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방법 논문

백색 및 갈색 지방 이식편: 흑색 및 황갈색 완장(BTBR) 비만 마우스의 생식, 대사 및 신장 결핍을 교정하기 위한 접근 방식

1K 조회수

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DOI:

10.3791/68759

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2025년 9월 9일

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1Albert Einstein Research and Education Institute, Hospital Israelita Albert Einstein, 2School of Medicine, Faculdade Israelita de Ciências da Saúde Albert Einstein, 3Nephrology Division, Federal University of São Paulo

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서 우리는 당뇨병 및 비만 BTBR 마우스의 신장 기능을 개선하면서 난임, 비만 및 고혈당증을 역전시키는 유망한 전략을 제공하는 흰색 및 갈색 지방 조직 이식 프로토콜을 제시합니다.

초록

백색지방조직(WAT)과 갈색지방조직(BAT)의 이식은 외인성 제제의 지속적인 투여 없이 대사 장애를 역전시키기 위한 유망한 치료 전략으로 부상했습니다. WAT는 에너지 항상성에 관여하는 핵심 내분비 기관으로 기능하는 반면, BAT는 체온 조절에 중요한 열 발생 조직입니다. BTBR(Black and Tan Brachyuric) 비만 마우스 모델은 고혈당증, 인슐린 저항성, 대사 저하 및 난임력을 포함하여 비만, 제2형 당뇨병(T2DM) 및 당뇨병성 신장 질환(DKD)의 주요 특징을 밀접하게 모방합니다.

아래에 제시된 프로토콜을 사용하여 BTBR 야생형 및 이형접합 기증자로부터 유래한 WAT와 BAT를 BTBR 비만 수용자에게 병용 이식하면 난임력의 역전, 체중 증가의 감쇠, 혈당 조절의 정상화 및 신장 매개변수의 개선이 이루어졌습니다. 특히, 신장 비대와 세포사멸이 감소한 반면 족세포 수는 보존되었습니다. 이러한 발견은 WAT와 BAT 이식의 병용이 DKD와 비만을 완화하는 데 동시적인 이점이 있는 T2DM 치료를 위한 대체 치료 전략을 나타낼 수 있음을 시사합니다. 또한, 이 접근법은 사육대 콜로니 내에서 생존 가능한 BTBR 비만 마우스의 수를 늘리는 데 도움이 될 수 있습니다. 기본 메커니즘에 대한 추가 조사는 이 개입의 임상적 번역을 촉진할 수 있습니다.

서론

당뇨병성 신장 질환(DKD), 제2형 당뇨병(T2DM) 및 비만은 중대하고 증가하는 글로벌 건강 문제를 제기하는 상호 관련된 다인성 상태를 나타냅니다. 신장 손상의 다른 식별 가능한 원인이 없는 상태에서 당뇨병(DM)과 만성 신장 질환이 공존하는 것으로 정의되는 DKD는 DM 환자의 약 20-40%에 영향을 미칩니다 1,2. T2DM은 만성 고혈당증과 포도당, 지질 및 인슐린 항상성 장애를 특징으로 하는 전신 대사 장애입니다. 이는 전 세계적으로 10대 주요 사망 원인 중 하나이며 현재 5억 명 이상의 개인에게 영향을 미치고 있습니다3. 에너지 섭취와 소비 사이의 만성적인 불균형으로 인한 비만은 현재 전 세계적으로 8명 중 1명에게 영향을 미치고 있으며 이환율과 사망률 모두에 주요 원인입니다4. 이 세 가지 조건은 밀접하게 연결되어 있습니다: 비만은 T2DM 발병 위험을 현저하게 증가시키고, 이는 차례로 DKD의 위험을 크게 증가시킵니다 1,4. 비만, T2DM 및 DKD의 전 세계적으로 유병률이 증가함에 따라 병태생리학적 메커니즘에 대한 더 깊은 이해와 효과적인 치료 전략 개발이 시급히 필요합니다.

