방법 논문

MASLD 마우스에서 간세포의 분리 및 배양을 위한 간단한 프로토콜

DOI:

10.3791/68782

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2025년 7월 18일

 ,  ,  , 
1Department of Endocrinology, The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China, 2Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China

이 논문에서

요약

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이 연구는 대사 기능 장애 관련 지방간 질환(MASLD) 마우스에서 원발성 간세포를 분리하기 위한 표준화된 프로토콜을 수립하여 인공 지질 로딩 없이 지방증 및 대사 기능 장애에 대한 질병 관련 연구를 가능하게 합니다. 이 방법은 기계론적 및 치료적 연구에 적합한 고수율 및 고생존성 간세포를 생성합니다.

초록

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간세포 내 병리학적 지질 축적(지방증)을 특징으로 하는 대사 기능 장애 관련 지방성 간 질환(MASLD)은 전 세계적으로 중대하고 증가하는 건강 부담을 나타냅니다. 1차 마우스 간세포 배양은 MASLD 발병 기전 및 치료 개입을 규명하는 데 필수적인 생체 외 모델 역할을 합니다. 그러나 지방성 간에서 고품질 간세포를 안정적으로 분리하는 것은 기술적으로 여전히 어렵습니다. 여기에서는 콜라겐분해효소 관류 기법을 사용하여 MASLD 마우스에서 원발성 간세포를 효율적으로 분리하기 위한 간단한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 팔미테이트 및 올레산 보충제를 통한 인공 유도 없이 고유한 지방증을 나타내는 간세포를 생성하므로 생리학적으로 더 관련성이 높은 표현형을 보존합니다. 이 프로토콜은 생존력이 높고 순도가 높은 간세포를 생성하며 MASLD 마우스에서 다량의 간세포를 분리하는 데 보편적으로 적용할 수 있습니다. 또한 약리학적 평가 또는 유전 중재 연구에 적합합니다. 요약하면, 당사는 MASLD에 대한 새로운 치료 표적 및 약물의 발견을 촉진하기 위해 다운스트림 세포 생물학적 연구를 위해 고수율, 고순도 및 생존력이 높은 간세포를 분리할 수 있는 재현성 있는 프로토콜을 제공합니다.

서론

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대사성 역기능 관련 지방성 간질환(MASLD)은 간세포에 병리학적 지질이 축적되는 것이 특징이며, 전 세계적으로 가장 흔한 만성 간 질환이다1. MASLD는 전 세계 성인 인구의 38%에 영향을 미치는 것으로 추정되며 인간의 건강에 심각한 위협이 되고 있습니다2. MASLD의 기전은 완전히 밝혀지지 않았으며 치료 옵션은 매우 제한적입니다. MASLD에 대한 새로운 치료 표적을 발견하고 표적 제제를 개발하는 것은 중요한 임상적 요구가 되었습니다. 간을 구성하는 우세한 세포 유형인 간세포는 포도당-지질-약물 대사의 주요 부위입니다. 1차 간세포는 간세포 세포주보다 간세포의 기능을 더 완전하게 유지하며, 간 질환 메커니즘 및 약물 개발을 연구하는 데 유용한 도구이다3. 지방간을 가진 마우스에서 원발성 간세포를 분리하고 배양하는 것은 지질 대사, 인슐린 저항성 및 염증 반응을 포함한 간 병태생리학을 연구하기 위한 기본 기술입니다. 지방간 질환의 쥐 모델로부터 간세포 분리를 위해 확립된 이전 프로토콜은 정상 및 지질 축적 간세포 집단을 모두 특이적으로 분리할 수 있도록 구배 원심분리를 사용했습니다. 따라서 이러한 분리된 지질이 함유된 간세포는 지방간 질환 병리생물학을 조사하기 위한 중요한 체외 모델 시스템을 구성합니다3. 이 접근법의 주요 목표는 질병 특이적 표현형 특성을 유지하여 in vitro에서 MASLD를 모방할 수 있는 생존력이 높고 수율이 높은 간세포를 쉽고 경제적으로 얻는 것입니다.

