탄올 1-2mL를 비슷하게 세척하세요. 마지막으로, 18G 바늘과 플랜지가 달린 튜빙 커넥터가 장착된 5 또는 10 mL 주사기를 사용해 공기로 튜브를 세척하세요.
   2. 플랜지가 장착된 튜브가 장착된 가스 밀폐 유리 주사기로 50 μL 멸균 aCSF 또는 식염수로 cOFM 샘플링 인서트의 입출구 튜브를 세척합니다. 이어서 70% 에탄올 50μL 주입을 투여합니다. cOFM 샘플링 인서트를 튜빙 커넥터에서 분리하여 70% 에탄올이 채워진 바이알에 보관하여 재사용 준비가 될 때까지 보관하세요.

결과

실험 성공을 판단하기 위한 다양한 평가 지표는 기저 병리와 실험 동물 모델의 구체적인 특성에 따라 중간 또는 절정 단계에서 이루어질 수 있습니다. GBM 생물학 연구를 위해 생물발광 영상(BLI)은 cOFM 가이드 매개 종양 세포 착립의 효능을 평가하는 중간 평가 수단으로 사용할 수 있습니다(그림 4A). 그러나 이는 이식된 헤드 마운트의 물리적 특성이 동물 간 종양 크기를 비교할 때 검출된 광도를 감소시킬 수 있기 때문에, 단순한 이분법적 존재 또는 부재 종양 평가에 사용됩니다.

앞서 언급했듯이, 뇌 개방형 유동 미세관류(cOFM)는 작은 대사산물부터 큰 단백질까지 다양한 크기의 ISF 용해 분자를 광범위하게 샘플링할 수 있게 합니다. 실험적 비교는 동일한 동물 내에서(예: 치료 전/후) 또는 서로 다른 동물 간(치료된 동물과 미처리 동물 간)으로 이루어질 수 있습...

토론

이 프로토콜에서 설명된 cOFM 절차는 병리 조직의 ISF 내인성 구성 요소를 종단적으로 샘플링할 수 있어 중추신경계 질환 연구에 혁신을 가져올 잠재력을 지니고 있습니다. 그러나 이 방법론을 활용하는 연구적 성공은 여러 중요한 단계를 적절히 수행하는 데 달려 있습니다. 이 중 cOFM 가이드 캐뉼라의 올바르고 안전한 위치가 가장 중요합니다. 부적절한 수술 절차나 부착 전략은 머리 마운트 전체가 떨어져 나가고 이후 추가 연구에서 제외될 수 있습니다. 헤드 마운트 전체의 탈위는 보통 앵커 스크류 설치가 부족하거나 시멘팅 제재의 부적절한 사용으로 발생합니다. 드릴 비트 직경은 앵커 스크류의 내경과 외경 사이에 있어야 하며, 이는 앵커 스크류가 버 홀 내에 적절히 맞도록 하고, 고정에 필요한 충분한 나사 깊이를 확보할 수 있도록 합니다. 시멘팅제와 자가 부식 치과용 접착제의 부적절한 사용, 또는 유통기한 지난 시약의 사용도 헤드마운트가 두개골에 제대로 고정되지 못할 수 있습니...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.7 mm 드릴 비트	파인 사이언스 툴즈	19008-07	버홀 드릴링
1에서 5 mL 주사기	BD	#309646	순환 증류수 샘플 회수
18G 바늘	BD	#305195	순환 증류수 샘플 회수
30G 바늘	BD 울트라 파인	328438	경막 천공
4-0 비크릴 봉합사	다이나렉스	9130	수술실 폐쇄는
알코올 물티슈	피셔브랜드	22-363-750	수술 부위 피부 소독
앵커 나사	BASi	MD-1310	cOFM 헤드 마운트 배치
인공 뇌척수액(aCSF)	BASi (조안네움)	MD-2400	ISF 샘플링
cOFM 더미 삽입	BASi (조안네움)	cOFM-D- #	cOFM 헤드 마운트 배치
cOFM 가이드	BASi (조안네움)	cOFM-GD-#- #	cOFM 헤드 마운트 배치
cOFM 가이드 홀더	BASi (조안네움)	OFM-STM-1	cOFM 헤드 마운트 배치
cOFM 주입 삽입물	BASi (조안네움)	cOFM-I- #	세포 주입
cOFM 잠금 쐐기	BASi (조안네움)	cOFM-락	cOFM 헤드 마운트 배치
cOFM 샘플링 인서트	BASi (조안네움)	cOFM-S-X	ISF 샘플링
면끝 어플리케이터	피셔브레인	22363160	유체 흡수, 과산화수소 적용
CT2A 마우스 교세포종 세포주	사이프리드 연구실 - 보스턴 대학교	NA	부착된 종양 세포
치과용 시멘트제	아이보클라르	595953미국	cOFM 헤드 마운트 배치
치아 경화등	헨리 샤인	5700253	cOFM 헤드 마운트 배치
제모 크림	베트	3116875	수술 부위 제모
전기 면도기	왈 클리퍼 코퍼레이션	8841	수술 부위 제모
가는 팁이 있는 겸자	파인 사이언스 툴즈	5SF	절개, 앵커 스크류 위치
플랜지드 튜빙 커넥터	BASi (조안네움)	MD-1510	세포 주입
분획 수집 바이알	BASi (조안네움)	MF-5281	분획 샘플 저장
기밀 유리 주사기(25 & mu; L)	해밀턴	80465	세포 주입
과산화수소 (1-3%)	월그린스	NDC: 0363-0268-32	두개골 표면 세척
31G 바늘을 사용하는 인슐린 주사기(0.3에서 1.0 mL)	BD 울트라 파인	328438	마취 및 진통 투여
마이크로 원심분리기 튜브	배식스	02-682-002	순환 증류수 샘플 회수
마이크로드릴 및 입체 고정 홀더	하버드 장치	75-1874	버홀 드릴링
마우스 재킷	로미르	MJ 02	회전 우리 시스템과의 동물 연결
OFM 저결합 튜빙	BASi (조안네움)	OFM-PP2-100-LB	ISF 샘플링
OFM-펌프 - 미세관류 펌프	BASi (조안네움)	MPP102-PC	ISF 샘플링
안과 연고	데크라	211-38	수그리칼 주위 눈 윤활
패시베이티드 금속 샘플링 니들	BASi (조안네움)	MW-2310	분획 샘플 저장
퍼퓨지트 백	BASi (조안네움)	OFM-가방	ISF 샘플링
생리적 식염수 용액	중환자실 내과	0990-7983-03	두개골 표면 청소, 버홀 드릴링 보조
포비돈-요오드 면봉	PDI 헬스케어	SKU B40600	수술 부위 피부 소독
프로브 홀더	스톨팅	51633
냉장 분획 집강기	BASi (조안네움)	MD-1201	분획 샘플 저장
회전 케이지 시스템	BASi (조안네움)	AMD-R 래턴	깨어 있는 cOFM 샘플링을 위한 자동 하우징
메스 칼날과 손잡이	피셔 사이언티픽	22079693	절개
드라이버			cOFM 헤드 마운트 배치
자가 부식 치과 접착제	도쿠야마		시멘팅제를 위한 스컬 표면 프라이밍
실리콘 푸시 캡 채취 바이알을 사용해	BASi (조안네움)	MF-5283	분획 샘플 저장
스테로택틱 프레임	스톨팅	51725