연구 논문

비소세포폐암 돌연변이의 정밀 검출을 위한 미세액방울 디지털 중합효소 연쇄반응

DOI:

10.3791/68770

⸱

2025년 7월 29일

 ,  ,  ,  , 
1The 2nd Department of Thoracic Surgery, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University

이 논문에서

요약

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여기에서는 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응(ddPCR)을 사용하여 EGFR T790M 돌연변이를 민감하고 특이적으로 검출하는 프로토콜을 제시하며, 이는 G719S, L858R, L861Q 및 S768I와 같은 다른 종양 돌연변이를 신속하게 식별하도록 확장될 수도 있습니다.

초록

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전 세계적으로 폐암은 계속해서 암 관련 사망의 주요 원인이며, 유병률은 신장암에 이어 두 번째입니다. 비소세포폐암(NSCLC)은 보고된 모든 폐암 사례의 약 80-85%를 차지합니다. EGFR 유전자의 T790M 돌연변이는 표피 성장 인자 수용체 티로신 키나제 억제제(EGFR-TKI)에 대한 후천적 내성의 널리 알려진 주요 결정 요인입니다. 이 상태의 존재는 진행성 질병을 겪고 있는 사람들의 약 50-60%에서 관찰되었습니다. 따라서 EGFR 유전자에서 T790M 돌연변이를 검출하기 위한 신속하고 반응성이 높은 접근법의 구현은 비소세포폐암의 신속한 식별에 필수적입니다. 본 연구에서는 qPCR의 감도(1 × 102 copies /μL)보다 10배 높은 검출 한계로 T790M 돌연변이를 검출하기 위해 ddPCR을 사용하였다. 15개의 시뮬레이션 샘플에 대해 ddPCR은 EGFR 유전자에서 T790M 돌연변이의 존재를 검출할 수 있었으며, 이는 qPCR을 사용하여 분석했을 때 감소된 수준으로 관찰되었습니다. 빠른 검출 방법에 의한 EGFR 유전자 내부의 T790M 돌연변이를 검출하여 적합성을 결정하기 위해 조사되고 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

폐암은 전 세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인이며 전체적으로 두 번째로 널리 퍼진 악성 종양입니다. 비소세포폐암(NSCLC)은 보고된 모든 폐암 사례의 약 80%에서 85%의 대다수를 차지합니다1,2,3,4. EGFR 돌연변이가 있는 진행성 NSCLC 진단을 받은 환자의 경우, 확립된 치료 접근법에는 1세대, 2세대 또는 3세대 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 티로신 키나제 억제제(TKI)의 적용이 포함됩니다5,6,7. 그러나 1세대 또는 2세대 EGFR-TKI로 치료받은 대부분의 환자는 결국 약물에 대한 후천적 내성을 갖게 됩니다. 이러한 내성은 질병 진행을 경험하는 환자의 약 50-60%에서 발견되는 EGFR 유전자의 T790M 돌연변이의 존재에 자주 기인합니다 8,9,10,11,12.

전통적으로 조직 샘플에서 종양 DNA의 유전적 이상은 형광 제자리 혼성화(FISH) 또는 차세대 시퀀싱(NGS)13,14과 같은 기술을 사용하여 식별됩니다. 그러나 조직 생검은 종양 접근성 불가, 환자 건강 악화 또는 종양 세포 함량 부족으로 인해 어려울 수 있습니다 15,16,17. 대안으로, 특히 혈장에서 액체 생검은 순환 종양 DNA(ctDNA)를 검출하여 드라이버 돌연변이를 식별하는 덜 침습적인 방법을 제공합니다. 종양 세포는 DNA를 혈류, 흉막액, 타액 또는 대변으로 흘려보내 유전자 분석을 위한 귀중한 소스를 제공합니다18,19. ctDNA의 유전적 프로필은 종종 종양의 유전적 구성을 반영하여 정확한 진단과 맞춤형 암 치료를 위한 중요한 요소인 종양 이질성에 대한 포괄적인 시각을 제공합니다20,21.