생쥐에서 간세포 분리를 위한 일반적인 절차는 행크의 균형 잡힌 염 용액(Hank's Balanced Salt Solution, HBSS)과 같은 등장성 관류 용액으로 간에서 혈액을 씻어내는 것으로 시작하여 콜라겐 분해 효소가 함유된 소화 용액을 사용하여 간을 소화하는 2단계 과정으로 구성됩니다. 최근 간 관류 및 효소 소화 기술의 발전으로 암컷 마우스에서 1차 간세포의 수율과 생존력이 향상되었습니다4. 완충액 조성 최적화 및 분해 시간 단축과 같은 기존 2단계 콜라겐분해효소 관류 방법의 개선은 지방간 샘플에 대한 실험 프로토콜을 조정하는 데 매우 중요했습니다. 원발성 간세포는 MASLD와 심장대사 합병증의 기저에 있는 병태생리학적 기전을 규명하는 데 필수적인 모델로서, 특히 내피 매개체와 혈관신생 인자를 통해 심장-간 누화 및 간-혈관 축 상호작용을 매개하는 역할을 한다 5,6. 이러한 세포는 MASLD, 만성 신장 질환 및 허혈성 심장 질환7 간의 임상적 연관성에 의해 입증된 바와 같이 질병 진행을 주도하는 다중 장기 통신 네트워크에 대한 중요한 통찰력을 제공하는 동시에 대사 증후군의 간 및 심혈관 증상을 모두 다루는 표적 치료법을 개발하기 위한 생리학적으로 관련된 플랫폼을 제공합니다. 현재 MASLD에 대한 체외 연구는 주로 팔미트산/올레산(PA/OA) 자극 정상 간세포 또는 인간 간세포 세포주(예: HepG2 및 Huh7)에 의존하고 있는데, 이는 질병 상태에서 지방세포 간세포의 병태생리학적 특징을 부적절하게 복제하여 심장-간-혈관 상호 작용 연구를 위한 번역 관련성을 제한합니다. 이 접근법은 MASLD 진행의 만성 대사 기능 장애, 염증성 미세환경 및 질병 특이적 장기 간 누화 특성을 포착하지 못합니다.

이 프로토콜은 팔미트산 및 올레산 처리를 인위적으로 추가할 필요 없이 MASLD 마우스에서 간세포를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 결론적으로, 우리는 MASLD에 대한 새로운 치료 표적 발견 및 약물 개발을 지원하기 위해 다운스트림 세포 생물학 연구에 적합한 우수한 생존력을 가진 고수율 간세포를 얻기 위한 간단하고 재현 가능한 방법을 제시합니다.

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프로토콜

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모든 실험 단계는 중국 과학기술대학교(University of Science and Technology)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 이 연구에서 수컷 C57BL/6J 마우스는 12주 이상 동안 고지방 식단(HFD, #12492, Research Diet)을 먹였습니다.

1. 콜라겐으로 코팅된 배양 플레이트 또는 접시의 준비

  1. 15mL 100% EtOH를 35mL의 이중 증류 H2O(ddH2O)에 첨가합니다. 30% EtOH에 콜라겐 I 유형 50 μg/mL 용액을 준비합니다. 멸균 0.22μm 필터 팁이 있는 필터.
  2. 세포 배양 플레이트 또는 접시에 cm당 30μL의 콜라겐 용액을 코팅합니다2. 실온(RT)에서 1시간 동안 배양합니다.
  3. 피펫으로 여분의 액체를 제거하고 배양 플레이트나 접시를 건조시킵니다. 살균을 위해 코팅된 접시에 자외선을 0.5시간 동안 조사합니다. 4 °C에서 1 개월 미만 보관하십시오.
    참고: UV 램프의 파장은 254nm이고 UV 강도는 400mw/m2 이상입니다. 콜라겐 코팅된 접시에서 UV 램프 소스의 거리는 1m입니다.

2. 관류 용액의 준비

  1. 간세포를 분리하기 며칠 전에 표 1에 명시된 간세포 분리 시약과 배양 배지를 준비합니다. 멸균 0.22μm 필터 팁이 있는 필터 관류 용액 A 및 B. 4 °C에서 1 개월 미만 보관하십시오. 수조를 준비하고 온도를 37 °C로 설정하십시오.
  2. 관류 용액 A와 B를 37°C의 수조에서 예열합니다. 수술 전에 80mL의 관류 용액 B에 40mg의 콜라겐분해효소 IV형을 첨가합니다.
  3. RT에서 연동 펌프를 사용하여 5분 동안 4mL/분의 속도로 75% EtOH를 펌핑합니다. 펌프 튜브를 75% EtOH에서 예열된 관류 용액 A로 전환합니다.
    알림: 그림 1A에 표시된 구성에 따라 가열된 순환 충전 장치를 조립합니다.