BAT 이식은 비만과 제2형 당뇨병을 퇴치하기 위한 유망한 치료 전략으로 부상했습니다. 이 개입은 체중 감소, 인슐린 저항성 및 간 지방증의 개선, 순환 아디포넥틴, β3-아드레날린성 수용체 발현 및 지방산 산화에 관여하는 유전자의 증가와 관련이 있습니다5. 참고로 포유류 지방 조직은 색상에 따라 흰색, 갈색, 베이지색의 세 가지 주요 유형으로 분류할 수 있습니다6. WAT는 출생 직후 확장되기 시작하며 몸 전체에 널리 분포합니다. 이는 순환하는 포도당과 유리 지방산을 격리하여 과도한 에너지를 중성지방 형태로 저장하는 핵심 내분비 기관 역할을 합니다6. 대조적으로, BAT는 에너지를 ATP6으로 저장하는 것이 아니라 떨리지 않는 열 발생을 통해 열로 방출함으로써 체온 조절에 중요한 역할을 합니다. BAT 활성은 나이, 비만 및 DM에 따라 감소합니다. 성인의 경우 BAT는 전체 지방 조직의 작은 부분을 구성하며 주로 인간의 쇄골상 및 경추 부위에 위치한 반면, 생쥐에서는 주로 견갑간 부위에 위치합니다6. 미토콘드리아가 풍부한 BAT는 상당한 양의 포도당과 지방산을 섭취하며 체중 증가에 대한 저항성과 관련이 있습니다7. 새로운 증거는 더 날씬하고 대사적으로 더 유리한 표현형을 촉진하는 BAT의 역할을 뒷받침하여 이식을 통한 치료 사용에 대한 관심이 높아지고 있습니다.

WAT에서 주로 분비되는 호르몬인 렙틴은 에너지 균형, 신진대사 및 생식력을 조절하는 데 중심적인 역할을 합니다8. 중추신경계에 작용하여 시상하부에서 성선 자극 호르몬 방출 호르몬(GnRH) 분비를 자극하고, 이후 뇌하수체 전엽에서 황체 형성 호르몬(LH)과 난포 자극 호르몬(FSH)의 방출을 촉진합니다9. 렙틴은 또한 난소 테카 및 과립막 세포에 직접 작용하여 난포 발달을 지원합니다9.

유전적으로 BTBR로 지정된 BTBRob/ob (BTBR 비만) 마우스 모델. Cg-Lep ob/WiscJ(검은색 및 황갈색, 비만, 술; 재료 표 참조)는 렙틴 유전자(Lep)의 자발적인 기능 상실에 대해 동형접합체이며 고혈당증, 포도당 불내성, 고인슐린혈증, 고중성지방혈증, 상처 치유 장애, 저대사, 저체온증 및 저성선자극성 성선기능저하증으로 인한 난임. 남성은 일반적으로 생후 6주에 T2DM이 발생하는 반면 여성은 8주에 발생합니다10. 고혈당증은 심각하고 진행성이며 공복 혈당 수치가 10주까지 400mg/dL을 초과합니다. 또한, BTBR 비만 남성은 8주차까지 시간 의존적 알부민뇨를 나타내며, 메산지움 확장 및 족세포뇨증을 포함하여 조직학적으로 명백한 DKD로 진행됩니다. 이러한 특징은 BTBR 비만 마우스를 인간 DKD10을 밀접하게 요약하는 강력한 전임상 모델로 확립합니다.