시퀀싱, 실시간 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR), 디지털 PCR, 변성 고성능 액체 크로마토그래피(DHPLC), 증폭 불응성 돌연변이 시스템(ARMS) 및 돌연변이 농축 PCR(ME-PCR)을 포함하여 말초 혈액에서 EGFR 돌연변이를 식별하는 다양한 기술 중에서 미세액방울 디지털 PCR(ddPCR)은 ctDNA 돌연변이 검출을 위한 매우 효과적인 도구로 부상했습니다22,23. 뛰어난 감도, 정밀도 및 높은 정확도로 저풍부 돌연변이를 감지하는 능력이 차별화됩니다. 기존 PCR과 달리 ddPCR은 샘플을 수천 개의 액적으로 분할하여 표준 곡선 없이 표적 DNA 서열의 절대 정량화를 가능하게 합니다. 따라서 EGFR의 T790M 돌연변이와 같은 희귀 돌연변이를 검출하는 데 매우 적합합니다. ddPCR의 장점에도 불구하고 광범위한 임상 적용은 샘플 준비, 시스템 최적화 및 qPCR과 같은 확립된 기술과의 비교 성능 분석의 문제로 인해 제한되었습니다. ctDNA 돌연변이 검출을 위한 ddPCR 프로토콜을 최적화하는 데는 특히 임상 채택에 필수적인 민감도, 특이성 및 재현성과 관련하여 중요한 격차가 존재합니다.

이 연구에서 우리는 ddPCR이 기존 qPCR 방법에 비해 ctDNA에서 EGFR T790M 돌연변이를 검출하는 데 우수한 민감도와 신뢰성을 제공한다는 가설을 세웁니다. 우리는 효율성을 높이기 위해 핵산 추출 공정을 최적화한 후 돌연변이 검출을 위한 ddPCR 최적화에 중점을 두었습니다. 또한 시뮬레이션된 샘플을 사용하여 민감도, 특이성 및 재현성 측면에서 ddPCR과 qPCR 성능을 비교했습니다. ddPCR의 잠재력을 체계적으로 평가함으로써 우리는 액체 생검에서 EGFR 돌연변이 검출을 위한 qPCR에 대한 실행 가능하고 우수한 대안으로 확립하는 것을 목표로 합니다.

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프로토콜

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이 연구에는 인간 참가자, 인간 조직 또는 살아있는 동물 실험이 포함되지 않았습니다. 따라서 공식적인 윤리적 승인이 필요하지 않았습니다. 모든 절차는 기관 및 국가 지침에 따라 수행되었습니다. T790M 돌연변이 플라스미드는 상업적으로 합성되었습니다. 임상 샘플을 시뮬레이션하는 데 사용되는 돼지 혈액은 살아있는 동물의 개입 없이 동물 복지 규정에 따라 인증된 공급업체로부터 얻었습니다. 마그네틱 비드, 프라이머, 프로브 및 PCR 효소를 포함한 다른 모든 시약은 상업적으로 공급되어 제조업체의 지시에 따라 사용되었습니다.

핵산 추출
핵산 추출은 마그네틱 비드 추출 키트와 전자동 핵산 추출기 기기를 사용하여 수행되었습니다. 표준 절차에는 200 μL의 샘플과 20 μL의 Proteinase K를 사전 포장된 딥웰 플레이트의 컬럼 1 또는 7에 추가하는 것이 포함되었습니다. 그런 다음 키트와 함께 제공된 15μL의 마그네틱 비드를 컬럼 2 또는 8에 첨가했습니다. 추출 프로그램은 자기 슬리브를 지정된 위치에 배치하여 기기에서 시작되었습니다. 추출 후, 컬럼 6 또는 12의 액체를 새로운 1.5mL 뉴클레아제 프리 튜브로 옮기고 -20°C에서 보관했습니다.