3. 외과적 절차

  1. 승인된 방법을 사용하여 마우스를 마취합니다. 펜토바르비탈 나트륨(50mg/kg)을 복강내 주사합니다. 계속하기 전에 회전 반사 상실을 확인하십시오.
  2. 마우스의 상지와 하지를 해부판에 고정합니다. 75% 알코올로 수술 부위를 소독합니다.
  3. 해부 기구를 사용하여 복부 내부와 외부 막을 절단합니다. 면봉으로 내장 기관을 마우스의 왼쪽으로 회전시켜 하대정맥(IVC)과 간문맥(PV)을 노출시킵니다.
  4. 면봉으로 하대정맥을 눌러 부풀립니다. 하대정맥과 평행하게 22G의 내주 바늘을 삽입합니다.
  5. 내주 바늘의 철 부분을 빼냅니다. 카테터를 하대정맥에 그대로 둡니다. 0.22μm 필터 팁이 있는 관류 라인에 니들을 연결합니다.
    참고: 내주 바늘은 철 바늘 부분과 플라스틱 카테터 부분으로 구성됩니다. 하대정맥에 정확한 삽입을 확인하고 내주바늘에 혈액이 채워질 때까지 기다립니다. 내주 바늘에서 모든 기포를 제거하십시오. 혈전증을 피하기 위해 전체 절차를 신속하게 완료하십시오.
  6. 관류 속도를 관류액 A의 5mL/분으로 설정합니다. 관류를 시작하고 간이 부풀어 오를 때까지 관찰합니다. 즉시 문맥을 잘라내십시오.
  7. 면봉을 사용하여 간을 부드럽게 마사지하여 혈액을 철저히 씻어냅니다. 간이 흙빛이 나는 노란색으로 변할 때까지 관류를 계속하십시오.
  8. 0.05% 콜라겐분해효소 IV형을 함유한 관류액 B로 전환합니다. 간이 완전히 소화될 때까지 관류를 계속하십시오.
    참고: 간이 소화되기 위해 마우스 당 최소 10분이 소요됩니다. 콜라겐 분해 효소가 함유 된 80mL의 관류 용액 B는 한 마리의 쥐가 간을 소화하기에 충분합니다. 간 조직은 최대한의 연화에 도달할 때까지 완전한 효소 소화를 거치며, 캡슐로 둘러싸인 실질은 기계적 파괴에 취약한 극도의 취약성 상태에 도달합니다.
  9. 마우스의 복부에서 간을 제거하십시오. DMEM이 들어있는 10cm 접시에 간을 놓습니다.
  10. 생물 안전 캐비닛에서 진행하십시오. 핀셋을 사용하여 간을 가루로 잘게 썰어줍니다(소화가 잘되는 간은 간세포를 쉽게 방출합니다).
  11. 70μm 메쉬 필터를 가로질러 현탁액을 멸균 50mL 원심분리 튜브로 여과합니다. DMEM 배지를 사용하여 부피를 45mL(마우스당)로 조정합니다.
  12. 50 × g 에서 4분 동안 원심분리기. 상층액을 완전히 붓습니다.
  13. DMEM 배지를 사용하여 펠릿을 최종 부피 25mL(마우스당)로 재현탁합니다. 50 × g 에서 2분 동안 다시 원심분리기를 사용합니다.
  14. 상층액을 완전히 붓습니다. 10% FBS가 보충된 25mL의 배양 배지에 펠릿을 재현탁합니다.
  15. 현탁액을 철저히 혼합하십시오. 계산을 위해 Trypan blue로 세포를 염색합니다. 즉시 배양 접종을 진행하십시오.
    참고: 웰당 2 × 105 세포를 포함하는 배지 2mL를 콜라겐으로 코팅된 6웰 접시에 넣습니다. 세포 접종 2시간 후 DMEM 배지를 교체합니다.

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결과

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현재 프로토콜은 12주 이상 HFD를 먹인 수컷 C57BL/6J 마우스에 구현되었습니다. 분리된 1차 간세포는 형태와 기능을 검사했습니다. 우리는 약 40g의 마우스 간에서 분리당 평균 2 × 107 개의 세포를 얻었습니다. 세포 생존율은 살아있는 세포의 Calcein AM 염색에 의해 85%-86% 사이로 결정되었습니다. 각 다이어트 유도 비만(DIO) 마우스 분리의 수율은 15개의 표준 6웰 플레이트를 시딩하기에 충분했습니다. 그림 1B-G는 DIO 마우스에서 1차 간세포 분리 및 배양의 대표적인 결과를 그래픽으로 보여줍니다. 약력학 및 간 병태생리학 연구에서 마우스 간세포가 널리 사용되는 것을 감안하여, 우리는 약리학적 및 생물학적 반응 프로파일링을 통해 분리된 세포의 지질 저하 효능을 구체적으로 평가했습니다.