렙틴 결핍의 심각한 대사 결과를 감안할 때 렙틴 대체 요법 및 지방 조직 이식을 포함하여 산부인과 표현 형을 역전시키기 위한 몇 가지 전략이 조사되었습니다. 대부분의 연구에서는 C57BL/6 배경에서 ob/ob 마우스를 사용했지만, 대사적으로 더 손상된 BTBR 균주에서 이러한 개입을 조사한 연구는 상대적으로 적습니다. C57BL/6 ob/ob 마우스에서 WAT 이식은 인슐린 수치를 정상화하고 인슐린 감수성을 개선하며 생식력을 회복하는 것으로 나타났습니다8. 또한, 마른 C57BL/6 마우스에 대한 BAT 이식은 특히 고지방 식이 유발 비만의 맥락에서 체중 증가를 예방하고 내당능 및 인슐린 감수성을 개선하는 동시에 인슐린 저항성을 감소시키는 것으로 입증되었습니다11. 또한 BAT 이식은 심장 혈역학과 대사 건강을 개선하는 것으로 나타났습니다12. 고무적인 결과에도 불구하고 이러한 연구는 몇 가지 중요한 한계를 제시합니다. 대부분의 연구는 C57BL/6 ob/ob 마우스에서 수행되었으며, 이는 더 심각하게 영향을 받은 BTBR ob/ob 균주에 비해 상대적으로 가벼운 대사 표현형을 나타냅니다. 결과적으로, 인슐린 저항성, 고혈당증, 비만 및 신장 질환이 더 뚜렷한 모델에 대한 이러한 발견의 일반화 가능성은 제한적입니다. 더욱이, 렙틴 대체 및 지방 조직 이식의 효과는 BTBR 배경에서 충분히 연구되지 않았으며 이는 문헌에서 중요한 격차를 나타냅니다. 이러한 개입 중 다수는 마른 동물이나 단기간에 걸쳐 평가되었으며, 이는 인간 대사 질환의 복잡성과 만성 특성을 적절하게 포착하지 못할 수 있습니다. 인슐린 감수성, 내당능 및 생식력의 개선이 보고되었지만 근본적인 메커니즘은 잘 이해되지 않았으며 이러한 발견이 임상 환경에 대한 중개 관련성은 여전히 불확실합니다. 특히, BTBR ob/ob 마우스에서 백색 및 갈색 지방 조직 이식의 결합된 대사 효과는 대부분 탐구되지 않은 상태로 남아 있습니다.

이 연구의 목적은 BTBR 비만 마우스에서 WAT 및 BAT 병용 이식을 위한 프로토콜을 표준화하고 생식력 회복, 신장 기능 및 조직학적 변화에 미치는 영향을 평가하는 것입니다. 두 번째 목표는 사육장에서 이형접합(BTBR ob/+) 및 야생형(BTBR +/+) 마우스의 손실을 줄이면서 BTBR 비만 콜로니의 확장을 촉진하는 것입니다.

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프로토콜

모든 실험은 이스라엘리타 알버트 아인슈타인 병원(HIAE)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 브라질 SP 상파울루에 있는 유대인 연구 및 교육 연구소(N°. 3309-18 및 N°. 4900-21)에 등록되었습니다. 사용된 시약 및 장비에 대한 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

참고: BTBR 비만 마우스(렙틴 유전자 녹아웃, 동형접합체, ob/ob)를 T2DM, DKD 및 비만의 모델로 사용했습니다. 4-5주 된 암컷 BTBR 비만 마우스가 지방 조직 이식의 수혜자 역할을 했습니다. 기증자 동물은 암컷 BTBR ob/+ (이형접합) 또는 +/+ (야생형) 마우스(유전자형은 확인되지 않았지만 표현형은 마른)였습니다. 이식 당시 수혜자 마우스의 평균 체중은 25 내지 32g 범위였습니다. 모든 동물은 음식과 물에 대한 임의의 접근, 12시간의 빛/암흑 주기 및 주변 온도 조절이 가능한 표준 조건에서 개별적으로 환기되는 케이지에 수용되었습니다. 우리당 최대 5마리의 동물이 수용되었습니다.