저농도 표적 핵산의 추출을 최적화하기 위해 최적화 실험을 수행했습니다. 권장되는 추출 매개변수는 용해 온도 70°C, 용해 시간 10분, 세 가지 세척액 각각에 대해 1분, 건조 2분, 56°C에서 용출 3분이었습니다. 가장 영향력 있는 매개변수는 체계적으로 최적화되었습니다: 용해 온도(62°C, 66°C, 70°C, 74°C 및 78°C), 용해 시간(1, 3, 5, 7 및 9분) 및 마그네틱 비드 크기(100nm, 200nm, 300nm, 400nm, 500nm 및 1000nm). 이러한 최적화는 1 × 105 copies/μL에서 T790M 돌연변이 플라스미드를 사용하여 수행되었습니다. 100nm 마그네틱 비드는 추출 키트와 함께 제공되었으며 다른 입자 크기는 생명 공학 회사에서 얻었습니다. 추출된 샘플의 qPCR 증폭 곡선과 Ct 값을 분석하여 각 추출 조건의 효율성을 평가했습니다. 이러한 결과의 통계 분석은 통계 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다.

표준 플라스미드 DNA
EGFR 유전자의 T790M 돌연변이 플라스미드는 생명공학 회사에서 맞춤 합성했습니다. 4마이크로그램의 건조 플라스미드 분말을 100μL의 1x TE 완충액에 재현탁했습니다. 플라스미드 농도는 분광 광도계를 사용하여 측정되었습니다. 마이크로리터당 복제 수는 다음 공식을 사용하여 계산되었습니다: 복제 수/μL = [(6.02 × 1023) × (DNA 농도(ng/μL) × 10-9)] / (염기쌍의 DNA 길이 × 660). 합성된 단편의 농도는 1.26 × 109 copies/μL였습니다. 그런 다음 이 스톡 플라스미드를 126배 희석하여 1 × 108 copies/μL의 작동 농도를 얻었습니다.

프라이머 설계 및 합성
EGFR T790M 돌연변이에 대한 프라이머 및 TaqMan 프로브는 표준 프라이머 설계 원칙에 따라 Primer 6을 사용하여 설계되었습니다. 업스트림 프라이머: 5'-CCTCACCTCCACCGTGC-3'; 다운스트림 프라이머24 : 5'-AGGCAGCCGAAGGGCA-3'; 프로브: 5'-FAM-AGCTCATCACGCAGCTCA-BHQ1-3'. 모든 프라이머와 프로브는 상업용 올리고뉴클레오티드 합성 서비스에 의해 합성되었습니다.

ddPCR 및 TaqMan 형광 정량 검출 시스템 구축 및 최적화
ddPCR 및 qPCR 시스템 최적화 실험에 사용하기 위해 1× TE Buffer를 사용하여 1 × 108 copies/μL의 T790M 플라스미드 스톡을 1 × 106 copies/μL로 희석했습니다.

ddPCR 시스템의 최적화: ddPCR 시스템은 효소 제조업체의 권장 사항에 따라 최적화되었습니다. 초기 권장 시스템에는 4x PCR 믹스 7.5μL, 업스트림 프라이머 1.2-3μL(10μM), 다운스트림 프라이머 1.2-3μL(10μM), 프로브 0.3-1.8μL(10μM), DNA 주형 1-15μL, 최종 부피 30μL의 뉴클레아제가 없는 물이 포함되었습니다. 권장되는 증폭 주기는 95°C에서 초기 10분, 이후 94°C에서 30초, 55-65°C에서 60초의 40주기를 포함했습니다. 어닐링 온도(55-61.8°C), 프라이머 농도(1-3μL), 프로브 농도(0.75-1.75μL) 및 템플릿 농도(3-15μL)를 체계적으로 최적화했습니다. 최적화 결과는 통계 소프트웨어를 사용하여 통계적으로 분석되었습니다.