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토론

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생존 가능한 마우스 간세포의 분리에는 혈액 성분을 제거하기 위해 등장성 용액을 사용하여 철저한 혈관 관류로 시작하는 중요한 2단계 절차와 활성 콜라겐분해효소 용액 9,10으로 제어된 효소 분해가 포함됩니다. 성공적인 분리는 공정 전반에 걸쳐 최적의 생리학적 조건, 특히 안정적인 온도(37°C) 및 pH(7.2-7.4)의 관류 용액을 유지하는 데 달려 있으며, 이러한 매개변수는 세포 생존력을 직접 결정하기 때문에 11,12. 초기 관류 중 완전한 혈액 제거는 효과적인 후속 조직 소화를 위해 필수적입니다. 효소 단계에서는 활성이 검증된 새로 제조된 콜라겐분해효소가 필요하며, 세포 무결성을 보존하면서 완전한 조직 해리를 달성하기 위해 분해 시간을 신중하게 조절해야 합...

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공개 사항

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저자는 잠재적인 이해 상충을 보고하지 않았습니다.

감사의 글

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이 연구는 중국 국립자연과학재단(National Natural Science Foundation of China)[No. 82373967]의 지원을 받았다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
50 mL 멸균 원심분리기 튜브Nest602052
항-HNF4&알파 항체ImmunowayYM8517
항-IgG 항체Proteintech30000-0-AP
BODIPYThermo Fisher ScientificD3922
CaCl2Merck(SigmaAldrich)C5670
원심분리기Thermo 소르발 ST16R
콜라겐 타입 I Corning354236
Collagenase, Type 4Sangon BiotechA004186-0001
구금 바늘BRAUN4254074B
Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)GibcoC11995500BT
EGTAYeasen60339ES10
EthanolMerck(SigmaAldrich)493511
태아 소 혈청SigmaF2442
포도당Merck(SigmaAldrich)G7021
HEPESGibco15630080
Isoginkgetin MedChemExpressHY-N2117
K2HPO4 머크(Supelco)PHR2900
KCl머크(SigmaAldrich)P3911
Na2HPO4 & 12H2O머크(시그마알드리치)04273
NaCl머크(시그마알드리치)S9888
NaHCO3머크(시그마알드리치)S6014
니들 필터 0.22µ MMillex-GPSLGV033RB
나일 레드인비트로겐N1142
페니실린/스트렙토마이신(100X)Gibco15140122
재조합 아데노바이러스Obio Technology Corp., ltd. Flag 태그 마우스 IER2(Ad-Ier2, NM_010499.4) 및 대조군 아데노바이러스(Ad-NC)를 암호화하는 재조합 아데노바이러스는 Obio Technology Corp., ltd.에 의해 구축되었습니다.
펜토바르비탈 나트륨Merck(SigmaAldrich)P3761
멸균 세포 여과기, 100 & m피셔 사이언티픽22363549
트리판 블루비요타임ST2780-5g
가변 유량 연동 펌프롱BT100-1F

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  2. Targher, G., Byrne, C. D., Tilg, H. Masld: A systemic metabolic disorder with cardiovascular and malignant complications. Gut. 73 (4), 691-702 (2024).
  3. Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protoc. 1 (3), 100222(2020).
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  12. Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method. J Vis Exp. (140), e58323(2018).
  13. Xu, S., et al. TRIM56 protects against nonalcoholic fatty liver disease by promoting the degradation of fatty acid synthase. J Clin Invest. 134 (5), e166149(2024).
  14. Xu, S., et al. The clinical antiprotozoal drug halofuginone promotes weight loss by elevating GDF15 and FGF21. Sci Adv. 11 (13), eadt3142(2025).
  15. Tiriticco, V., et al. Rat liver perfusion and primary hepatocytes isolation: An old procedure crucial for cutting-edge 3D organoids culture. J Vis Exp. (213), e66857(2024).
  16. Wei, S., et al. Nafld and nash: Etiology, targets and emerging therapies. Drug Discov Today. 29 (3), 103910(2024).
  17. Fang, T., et al. Mouse models of nonalcoholic fatty liver disease (nafld): Pathomechanisms and pharmacotherapies. Int J Biol Sci. 18 (15), 5681-5697 (2022).

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