이종이식에서 급성 세포 및 항체 매개 거부반응을 연구하기 위한 3인 워크플로우를 가진 표준화된 마우스 모델

요약

이 연구는 급성 세포 거부 반응과 급성 항체 매개 거부 반응을 특이적으로 복제하기 위한 두 가지 표준화된 쥐 이종이식 모델을 확립합니다. 이 모델들은 이종이식 면역 거부 기전 조사, 면역억제 전략 평가, 전임상 이종이식 연구의 진전을 위한 신뢰할 수 있는 플랫폼 역할을 합니다.

초록

최근 이종이식의 발전에도 불구하고, 급성 거부 반응은 여전히 임상 적용에 있어 주요 장벽으로 남아 있습니다. 급성 세포 거부(ACR)와 급성 항체 매개 거부(AMR)는 이종 이식 수혜자에서 조기 이식 실패를 초래하는 주요 면역 반응입니다. 비인간 영장류와 유전자 변형 돼지 같은 대형 동물 모델이 귀중한 통찰을 제공했지만, 높은 비용, 윤리적 제약, 그리고 상당한 실험적 변동성으로 인해 사용이 제한됩니다. 소동물 모델은 면역 거부 반응의 기전적 연구를 위한 실용적이고 재현 가능한 대안을 제공합니다. 본 연구에서는 ACR과 AMR을 특이적으로 모방하기 위해 두 가지 표준화된 쥐 이종이식 모델이 개발되었습니다. 재현성을 보장하고 운영자 관련 변동성을 최소화하기 위해, 조립 라인 워크플로우를 가진 구조화된 3인 수술 프로토콜이 도입되어 고효율과 품질을 유지한 일관된 모델 생성이 가능해졌습니다. 결과적으로 나온 모델들은 임상적 이종이식 거부의 주요 면역병리학적 특징을 재현할 뿐만 아니라, 면역 기전을 조사하고 표적 면역억제 전략을 평가할 수 있는 견고한 기반을 제공합니다. 이 모델들은 외종이식 치료의 전임상 개발을 가속화하는 데 도움을 줄 것입니다.

서론

이종이식은 이식을 위한 기증자 장기 부족을 해결하기 위한 가장 유망한 전략 중 하나로 떠올랐습니다. 최근 몇 년간 유전자 편집 기술, 면역 조절 전략, 생의학공학의 급속한 발전으로 이 분야에 상당한 진전이 있었습니다¹. 지난 3년간 전 세계 여러 연구팀이 인간을 대상으로 한 이종 이식 임상 시험을 수행했으며, 여기에는 메릴랜드 대학교에서 유전자 변형 돼지 심장 이식 사례 두 건, 매사추세츠 종합병원에서 발생한 돼지 신장 이식 임상시험, 뉴욕 대학교에서 진행된 흉선 신장 이식 임상시험이 포함됩니다 2,3,4,5 . 이러한 전례 없는 발전에도 불구하고, 면역 거부 반응은 이종 이식의 임상 적용을 제한하는 주요 과제로 남아 있습니다. 고도로 최적화된 유전자 변형 기증 장기와 결합된 면역억제 요법에도 불구하고, 거부 반응은 여전히 큰 장애물입니다. 현재 연구에 따르면 급성 거부 반응은 이종이식에서 중요한 장애물로, 주로 급성 세포 거부(ACR)와 급성 항체 매개 거부(AMR)로 분류됩니다. ACR은 주로 T 세포에 의해 매개되며, T세포가 이식편 내에 광범위한 침투를 통해 조직 손상과 기능 장애를 초래합니다. 그 기전에는 외계유전자 항원 제시, T세포 활성화, 염증성 사이토카인 방출이 포함됩니다 ^6,7. 반면, AMR은 이미 형성되었거나 새로 생성된 기증자 특이적 항체에 의해 구동됩니다. 이 항체들은 이식편 내 내피 세포에 결합하여 보체 활성화와 강력한 면역 반응을 유발하며, 궁극적으로 미세혈관 손상, 혈전증, 이식편 실패로 이어집니다 ^8,9,10. 따라서 이러한 거부 기전에 대한 더 깊은 이해와 보다 정밀한 면역조절 전략 개발이 전임상 연구에서 장기 임상 적용으로 이종이식을 발전시키는 데 필수적입니다.