qPCR 시스템의 최적화: qPCR 시스템은 효소 제조업체의 권장 사항에 따라 최적화되었습니다. 초기에 제안된 시스템에는 Taq 중합효소 5μL, 250mM MgCl2 0.45μL, 순방향 프라이머 0.5-2.5μL(10μM), 역방향 프라이머 0.5-2.5μL(10μM), 프로브 0.5-2.5μL(10μM), DNA 샘플 5μL, 최종 부피 25μL의 뉴클레아제가 없는 물이 포함되었습니다. 권장 증폭 프로그램은 95°C에서 5분이었습니다. 이어서 95°C에서 15초, 56-64°C에서 30초의 45주기, 56-64°C에서 형광 수집. 어닐링 온도(56-64°C), 프라이머 농도(1-3μL), 프로브 농도(0.5-2.5μL) 및 주형 농도(1-5μL)를 최적화했습니다. 이러한 결과의 통계 분석은 통계 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다.

ddPCR 및 Taqman 형광 정량적 PCR 감도 테스트
ddPCR 대 qPCR의 민감도를 평가하기 위해 1 × 108 copies/μL T790M 플라스미드를 1x TE Buffer를 사용하여 연속적으로 10배 희석하여 106 내지 101 copies/μL 범위의 농도 구배를 생성했습니다. ddPCR의 경우, 최적화된 ddPCR 시스템에 따라 음성 대조군을 포함하여 각 농도에 대해 하나씩 7개의 반응 용액을 준비했습니다. 샘플을 미세액 발생기 칩에 로드하고 액적 생성 기기로 처리하여 미세액적을 생성했습니다. 그런 다음 이 물방울을 PCR 열 순환기를 사용하여 증폭한 다음 디지털 PCR 검출 장비로 분석했습니다. 동시에 최적화된 qPCR 시스템을 기반으로 동일한 템플릿으로 7개의 반응 용액을 준비했습니다. 이들은 두 가지 접근법의 각각의 민감도를 평가하기 위해 실시간 PCR 기기에서 실행되었습니다(n = 3).

ddPCR 반복성 테스트
반복성을 평가하기 위해 표준 T790M 플라스미드 DNA를 1 × 108 copies/μL로 희석하여 고농도(1 × 106 copies/μL), 중간(1 × 104 copies/μL) 및 저농도(1 × 102 copies/μL) 농도 표준물질을 생성했습니다. 최적화된 ddPCR 시스템에 따라 6개의 반응 용액을 준비했습니다. 샘플을 미세액 발생기 칩에 로드하고 액적 생성 기기로 처리하여 미세액적을 형성했습니다. 그런 다음 미세 물방울을 열 순환기를 사용하여 증폭하고 디지털 PCR 검출 장비로 분석했습니다. 음성 대조군이 포함되었습니다. 실험은 세 번으로 수행되었습니다. 재현성은 증폭 프로파일을 비교하고 3개의 실험 반복에서 변동 계수(CV) 값을 계산하여 평가되었습니다.

아날로그 샘플 테스트
T790M 돌연변이 ddPCR 및 qPCR 시스템의 신뢰성을 테스트하기 위해 각각 고농도 및 저농도의 T790M 돌연변이 표준 플라스미드와 무작위로 혼합된 돼지 혈액을 사용하고, 혼합 표준 플라스미드가 없는 돼지 혈액을 음성 샘플로 사용하고 15개의 시뮬레이션 샘플을 무작위로 준비하고 시뮬레이션 샘플에서 핵산을 추출했습니다. 각각 ddPCR 및 qPCR 방법을 사용하여 검출합니다.

통계 분석
모든 실험은 최소 3번의 기술적 반복으로 수행되었습니다. 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시됩니다. 통계 분석은 GraphPad Prism 10 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 그룹 간의 차이는 적절하게 Student's t-test 또는 ANOVA(one-way analysis of variance)를 사용하여 분석되었습니다. 0.05 미만의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