1. 수술 절차

  1. 100% v/v 이소플루란 과다 복용(2.5-5%)을 사용하여 기증자 마우스를 안락사시킨 후 자궁경부 탈구를 시킨다(그림 1A).
  2. 동물을 등쪽으로 눕히고(배를 위로) 자세로 놓고 0.5% 알코올성 클로르헥시딘 디글루코네이트로 하복부를 소독합니다. 사타구니 WAT를 채취하기 위해 2-3cm 정중선 복부 절개를 합니다(그림 1B). 절제된 조직을 얼음 위의 3mL 튜브에 넣습니다.
  3. 동물을 복부 누운 자세(배 아래로)로 재배치하고 견갑골 사이에 1-2cm 정중선 절개를 하여 견갑간 BAT를 수확합니다(그림 1C). 10-14명의 기증자의 지방 조직을 풀링합니다. 총 WAT + BAT가 수혜자 체중의 10-15%와 같은지 확인합니다.
  4. 16G 바늘과 3mL 주사기를 사용하여 WAT와 BAT를 별도로 균질화합니다(그림 1D).
  5. 분석 저울을 사용하여 최종 지방 중량을 측정하고(그림 1E) 이식할 때까지 샘플을 얼음 위에 보관합니다.
  6. 100% v/v 이소플루란 챔버(2.5-5% 유도)에서 수혜자 BTBR 비만 마우스를 마취하고 안면 마스크(1.5-2.5%) 를 통해 마취를 유지합니다. 호흡이 3초마다 ≤1회 호흡으로 감소하면 동물을 복부 누운 자세로 눕힙니다(그림 1F).
  7. 2.0% 비알코올성 클로르헥시딘 디글루코네이트를 사용하여 등쪽 부위를 소독합니다(그림 1G).
  8. 등쪽 표면의 6-26개 부위에 걸쳐 16G 바늘을 사용하여 부위당 100-200μL의 균질화된 지방을 주입합니다. 집게를 사용하여 분배를 돕습니다. 이식 후 각 주사 부위에 0.5% 클로르헥시딘 용액을 도포합니다(그림 1H).
  9. 진통을 위해 트라마돌(40mg/kg; 50mg/mL 용액)을 근육 주사하고 회복 중 부상을 방지하기 위해 동물을 개별적으로 집에 넣습니다.
  10. 다음날 0.5% 클로르헥시딘 용액으로 주사 부위를 세척하고 트라마돌을 두 번째 용량으로 투여합니다.

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그림 1: 지방 이식 절차의 개략도. (A) 밀폐된 상자에 이소플루란을 사용한 기증자 안락사. (B) 사타구니 WAT의 수확. (C) 견갑간 BAT 수확. (D) 지방 균질화. (E) 지방 계량. (F) 수혜자 마취. (G) 백 무균. (H) 겸자 보조 기술을 사용한 지방 주입. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 이식 후 짝짓기

  1. 이식 2주 후, 짝짓기를 위해 암컷 BTBR 비만 마우스와 수컷 BTBR ob/+(이형접합) 마우스를 공동 수용합니다.

3. 기능 평가

  1. 분석 저울을 사용하여 매주 체중을 측정합니다.
  2. 4-7주, 8-10주, 14-16주, 18-20주 및 24-26주의 5개 시점에서 혈당계를 사용하여 공복 혈당을 평가합니다.
  3. 소변 샘플을 수집하기 위해 동물을 물에 접근할 수 있는 대사 우리에 6시간 동안 넣습니다.
  4. ELISA 방법을 사용하여 소변 알부민 수치를 측정하고 6-8주에 비색 피크르산 방법을 사용하여 소변 크레아티닌 수치를 결정합니다. 알부민 농도(μg)를 크레아티닌 농도(mg)로 나누어 소변 알부민 대 크레아티닌 비율(uACR)을 계산합니다.