이종이식에서 급성 거부 반응이라는 문제를 해결하기 위해서는 기초 연구와 전임상 연구로 돌아가 면역학적 기전을 밝히는 것이 필수적입니다. 대형 동물 모델, 특히 비인간 영장류(NHP)와 유전자 변형 돼지는 인간과 매우 유사한 해부학적·생리학적 유사성 때문에 이종이식 연구에 널리 사용되고 있습니다. 이 모델들은 면역 거부 기전과 면역 조절 전략에 대한 중요한 통찰을 제공합니다. 하지만 높은 비용, 윤리적 고려, 장기 수술 후 관리의 복잡성으로 인해 적용이 크게 제한됩니다. 더불어, 개별 NHPs에서 면역 반응의 상당한 변동성은 실험 결과의 재현성에 영향을 미친다^{11, 12, 13}. 대형 동물 모델이 임상 번역에 필수적이지만, 실험적 실현 가능성과 일관성에 한계가 있어 비용 효율적이고 확장 가능하며 기전적으로 관련성 높은 소동물 모델이 시급히 필요함을 강조합니다.

이러한 도전 과제 속에서, 소동물 모델은 저렴한 비용, 짧은 실험 주기, 대규모 적용의 용이성 덕분에 외종이식 연구에서 점점 더 중요한 역할을 하고 있습니다. 이 모델들은 면역 거부 기전 연구를 위한 필수적인 플랫폼을 제공할 뿐만 아니라, 시험관 내 연구와 대형 동물 실험 사이의 중요한 다리 역할을 하여 면역조절 전략의 보다 정밀한 탐구를 가능하게 합니다. 본 연구에서는 ACR과 AMR을 특이적으로 모방하는 두 가지 표준화된 쥐 이종이식 모델이 확립되었습니다. 재현성과 일관성을 보장하기 위해 표준화된 3인 수술 프로토콜과 간소화된 조립 라인 모델 생성 방식을 도입했습니다. 이 표준화된 워크플로우는 수술자별 변동성을 최소화하여 매우 균일한 심장 이식 모델을 만듭니다. 이러한 개선은 기전 연구와 새로운 면역억제 전략 평가에 신뢰할 수 있는 기반을 제공합니다. 이 프로토콜은 소동물을 대상으로 한 이종이식 면역 기전과 면역억제 전략 평가를 수행하는 연구자들에게 특히 적합합니다. 저비용, 높은 재현성, 표준화된 워크플로우 등의 장점을 제공하여 이후 대형 동물 및 전임상 연구를 위한 신뢰할 수 있는 실험적 기반을 제공합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 1인 또는 3인 팀이 수행할 수 있으며, 각 구성원은 기증자 심장 채취, 수혜자 준비, 기증자 심장 문합술을 책임집니다. 전체 절차는 10분 이내에 완료되어 빠르고 고처리량이며 표준화된 모델 생성이 가능합니다.

본 연구의 동물 실험은 중국의학과학원 푸와이병원 기관동물관리 및 이용위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다(승인번호 0108-1-70-ZX(X)-41). 모든 절차는 동물 복지 규정과 윤리 지침을 엄격히 준수하여 관련 기준을 준수하도록 했습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 수술 전 준비

1. 커프 준비
   1. 이식 수술용 커프를 제작할 때 폴리이미드 튜브를 사용하세요. 동맥 커프의 경우, 내경 0.3–0.5 mm의 폴리이미드 튜브를 선택해 입체현미경(10×–20× 배율)으로 2mm 단위로 절단합니다.
   2. 각 구간의 클램프 부분을 둘레 방향으로 부분적으로 잘라 손잡이 같은 연장부를 만듭니다. 정맥 커프의 경우, 내경 0.4–0.7mm의 폴리이미드 튜브를 선택하여 3mm 단위로 절단합니다. 마찬가지로, 클램프 부분을 둘러싸여 반으로 잘라 손잡이 같은 연장부를 만드세요.
      참고: 커프를 75% 에탄올에 30분간 담근 후 일반 생리식염수로 꼼꼼히 헹구세요.
2. 마우스 준비: 신생아 10–12일 생애 Sprague-Dawley(SD) 쥐를 기증자로, C57BL/6 또는 7–8주 된 Balb/c 마우스를 수혜자로 사용합니다. 적절한 관리를 위해 스트레스를 최소화하기 위해 신생아 기증 쥐를 어미 쥐와 함께 운반하세요. 모든 동물은 특정 병원균 없는 (SPF) 환경에서 사육하세요.

