생체 내에서 교모세포종(GBM)과 같은 많은 중추신경계 질환의 세포 간 통신은 측정과 특성 규명이 매우 어렵습니다. 여기서는 GBM 종단 동물 모델에서 간질성 액체 성분을 샘플링하기 위해 사용할 수 있는 뇌 개방형 유동 미세관류(cOFM) 절차를 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
중추신경계(CNS) 질환은 복잡하고 역동적인 세포 간 소통망을 통해 나타납니다. 가장 흔하고 공격적인 원발성 뇌종양인 교모세포종(GBM)은 이러한 복잡성을 상징하며, 빠른 진행과 몇 달 단위로 측정되는 암울한 예후를 보여준다. GBM의 생물학은 신생물세포와 기질 세포 간의 복잡한 신호 전달 분자 교환에 의해 구동되며, 이는 공격적인 질병 진행의 기반입니다. 여기서는 GBM 마우스 모델에서 종양 미세환경 역학을 실시간으로 종단적으로 모니터링할 수 있는 GBM 마우스 모델에서의 상세한 뇌 개방형 미세관류(cOFM) 프로토콜을 설명합니다. 우리의 접근법은 내구성이 있는 가이드 캐뉼라 헤드 마운트의 이식, 가이드를 통한 뇌내 교세포종 이식 사용, 그리고 대사 및 단백질체체 LC-MS 분석을 위한 고충실도 cOFM 샘플 수집을 설명합니다. 중요한 점은 cOFM이 전통적인 미세투석의 분자 크기 제한을 극복한다는 점입니다. GBM을 넘어, cOFM 방법론은 신경퇴행성, 간질, 신경정신과 질환 등 다양한 중추신경계 질환에 대한 변혁적 통찰을 약속하며, 해당 동물 모델 내에서 원인학적 및 치료 반응성 바이오마커를 제공할 수 있습니다.
서론
중추신경계(CNS) 질환 연구는 간질액(ISF)1,2,3,4에 의해 매개되는 복잡하고 다중형 세포간 신호 전달 때문에 매우 어렵습니다. 이러한 복잡성은 특히 교모세포종(GBM)과 같은 뇌종양에서 두드러지는데, 세포 간 신호가 신생물세포와 기질 세포 5,6,7,8,9 사이에서 전달됩니다. 많은 경우, 대사산물과 단백질 메신저를 포함한 다양한 생체분자의 비정상적인 교환이 중추신경계 병동의 근본 원인에 기여합니다. 특히 GBM에서는 ISF의 분자 구성이 시간적으로 동적이며 질병 진행 과정과 중재적 치료에 반응하여 진화한다는 점에서 이러한 연구적 도전이 더욱 심화됩니다10,11
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
이 프로토콜 내 모든 동물 시술은 노스웨스턴 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC, 프로토콜 ID: IS00021383)의 승인을 받으며, 국립보건원(NIH) 지침을 따릅니다. 이 프로토콜은 최소 8-10주 사이의 수컷과 암컷 C57BL/6J 마우스를 대상으로 개발되었습니다. 이 프로토콜에 사용된 쥐 교모종 세포주인 CT2A는 보스턴 대학교 세이프리드 연구실에서 제공되었으며, 멸균 조직 배양 조건 후 배양 및 준비되었습니다.
1. 수술 계획 및 준비
- 동물 정보: cOFM 실험에서는 완전한 성장과 발달을 위해 최소 8-10주 된 쥐를 사용하세요. 고정 두개골 임플란트는 아직 발달 중인 두개골 및/또는 뇌에서 벗어나거나 제대로 성장하는 데 방해가 될 수 있습니다.