4. 형태학적 분석

  1. 24주령에 100% v/v 이소플루란 과다 복용(2.5-5%)을 투여한 후 자궁경부 탈구를 투여하여 수혜자 마우스를 안락사시켜 사망을 보장합니다.
  2. 생후 24주에 난소, 신장 및 췌장을 수집합니다.
  3. 수확한 장기를 10% 중성 완충 포르말린에 넣고 실온에서 24-48시간 동안 고정합니다.
  4. 고정 후 자동 조직 프로세서를 사용하여 조직을 처리하여 물을 제거하고 조직학적 분석을 위해 파라핀에 포매합니다.
    1. 조직을 다음 에탄올 용액에 각각 1시간 동안 순차적으로 담그십시오: 70%, 85%, 95%(2x) 및 100%(2x).
    2. 조직을 신선한 자일렌으로 1시간 동안 옮긴 다음 추가로 1시간 동안 두 번째 자일렌 수조를 옮깁니다.
    3. 용융된 파라핀 왁스에 조직을 6°C에서 1시간 동안 담근 다음 신선한 파라핀으로 옮겨 1시간 더 합니다.
    4. 용융된 파라핀으로 채워진 가열된 금형에 조직의 방향을 잡고 실온에서 응고시킵니다.
    5. 마이크로톰을 사용하여 각 블록에서 4개의 비연속 3.5μm 두께 절편을 절단합니다. 리본을 4°C 수조에 띄워 평평하게 만든 다음 개별 섹션을 양전하를 띤 유리 슬라이드에 장착합니다. 여분의 물을 배출하고 슬라이드를 3°C 온난판에 60분 동안 놓습니다.
  5. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 사용하여 난소의 난포 수와 췌도 크기를 평가합니다.
    1. 파라핀 포매 조직 슬라이드를 6°C의 오븐에서 1시간 동안 배양합니다. 슬라이드를 신선한 자일렌이 담긴 용기로 옮기고 30분 동안 배양하여 파라핀을 용해시키고 15분 후에 자일렌을 신선한 용액으로 교체합니다.
    2. 슬라이드를 자일렌:에탄올 혼합물, 100% 에탄올, 85% 에탄올 및 70% 에탄올에 각각 30초 동안 순차적으로 담그십시오.
    3. 수돗물로 헹구고(10초), 해리스 헤마톡실린에 염색하고(30초), 95% 에탄올에 담그십시오(3초).
    4. 슬라이드를 70%, 85%, 100% 에탄올 및 자일렌:에탄올 혼합물에 각각 30초 동안 순차적으로 담급니다.
    5. 슬라이드를 신선한 자일렌에 5분 동안 담근 다음 두 번째 자일렌 수조를 추가로 5분 동안 담가 염색 고정을 보장합니다.
    6. 장착 매체를 사용하여 커버슬립으로 슬라이드를 장착합니다.
  6. 신장 절편의 PAS(Periodic Acid-Schiff) 염색을 사용하여 사구체 크기와 메산지움 기질 확장을 평가합니다.
    1. 슬라이드를 6°C에서 1시간 동안 배양하고 신선한 자일렌에 5분 동안 담가 조직 절편을 탈파라핀화합니다.
    2. 슬라이드를 각각 30초 동안 99%, 95% 및 70% 에탄올에 순차적으로 담급니다.
    3. 수돗물에 10초 동안 헹굽니다.
    4. 요오드산 10방울을 바르고 10분 동안 배양합니다.
    5. 흐르는 물에 3분 동안 헹구고 말립니다.
    6. Schiff 시약 10방울을 넣고 어두운 챔버에서 15분 동안 배양합니다.
    7. 흐르는 물에 3분 동안 헹구고 말립니다.