2. 기증자 심장 채취

1. 고정 및 마취
   1. 신생아 쥐는 기관 에서 승인한 프로토콜에 따라 30 μL/g 트리브로모에탄올(Jitianbio, JT0781) 복막 내 주사를 통해 마취합니다.
   2. 완전히 마취가 끝나면 쥐를 등을 대고 눕히고 입체현미경 아래에 고정하세요. 포비돈-요오드에 적신 솜뭉치로 흉복부 부위를 소독하세요.
      참고: 트리브로모에탄올은 장갑과 눈 보호구를 착용한 채 통풍 구역에서 다룰 것; 피부 접촉과 흡입을 피하세요.
2. 헤파린화
   1. 포비돈-요오드에 적신 솜뭉치로 흉복부 부위를 소독하세요. 면봉으로 장을 부드럽게 옆으로 밀어 하대정맥을 드러내세요.
   2. 인슐린 주사기를 사용해 하대정맥에 헤파린화된 식염수(0.2–0.5 mL)를 주입한 후, 출혈을 막기 위해 솜으로 주사 부위를 부드럽게 압박합니다.
      참고: 헤파린화된 생리식염수를 준비하거나 주입할 때는 장갑과 안구 보호구를 착용하세요; 주사기는 날카로운 폐기물로 폐기하세요. 의료용 나트륨 헤파린 1병(125mg)을 100mL 일반 생리식염수에 녹여 헤파린화된 생리식염수를 준비합니다.
3. 심정지
   1. 횡격막을 절개하고, 흉벽을 양쪽으로 절단한 뒤 다시 젖혀 심장을 완전히 노출시킵니다. 흉선을 제거하세요. 상정맥을 절단하여 압력을 완화하고, 위스콘신 대학교(UW) 용액 1mL를 대동맥에 관류하여 심정지를 유도합니다.
   2. 심장이 붉은색에서 창백색으로 변할 때까지 계속 관류하세요. 동시에 얼음처럼 차가운 식염수에 적신 거즈 패드를 심장 위에 올려 온도를 낮추고 탈수를 예방하세요.
      참고: 멸균 거즈를 1cm 단위로 잘라× 사용 전에 얼음 식염수에 미리 담가두세요.
4. 기증자 심장 채취
   1. 상정맥과 하대정맥을 8–0 실크 봉합사로 결찰한 후 절단합니다. 대동맥궁에서 대동맥을 절단하고, 폐동맥은 분기점에서 절단하세요.
   2. 마지막으로 모든 폐정맥을 8-0 정맥으로 결찰하세요 실크 봉합 및 기증자 심장 절제. 수확한 심장은 보존을 위해 얼음처럼 차가운 식염수에 임시로 보관하세요.