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결과

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핵산 추출 최적화
EGFR T790M 돌연변이를 검출하기 위한 ddPCR 기반 워크플로우는 그림 1에 개략적으로 요약되어 있습니다. 먼저 최적의 용해 온도를 결정했습니다. 그림 2A에서 볼 수 있듯이 66°C의 절단 온도는 가장 작은 평균 Ct 값을 산출하여 가장 효율적인 절단을 나타냅니다. 따라서 후속 실험을 위해 66°C를 선택했습니다. 다음으로, 결정된 최적 온도인 66°C에서 용해 시간을 최적화했습니다. 그림 2B 는 7분의 절단 시간이 다른 기간에 비해 가장 낮은 평균 Ct 값을 초래하여 7분을 최적의 절단 시간으로 설정했음을 보여줍니다. 마지막으로, 최적화된 용해 조건(66°C 절단 온도 및 7분 절단 시간)에서 다양한 마그네틱 비드 입자 크기를 평가했습니다. 그림 2C ...

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토론

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폐암은 전 세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인으로서 항상 의학 연구의 초점이었습니다. 이 연구에서 우리는 폐암의 진단, 치료 및 예후에 대한 더 깊은 통찰력을 제공하는 것을 목표로 폐암의 여러 중요한 측면을 탐구합니다. 폐암의 정확한 진단과 치료의 초석은 정확한 유전자 검사입니다. Zhao et al.25에서 입증한 바와 같이, 전통적인 유전자 검사는 고품질 조직 샘플에 크게 의존하며 비용과 시간이 많이 소요됩니다. 주석이 없는 딥 러닝 인공 지능 접근 방식을 사용하여 팀이 개발한 DeepGEM 모델은 폐암 유전자 검사에 새로운 방향을 제시하여 종양 유전자 돌연변이와 공간 분포를 보다 정확하고 시의적절하며 비용 효율적으로 예측할 수 있게 합니다25. 이번 성과는 폐암 연구에서 기존 진단 및 치료 과정을 최적화하기 위한 학제간 기술적 접근 방식을 적극적으로 모색해야 함을 시사합니다.<...

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공개 사항

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저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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윈난성 과학기술부와 쿤밍의과대학 응용기초연구공동특기프로젝트, 202101AY070001-134

저자 기여
Youming Lei와 Guoli Lv는 이 작업에 동등하게 기여했으며 공동 제1저자입니다. Youming Lei와 Guoli Lv가 연구를 구상하고 설계했습니다. Qingmei Yang은 데이터 수집 및 분석에 기여했습니다. Jin Duan과 Yunfei Shi는 데이터 분석 및 해석을 감독하고 원고를 수정하고 최종 버전을 출판하도록 승인했습니다. 모든 저자는 최종 원고를 읽고 승인했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1× TE BufferSangon BiotechB548144DNA 희석에 사용되는 Tris-EDTA 완충액
4&배; Unimix-U 효소 믹스타겟팅원바이오 UNIMIXU-4XddPCR 효소 믹스
A300 고속 열 순환기롱진(LongGeneA300PCR 증폭
바이오칩 분석기SEED 바이오디지털PCR-바이오칩디지털 PCR용 바이오칩 검출 시스템
마커 시료 전처리 기기이 바이오 바이오 디지털디지털 PCR 플랫폼 TD-2마이크로 액적 준비
마그네틱 비드 핵산 추출 키트LemnisCare TechnologyMXP-1005핵산 추출
미세액방울 발생기 칩타겟팅One BiotechMG-Chip-01ddPCR용 미세액방울 생성에 사용
NanoDropAllshengNC-500샘플 추출 후 핵산 농도 측정
NanoDrop ND-500 분광 광도계Allsheng 기기ND-500DNA 정량화용 분광 광도계
PCR 기기 A300 고속 열 순환기LongGeneA300PCR 증폭용 열 순환기
머 및 TaqMan 프로브Sangon BiotechT790M 검출용 맞춤형 합성 프라이머 및 TaqMan 프로브
qPCR 기기 Gentier miniTianlong TechnologyGentier miniReal-time PCR 기기
T790M 돌연변이 플라스미드Tsingke 생물학T790M표준 곡선 및 검출 한계 테스트
) 드롭 신 프라이

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