    8. 해리스 헤마톡실린 10방울을 첨가하여 대대염색하고 3분 동안 배양합니다.
    9. 흐르는 물에 슬라이드를 3분 동안 헹구고 말립니다.
    10. 슬라이드를 70%, 85%, 100% 에탄올 및 자일렌:에탄올 혼합물에 각각 30초 동안 순차적으로 담급니다.
    11. 슬라이드를 신선한 자일렌에 5분 동안 담근 다음 두 번째 자일렌 수조를 추가로 5분 동안 담가 얼룩을 고정합니다.
    12. 장착 매체를 사용하여 커버슬립으로 슬라이드를 장착합니다.
  7. 면역조직화학(IHC)으로 난소와 신장의 난포 세포사멸(절단된 카스파제-3)과 신장의 족세포 수(WT-1+ 세포)를 평가합니다.
    1. 슬라이드를 6°C에서 1시간 동안 배양한 후 30분 동안 자일렌 처리합니다(15분 후 자일렌 교체).
    2. 슬라이드를 100%, 90% 및 70% 에탄올과 물(각각 30초)에 순차적으로 담급니다.
    3. 항원 부위를 마스킹하기 위해 마이크로파를 사용하여 95°C에서 12분 동안 구연산염 완충액(pH 6.0)에서 슬라이드를 가열하여 항원 회수를 수행합니다.
    4. 1x 세척 완충액으로 15분 동안 헹구고 5분마다 완충액을 교체합니다.
    5. 소 혈청 알부민(BSA)을 사용하여 백그라운드 염색을 피하고 비특이적 결합을 방지하기 위해 과산화수소로 내인성 과산화효소를 차단합니다.
      참고: 절단된 카스파제-3 염색의 경우, 7분 30초 동안 내인성 과산화효소 활성을 차단합니다. WT-1 염색의 경우 5분 동안 차단합니다.
    6. 4.7.4에서와 같이 세척을 반복합니다.
    7. 절단된 카스파제-3(세포사멸) 및 WT-1(족세포)에 대한 1차 항체 10μL를 적용합니다. 어둡고 가습된 챔버에서 °C에서 밤새 배양합니다.
    8. 4.7.4에서와 같이 세척을 반복합니다.
    9. 10μL의 양 고추냉이 과산화효소(HRP) 접합 2차 항체를 실온에서 어두운 곳에서 1.5시간 동안 도포합니다.
    10. 4.7.4에서와 같이 세척을 반복합니다.
    11. 10μL의 DAB(3,3'-디아미노벤지딘)를 발색원으로 적용하여 HRP 활성을 시각화하여 갈색 침전물을 생성합니다.
      참고: 절단된 카스파제-3 염색의 경우, DAB와 함께 1분 30초 동안 배양합니다. WT-1 염색의 경우 45초 동안 배양합니다.
    12. 4.7.4에서와 같이 세척을 반복합니다.
    13. 원하는 강도에 따라 30초에서 1분 동안 Harris 헤마톡실린으로 대변염색 절편을 만듭니다.
    14. 수돗물로 1-2분 동안 또는 물이 맑아질 때까지 헹굽니다.
    15. 슬라이드를 70%, 85%, 95% 및 100% 에탄올(각각 30초) 및 자일렌:에탄올 혼합물(30초)에 순차적으로 담그십시오.
    16. 슬라이드를 신선한 자일렌 용액에 5분 동안 놓고 추가로 5분 동안 두 번째 자일렌 수조로 옮깁니다.
    17. 장착 매체를 사용하여 커버슬립으로 슬라이드를 장착합니다.
  8. 40배 배율의 도광현미경을 사용하여 염색된 절편을 분석합니다. 자동화된 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 각 장기에 대한 관심 영역(ROI)을 선택합니다.