3. 수혜자 준비

1. 마취
   1. 수혜자 쥐도 같은 방법으로 마취하고 안정화를 위해 등을 대고 눕히세요.
2. 소독
   1. 제모 크림을 사용해 목 부위의 털을 제거한 후 포비돈-요오드로 피부 소독을 하세요.
3. 피부 절개
   1. 안과 가위를 사용해 목 중앙선에서 오른쪽으로 약 1cm 정도 떨어진 곳에 2cm 길이의 세로 절개를 합니다. 둔기 해리를 시행하여 피하 지방과 근육층을 점차 제거하고, 하악하선을 절제합니다.
      참고: 하악하 절제 시에는 기저혈관을 8–0 실크 봉합사로 결찰하거나 전기적 소작펜으로 지져서 출혈을 방지해야 합니다.
4. 외경정맥 준비
   1. 외경정맥을 노출한 후, 저응고 모드(5–10 W)로 설정된 전기소작펜으로 가지를 개별적으로 지지합니다. 2위 8-0 정맥 원위 끝 근처에서 실크 봉합사를 하여 결찰합니다.
   2. 미세수술 가위를 사용해 두 결찰 사이의 외경정맥을 절단하세요. 외경정맥을 정맥 커프를 통해 삽입하고, 커프를 정맥 밑부분에 밀어 넣은 후 혈관 클램프로 고정하세요.
   3. 미세수술용 가위로 결찰을 제거하고, 정맥 내 잔류 혈액은 헤파린화된 생리식염수로 세척합니다. 미세수술 겸자를 사용해 외경정맥을 커프스 위로 뒤집고 8-0 고정합니다 실크 봉합사.
      참고: 전기소작 펜을 조심스럽게 사용하고 화상을 피하세요. 외경정맥에는 여러 지류가 있으며, 출혈을 최소화하기 위해 신중하게 분리하고 밀봉해야 합니다.
5. 경동맥 준비
   1. 흉쇄유돌근 뒤쪽에서 둔탁한 박리를 하여 경동맥 덮개를 찾으세요. 경동맥 덮개를 열고 총경동맥을 내경정맥과 미주신경에서 조심스럽게 분리하세요.
   2. 동맥을 정맥과 같은 방식으로 연결하고 횡단합니다. 횡단된 동맥의 하단을 동맥 커프를 통해 삽입하고, 수복 수술을 하여 고정합니다.
      참고: 경동맥, 내경정맥, 미주신경은 경동맥 덮개 안에 둘러싸여 있습니다. 칼집을 열 때는 미주신경을 손상시키지 않도록 주의해야 합니다. 경동맥은 외경정맥보다 직경이 작지만 탄력이 높아 정맥보다 외전이 더 어렵습니다.

4. 기증자 심장 문합

1. 대동맥에서 경동맥 문합
   1. 기증자 심장을 다듬은 후 즉시 수혜자의 목에 넣습니다. 8-0 렌즈를 사용하세요 기증자 대동맥 주위에 고리를 만들기 위해 느슨한 매듭을 단 실크 봉합사.
   2. 기증자 대동맥을 수혜자의 경동맥 동맥 커프 위로 밀어 넣고 8-0 호흡기로 고정하세요 실크 리가처.
      참고: 대동맥을 고정할 때는 결찰 부위와 수혜자의 혈액 간 직접 접촉을 방지하기 위해 경동맥 결찰선 위에 봉합해야 합니다.
2. 폐동맥에서 외경정맥 문합
   1. 8-0 렌즈를 사용하세요 기증 폐동맥 주위에 고리를 만들기 위해 느슨한 매듭을 단 실크 봉합사. 폐동맥을 수혜자의 외경정맥에 있는 정맥 커프에 미끄러뜨려 넣고 8-0으로 고정합니다 실크 리가처.
3. 심장 재개
   1. 수혜자의 경동맥과 외경정맥에 대한 혈관 클램프를 풀어 혈류를 회복하세요. 기증 심장이 강한 수축을 다시 시작하고 10초 이내에 빠르게 붉게 변하는 것을 관찰하세요.
4. 절개 부위 봉합
   1. 기증 심장이 안정된 리듬을 회복하면 위치를 조정하고 4-0 봉합사로 수혜자의 목 피부 절개를 봉합합니다. 수술 부위를 포비돈-요오드로 소독하세요.

5. 수술 후 관리

1. 수술 후 진통
   1. 피부 봉합이 끝난 후에는 통증 완화를 위해 리도카인 젤을 국소적으로 바르세요. 만약 마우스가 뚜렷한 통증 징후를 보일 경우, 복막 내 주사 로 멜록시캄(2 mg/kg)을 투여합니다.
      참고: 멜록시캄은 10% DMSO와 90% 옥수수유에 용해되며, 주입량은 필요한 용량을 기준으로 계산됩니다.
2. 회복
   1. 쥐를 37–38°C로 유지한 따뜻한 부드러운 패드 위에 올려 체온을 유지하고 의식을 회복할 때까지 관찰하세요. 완전히 깨어나면 쥐를 개별적으로 우리에 넣어 충분한 음식과 물을 공급하세요.
3. 모니터링
   1. 이식된 심장을 매일 육안과 촉진으로 모니터링하여 박동과 전반적인 이식편의 생존도를 평가하세요.
      참고: 모든 절차를 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하고 기관의 생물안전 및 동물 관리 규정을 준수하십시오. 실험 중 생성된 모든 화학 잔류물, 후유물, 동물 조직은 기관 규정에 따라 수집 및 폐기되어야 합니다. 트리브로모에탄올 또는 헤파린이 포함된 용액은 유해 화학 폐기물로 처리해야 하며, 동물 조직과 혈액 유래 물질은 생물학적 폐기물로 취급하여 오토클레이빙으로 멸균하거나 인증된 시설을 통해 폐기해야 합니다.

