Minibioreactor Array(MBRA)의 조립 및 사용을 위한 업데이트된 프로토콜

Summary

MBRA(Minibioreactor Array)는 복잡한 미생물 군집의 배양을 가능하게 하는 고처리량, 맞춤형 연속 흐름 배양 시스템으로, 마이크로바이옴 역학, 치료 상호 작용 및 환경 요인에 대한 미생물 반응을 연구하기 위한 병렬 실험을 지원합니다.

Abstract

인간 마이크로바이옴은 숙주 건강에 필수적인 역할을 하는 다양하고 역동적인 미생물 군집으로 구성됩니다. 이러한 커뮤니티와 환경 요인에 대한 반응을 이해하는 것은 마이크로바이옴 기반 치료법을 발전시키는 데 매우 중요합니다. 인간 유래 미생물군 배양을 위한 전통적인 시험관 내 모델은 확장성이 부족하고 광범위한 기술 전문 지식이 필요하므로 접근성과 처리량이 제한되는 경우가 많습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 우리는 미생물 군집의 고처리량 배양을 위한 모듈식, 단일 단계, 연속 흐름 플랫폼인 MBRA(Minibioreactor Array) 시스템을 개발했습니다. 이 시스템은 최대 48개의 개별 미생물 군집을 병렬로 배양할 수 있어 복잡한 생태계의 안정적인 성장을 유지하면서 실험 유연성을 지원합니다. 이 프로토콜은 MBRA 제작, 조립, 멸균 및 작동에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 이 시스템의 모듈식 설계를 통해 혐기성 챔버 (anaerobic chamber) 에 쉽게 통합할 수 있으며, 광범위한 실험 응용 프로그램에 대한 사용자 정의를 지원합니다. 항생제, 식이 화합물 및 병원체 침입에 대한 미생물 반응을 연구하고 병원체 내성 군집을 스크리닝하는 데 사용되었습니다. 접근성, 확장성 및 재현성을 갖춘 MBRA는 미생물 상호 작용을 조사하고 마이크로바이옴 연구를 발전시키기 위한 강력한 모델 시스템을 나타냅니다.

Introduction

인간 마이크로바이옴은 수많은 생리적 과정에서 중요한 역할을 하고 인간의 건강에 큰 영향을 미치는 복잡한 미생물 생태계입니다. 인간 마이크로바이옴은 우리 몸 전체의 많은 해부학적 부위에 걸쳐 있으며, 각 부위에는 우리가 아직 완전히 이해하지 못한 방식으로 활발하게 상호 작용하는 역동적인 미생물 군집이 포함되어 있습니다¹. 건강과 질병에 대한 미생물 군집의 관여에 대한 지식을 확장하는 것은 이러한 환경 내에서 일어나는 미생물 상호 작용에 대한 이해에 달려 있습니다¹. 치료 목적으로 이러한 복잡한 시스템을 효과적으로 연구하고 조작하려면 환원주의적 접근 방식이 필요합니다. 단순화된 모델 시스템을 사용하여 개별 미생물 상호 작용을 탐색하면 마이크로바이옴²의 전체 복잡성을 더 잘 이해할 수 있습니다.

인간 유래 미생물 군집을 성장시키는 데 다양한 모델 시스템을 사용할 수 있습니다. 이러한 시스템은 인간 관련 미생물 군집에 대한 이해를 발전시켰으며 단일 단계 배치 배양에서 보다 복잡한 다단계 연속 흐름 시스템에 이르기까지 다양합니다. 인간 장내 미생물 생태계 시뮬레이터³, Twin-Vessel Single-Stage Chemostat 시스템⁴ 및 장내 미생물군 환경 제어 시스템⁵ 과 같은 모델 시스템은 특정 해부학적 부위의 생리학적 조건을 복제하고 미생물 환경의 시험 관 내 근사치를 제공합니다. 그러나 비용이 많이 들고, 실행 및 유지 관리에 높은 수준의 기술 전문 지식이 필요하며, 처리량이 제한되어 있기 때문에 미생물학자의 채택이 제한적입니다.