    1. 난소(H&E): 섹션별로 난포 유형을 계산하고 분류합니다.
    2. 췌장(H&E): ROI 도구를 사용하여 섬을 선택하여 각 췌섬의 윤곽을 수동으로 추적합니다. ROI가 정의되면 소프트웨어는 자동으로 면적을 제곱 마이크로미터(μm2) 단위로 계산합니다.
    3. 신장(H&E): ROI 도구를 선택하여 사구체 영역을 정량화하여 각 사구체 다발의 바깥쪽 가장자리를 수동으로 추적합니다. 면적 측정 기능을 사용하여 면적을 μm2 단위로 구합니다. 추적 후 소프트웨어는 자동으로 면적을 μm2 단위로 계산합니다.
    4. 신장(PAS)
      1. 메산지움 기질을 정량화하려면 임계값 도구를 사용하여 사구체 내의 PAS 양성(자홍색/분홍색) 영역을 식별하고 선택합니다. 필요에 따라 색상 및 강도 임계값을 조정하여 PAS 염색 영역을 정확하게 선택하고 미리보기 창을 사용하여 선택을 미세 조정합니다. 선택한 PAS 영역을 ROI로 정의합니다. 추적 후 소프트웨어는 자동으로 면적을 μm2 단위로 계산합니다.
      2. 전체 사구체 면적에 대한 PAS 양성 면적의 백분율을 계산하여 중막 기질 확장을 정규화합니다.
    5. 난소 및 신장(절단된 카스파제-3에 대한 IHC)
      1. 여포 또는 사구체 구조에 해당하는 ROI를 선택합니다. 컬러 마스크를 적용하여 색조, 채도 및 강도 임계값을 조정하여 DAB 양성(갈색) 염색을 식별합니다. 미리보기 기능을 사용하여 DAB 신호를 정확하게 선택하고 임계값 설정을 개선하여 헤마톡실린(파란색) 대조염색 및 비특이적 배경을 배제합니다.
      2. 원하는 임계값이 정의되면 선택 항목을 ROI로 설정하고 DAB 양성 면적(μm2)을 측정합니다. DAB 양성 면적을 총 ROI 면적으로 나누고 100을 곱하여 염색 면적의 백분율을 계산합니다.
    6. 신장(WT-1+의 경우 IHC): 사구체당 갈색으로 염색된 핵을 계산하여 족세포 수를 추정합니다.
      참고: 섹션당 난포 수(평균 ± SD)는 BTBR 비만(7.7 ± 3.11), 이식(5.8 ± 3.24), BTBR 마른(4.6 ± 5.62)이었습니다. 섹션당 섬 수(평균 ± SD)는 BTBR 비만(18.3 ± 8.42), 이식(9.7 ± 5.45), BTBR 마른(6.8 ± 1.72)이었습니다. 사구체 면적 및 메산지움 기질 확장 측정을 위해 동물당 30개의 사구체를 평가합니다. 데이터는 적절하게 평균 ± 표준 편차(SD) 또는 평균의 표준 오차(SEM)로 표현되었습니다. 정규성은 Shapiro-Wilk 테스트를 사용하여 평가되었습니다. 정규 분포 그룹 간의 비교를 위해 Tukey의 사후 검정을 사용한 일원 분산 분석을 적용했습니다. 반복 측정은 양방향 ANOVA 또는 혼합 효과 모델을 사용하여 분석되었으며 필요한 경우 Geisser-Greenhouse 보정이 적용되었습니다. 비정규 분포 데이터의 경우 Sidak의 다중 비교를 사용한 Kruskal-Wallis 테스트가 사용되었습니다. 통계적 유의성을 p < 0.05로 설정하여 적절한 통계 소프트웨어를 사용하여 모든 분석을 수행합니다(자세한 내용은 재료 표 참조).