- 외과적 좌표 선택: 동물 뇌 지도를 사용해 관심 영역의 직교 좌표를 브레그마에 대해 찾아냅니다. 예를 들어, 교모세포 이식은 일반적으로 선조체에 시행되어 자연 GBM 미세환경을 가장 잘 복제하고 이후 종양 발생의 효능을 극대화합니다. 이 프로토콜에서 사용되는 cOFM 가이드 이식 좌표는 중측(ML) = 2.5 mm, 전후측(AP) = 0 mm, 배복측(DV) = 3.5 mm....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
실험 성공을 판단하기 위한 다양한 평가 지표는 기저 병리와 실험 동물 모델의 구체적인 특성에 따라 중간 또는 절정 단계에서 이루어질 수 있습니다. GBM 생물학 연구를 위해 생물발광 영상(BLI)은 cOFM 가이드 매개 종양 세포 착립의 효능을 평가하는 중간 평가 수단으로 사용할 수 있습니다(그림 4A). 그러나 이는 이식된 헤드 마운트의 물리적 특성이 동물 간 종양 크기를 비교할 때 검출된 광도를 감소시킬 수 있기 때문에, 단순한 이분법적 존재 또는 부재 종양 평가에 사용됩니다.
앞서 언급했듯이, 뇌 개방형 유동 미세관류(cOFM)는 작은 대사산물부터 큰 단백질까지 다양한 크기의 ISF 용해 분자를 광범위하게 샘플링할 수 있게 합니다. 실험적 비교는 동일한 동물 내에서(예: 치료 전/후) 또는 서로 다른 동물 간(치료된 동물과 미처리 동물 간)으로 이루어질 수 있습.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 프로토콜에서 설명된 cOFM 절차는 병리 조직의 ISF 내인성 구성 요소를 종단적으로 샘플링할 수 있어 중추신경계 질환 연구에 혁신을 가져올 잠재력을 지니고 있습니다. 그러나 이 방법론을 활용하는 연구적 성공은 여러 중요한 단계를 적절히 수행하는 데 달려 있습니다. 이 중 cOFM 가이드 캐뉼라의 올바르고 안전한 위치가 가장 중요합니다. 부적절한 수술 절차나 부착 전략은 머리 마운트 전체가 떨어져 나가고 이후 추가 연구에서 제외될 수 있습니다. 헤드 마운트 전체의 탈위는 보통 앵커 스크류 설치가 부족하거나 시멘팅 제재의 부적절한 사용으로 발생합니다. 드릴 비트 직경은 앵커 스크류의 내경과 외경 사이에 있어야 하며, 이는 앵커 스크류가 버 홀 내에 적절히 맞도록 하고, 고정에 필요한 충분한 나사 깊이를 확보할 수 있도록 합니다. 시멘팅제와 자가 부식 치과용 접착제의 부적절한 사용, 또는 유통기한 지난 시약의 사용도 헤드마운트가 두개골에 제대로 고정되지 못할 수 있습니.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자들은 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 국립신경질환 및 뇌졸중 연구소(NINER) 연구소(NID) 보조금 1R01NS096376, 1R01NS112856, 그리고 P50CA221747뇌암 전환적 접근을 위한 SPORE(A.U.A.)의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.7 mm 드릴 비트 | 파인 사이언스 툴즈 | 19008-07 | 버홀 드릴링 |
| 1에서 5 mL 주사기 | BD | #309646 | 순환 증류수 샘플 회수 |
| 18G 바늘 | BD | #305195 | 순환 증류수 샘플 회수 |
| 30G 바늘 | BD 울트라 파인 | 328438 | 경막 천공 |
| 4-0 비크릴 봉합사 | 다이나렉스 | 9130 | 수술실 폐쇄는 |
| 알코올 물티슈 | 피셔브랜드 | 22-363-750 | 수술 부위 피부 소독 |
| 앵커 나사 | BASi | MD-1310 | cOFM 헤드 마운트 배치 |
| 인공 뇌척수액(aCSF) | BASi (조안네움) | MD-2400 | ISF 샘플링 |
| cOFM 더미 삽입 | BASi (조안네움) | cOFM-D- # | cOFM 헤드 마운트 배치 |
| cOFM 가이드 | BASi (조안네움) | cOFM-GD-#- # | cOFM 헤드 마운트 배치 |