결과

그림 1 은 마우스 이종이식 모델을 생성하기 위한 표준화된 3인 협업 워크플로우를 보여줍니다. 이 시스템에서는 세 명의 운영자가 병행하여 각각 지정된 작업을 반복적으로 수행합니다: 수혜자 준비, 기증자 심장 채취, 또는 기증자 심장 문합술. 이러한 분담 덕분에 10분마다 한 개의 완전한 이식 모델이 완성됩니다. 한 명의 운영자가 약 30분 만에 하나의 모델을 완성할 수 있지만, 3인 작업 흐름은 같은 시간 내에 세 개의 모델을 완성할 수 있게 합니다. 효율성은 비슷해 보이지만 협력 워크플로우는 개별 수술 기법에 따른 변동성을 최소화하여 우수한 일관성을 제공합니다. 반면, 세 명의 외과의사가 독립적으로 전체 수술을 수행할 때는 수술자별 차이가 모델 품질과 재현성에 큰 영향을 미칩니다. 이러한 간소화되고 특정 과제별 접근법은 절차적 안정성을 높이고 대규모 표준화된 마우스 이종이식 모델 생산을 지원합니다.

토론

쥐 이종이식은 매우 침습적인 시술로, 운영자에게 높은 수준의 기술적 숙련도와 일관성이 요구됩니다. 모델 구축 과정에서 운영자는 실험 결과에 상당한 영향을 미칩니다^14,15. 1인 워크플로우에서는 절차의 복잡성과 길이로 인해 모델당 약 30분의 작업 시간이 소요되어 효율이 낮습니다. 또한, 해부학적 해리, 혈관 취급, 문합 기법에서의 개인별 차이는 이식 성공률과 이식편 생존율에 차이를 일으켜 데이터 재현성과 신뢰성에 영향을 미칠 수 있습니다. 세 명의 운영자가 독립적으로 전체 절차를 수행하더라도, 개인의 기술과 경험의 차이는 불가피한 실험적 오류를 초래할 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 3인 협력 워크플로우가 도입되었으며, 각 운영자는 기증자 심장 채취, 수혜자 준비, 기증자 심장 문합 등 특정 단계에만 집중했습니다. 이 분업 덕분에 총 시술 시간이 약 10분...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Anti-CD3 항체	Abcam	ab16669
Anti-CD68 항체	Bioss	bs-1432R
DAPI	Thermofisher	P36971
탈모 크림	Veet	-
전기 소작 펜	Yuyan 기기	-
형광 2차 항체	Thermofisher	A-11008
HE 염색 키트	Beyotime	C0105S
제빙기	Shjingmi	IMS-20
인슐린 주사바늘	KDL	U-40
리도카인 젤	Tide Pharm
멜록시캄	Sigma-Aldrich	444800
미세 수술용 클립	ZHENHAO	FS217
미세 수술용 바늘 홀더	BIOFIVEN	HH01231
미세 수술 가위	ZHENHAO	FS237
정액 식염수	Kelun 제약	-
폴리이미드 튜브	광저우 완리신 금속 제품 유한공사	-	내경: 0.3-0.5 mm
폴리이미드 튜브	광저우 완리신 금속 제품 유한공사	-	내경: 0.4-0.7 mm
포비돈-요오드 용액	INOHV	-
헤파린 나트륨	천홍 바이오-제약	-
스테레오 현미경	Murzider	MSD204
수술용 봉합사	진환 메디컬	8-0 및 4-0 실크 봉합사
수술 온열 패드	Hani Pet	-
트리브로모에탄올	지티안바이오	JT0781
위스콘신 대학 용액	Belzer	-
혈관 클램프	RWD 라이프	R31005-10