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결과

이식된 지방의 양과 프로토콜 효과
프로토콜 표준화 후, 2개의 지방 이식량(기증자 체중에 비해 5-9.9% 및 10-15%)의 효과에 대해 평가되었으며, 이는 생존 가능한 자손을 낳는 적어도 한 번의 임신을 달성하는 것으로 정의되었습니다. 5-9.9% 그룹은 23.8%의 성공률을 보인 반면, 10-15% 그룹은 52.2%를 달성하여 프로토콜 효과가 2.2배 증가했습니다 (그림 2A). 조직 구성과 관련하여 그림 2B 는 BAT가 총 주입 지방의 25%를 구성했을 때 100%에 도달하여 BAT 함량이 높을수록 효과가 비례적으로 증가하는 것을 보여주었습니다.

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토론

이 연구는 WAT와 BAT 병용 이식이 고혈당증 조절, 체중 증가 및 섬 세포 비대 예방, 여성 난임 회복, 세포사멸 감소 및 족세포 수 보존을 통한 신장 기능 개선을 위한 효과적인 치료 접근법임을 보여줍니다.

이전 연구에서는 포도당 항상성 및 인슐린 감수성을 조절하고11, 심장 기능을 개선하고12,13, 비만 예방5,8, 생식력을 회복8 또는 DKD14를 개선하기 위한 전략으로 WAT 및 BAT 이식을 조사했지만, B6과 같이 T2DM, DKD 및 비만의 경미한 표현형을 가진 마우스 ...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

실험 및 외과 훈련 센터(CETEC)와 유대인 연구 및 교육 연구소(IIEP)의 기술팀의 지원에 감사드립니다. 이 작업은 CAPES(Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior/Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel)에서 SB에 대한 석사 연구 펠로우십 보조금, CAPES(Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior/Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel)에서 MLF에 대한 직접 박사 연구 펠로우십 보조금의 지원을 받았습니다. FAPESP(Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo/São Paulo Research Foundation; no. 2024/08173-6)에서 MOM에 석사 연구 펠로우십 보조금, FAPESP(Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo/São Paulo Research Foundation; no. 2019/12636-3)에서 M.T.A.B-R. 이 작업은 또한 FAPESP(Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo/São Paulo Research Foundation; no. 2017/23195-2 및 no. 2021/02216-7) 및 EFSD(European Foundation for the Study of São Paulo)의 보조금으로 지원되었습니다. 저자는 이 원고에서 인공 지능(AI)으로 생성된 저작물을 사용하지 않았음을 선언합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.5% 알코올 클로르헥시딘 디글루콘네이트 용액리오쿠&아큐트; 마이카SKU 1068253
16게이지 바늘벡턴 디킨슨SKU 305198
2.0% 무알코올 클로르헥시딘 디글루콘네이트 용액리오쿠&아큐트; 마이카SKU 1113045
3 mL 주사기벡턴 디킨슨SKU 309657
Accu-Check 스트립 & ndash; 퍼포마로슈이4015630981960
알시안 블루 PAS 키트이지패스SKU EP-11-20019
소 혈청 알부민 (BSA)시그마-올드리치A4612
셀센스 소프트웨어올림포스셀센스
시트레이트 버퍼 pH 6.0: 구연산 단수화물 + 수산화나트륨시그마-올드리치C1909 + 28-3010
절단된 카스파제-3 항체세포 신호 전달 기술9661
코바스 C 111 분석기로슈4528778001
크레아티닌 K실험실 테스트96-300
엔비전 FLEX DAB+ 크로모젠애질런트-다코K3468
엔비전 FLEX /HRP 감지 시약애질런트-다코SM802
상상해 보세요 FLEX 페옥시다아제 차단 시약애질런트-다코SM801
엔비전 FLEX 기판 버퍼애질런트-다코SM803
EnVision FLEX는 버퍼가 20배였습니다애질런트-다코K800721-2
이오신애질런트-다코CS701
글로맥스 디스커버 마이크로플레이트 리더프로메가GM3000
혈당계 정각 검사 - Performa로슈4015630980512
GraphPad 프리즘 8 소프트웨어 (통계 소프트웨어)Dotmatics의 그래프패드-
100% v/v 이소포린(이소플루란)크리스토와 아케트; 리아-
헤마톡실린애질런트-다코CS700
IX51 광각 현미경올림포스IX51
단일 마우스용 대사 케이지테크니플라스트3600M021
장착 매체 - 엔텔란시그마-올드리치100869
마우스 알부민 ELISA 키트앱캠AB207620
마우스 품종: BTBR. CG-레포브/위스코치JAX 연구소4824
주기산 쉬프(PAS) 키트이지패스EP-11-20014
RM255 미세토름라이카 바이오시스템14050237960
TP1020 조직 프로세서라이카 바이오시스템TP-1020
트라마돌 50 mg/mL그르우움; 넨탈4022444
WT-1 항체산타크루즈SC-192

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