| cOFM 가이드 홀더 | BASi (조안네움) | OFM-STM-1 | cOFM 헤드 마운트 배치 |
| cOFM 주입 삽입물 | BASi (조안네움) | cOFM-I- # | 세포 주입 |
| cOFM 잠금 쐐기 | BASi (조안네움) | cOFM-락 | cOFM 헤드 마운트 배치 |
| cOFM 샘플링 인서트 | BASi (조안네움) | cOFM-S-X | ISF 샘플링 |
| 면끝 어플리케이터 | 피셔브레인 | 22363160 | 유체 흡수, 과산화수소 적용 |
| CT2A 마우스 교세포종 세포주 | 사이프리드 연구실 - 보스턴 대학교 | NA | 부착된 종양 세포 |
| 치과용 시멘트제 | 아이보클라르 | 595953미국 | cOFM 헤드 마운트 배치 |
| 치아 경화등 | 헨리 샤인 | 5700253 | cOFM 헤드 마운트 배치 |
| 제모 크림 | 베트 | 3116875 | 수술 부위 제모 |
| 전기 면도기 | 왈 클리퍼 코퍼레이션 | 8841 | 수술 부위 제모 |
| 가는 팁이 있는 겸자 | 파인 사이언스 툴즈 | 5SF | 절개, 앵커 스크류 위치 |
| 플랜지드 튜빙 커넥터 | BASi (조안네움) | MD-1510 | 세포 주입 |
| 분획 수집 바이알 | BASi (조안네움) | MF-5281 | 분획 샘플 저장 |
| 기밀 유리 주사기(25 & mu; L) | 해밀턴 | 80465 | 세포 주입 |
| 과산화수소 (1-3%) | 월그린스 | NDC: 0363-0268-32 | 두개골 표면 세척 |
| 31G 바늘을 사용하는 인슐린 주사기(0.3에서 1.0 mL) | BD 울트라 파인 | 328438 | 마취 및 진통 투여 |
| 마이크로 원심분리기 튜브 | 배식스 | 02-682-002 | 순환 증류수 샘플 회수 |
| 마이크로드릴 및 입체 고정 홀더 | 하버드 장치 | 75-1874 | 버홀 드릴링 |
| 마우스 재킷 | 로미르 | MJ 02 | 회전 우리 시스템과의 동물 연결 |
| OFM 저결합 튜빙 | BASi (조안네움) | OFM-PP2-100-LB | ISF 샘플링 |
| OFM-펌프 - 미세관류 펌프 | BASi (조안네움) | MPP102-PC | ISF 샘플링 |
| 안과 연고 | 데크라 | 211-38 | 수그리칼 주위 눈 윤활 |
| 패시베이티드 금속 샘플링 니들 | BASi (조안네움) | MW-2310 | 분획 샘플 저장 |
| 퍼퓨지트 백 | BASi (조안네움) | OFM-가방 | ISF 샘플링 |
| 생리적 식염수 용액 | 중환자실 내과 | 0990-7983-03 | 두개골 표면 청소, 버홀 드릴링 보조 |
| 포비돈-요오드 면봉 | PDI 헬스케어 | SKU B40600 | 수술 부위 피부 소독 |
| 프로브 홀더 | 스톨팅 | 51633 | |
| 냉장 분획 집강기 | BASi (조안네움) | MD-1201 | 분획 샘플 저장 |
| 회전 케이지 시스템 | BASi (조안네움) | AMD-R 래턴 | 깨어 있는 cOFM 샘플링을 위한 자동 하우징 |
| 메스 칼날과 손잡이 | 피셔 사이언티픽 | 22079693 | 절개 |
| 드라이버 | cOFM 헤드 마운트 배치 | ||
| 자가 부식 치과 접착제 | 도쿠야마 | 시멘팅제를 위한 스컬 표면 프라이밍 | |
| 실리콘 푸시 캡 채취 바이알을 사용해 | BASi (조안네움) | MF-5283 | 분획 샘플 저장 |
| 스테로택틱 프레임 | 스톨팅 | 51725 |
참고문헌
- Shetty, A. K., Zanirati, G. The interstitial system of the brain in health and disease. Aging Dis. 11 (1), 200-211 (2020).
- Taoka, T., et al. Interstitial fluidopathy of the central nervous system: An umbrella term for disorde....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