이러한 문제를 해결하기 위해 우리는 통제된 환경에서 다양한 소스에서 미생물 군집의 안정적인 성장을 촉진하도록 설계된 연속 흐름, 단일 단계 배양 시스템인 MBRA(Minibioreactor Array) 시스템을 개발했습니다 ^6,7,8. MBRA 시스템은 조립 및 작동의 단순성과 여러 미생물 군집을 동시에 배양할 수 있는 고처리량 기능과 결합되어 실험 효율성을 높여 다른 장 모델과 차별화됩니다. 또한, 이 시스템의 단순하고 컴팩트한 특성으로 인해 혐기성 및 미산소성 챔버 내에서 작동하여 위장관 및 질관과 같은 혐기성 및 저산소성 부위에서 박테리아의 성장을 촉진할 수 있습니다. 이 시스템의 다재다능한 특성은 Clostridioides 디피실 내성 위장 군집⁹의 스크리닝뿐만 아니라 항생제^10,11 및 식이 기질¹²가 미생물 군집에 미치는 영향을 테스트하는 데 활용되었습니다.

MBRA는 3D 프린팅 또는 적층 제조로 제작되며 재료 선택 시 투명도와 내수성을 우선시합니다(폴리머 정보는 재료 표 참조). 각 어레이에는 6 개의 개별 챔버가 있으며, 모두 미디어 수입, 폐기물 내보내기 및 샘플 수집을위한 포트가 장착되어 있습니다. 신선한 배지는 폐기물이 동시에 추출되는 동안 시스템에 지속적으로 공급되며 유속은 두 개의 연동 펌프에 의해 정밀하게 제어됩니다. 시스템의 내용물은 균질한 배양을 용이하게 하기 위해 교반 막대와 60 스팟 교반 플레이트를 사용하여 지속적으로 교반됩니다. 여기에 설명된 프로토콜은 챔버당 15mL의 작업량에 최적화되어 있지만 각 바이오리액터는 실험 요구 사항에 따라 1-20mL의 범위를 수용할 수 있습니다. 연동 펌프와 펌프 튜빙은 각각 약 15.63 내지 0.09시간의 회전율에 해당하는 0.016 내지 2.9 mL/min 범위의 유속을 수용할 수 있습니다. 이 시스템은 광범위한 매체 제형 및 식이 또는 영양 첨가물과 호환되지만 점성이 높은 매체는 유속의 재보정이 필요할 수 있으며, 용해되지 않은 입자 또는 불용성 성분이 있으면 특히 낮은 유속에서 펌프 튜브 또는 좁은 커넥터가 막힐 수 있습니다. 시스템의 모듈성을 통해 미디어 선택, 샘플 수집, 유속, 작업 볼륨을 조정하여 실험을 빠르고 쉽게 조정할 수 있습니다. 4개의 24채널 연동 펌프와 2개의 60스팟 교반판과 함께 이 시스템은 단일 혐기성 챔버에서 실험당 48개의 개별 챔버를 실행할 수 있어 처리량이 많은 혐기성 스크리닝을 지원합니다.

이 프로토콜은 우리 연구실에서 개발한 이전에 발표된 MBRA 조립 및 작동 방법의 시각적 가이드 및 업데이트된 버전 역할을 합니다⁴. 재현성을 높이고 작업 흐름을 간소화하며 오염을 최소화하기 위해 몇 가지 주요 개선 사항이 통합되었습니다. 첫째, PTFE 빨대는 이제 분리되어 바이오리액터 챔버로 떨어지는 것을 방지하기 위해 화학적으로 에칭됩니다. 둘째, 미디어 빨대가 피드 라인에 추가되어 미디어 흐름이 챔버 바닥으로 유도되어 미디어가 챔버 벽으로 떨어지는 것을 방지합니다. 이것은 생물막 형성의 알려진 원인이었습니다. 셋째, C-flex 튜브 길이가 표준화 및 단축되었으며 3D 프린팅 튜브 홀더가 보다 컴팩트하고 체계적인 설정을 만들 수 있도록 설계되었습니다. 마지막으로, 바이오리액터는 더 이상 각 사용 사이에 완전히 분해되지 않으므로 반복 실험과 관련된 시간과 재료 비용이 크게 절감됩니다. 이러한 개선 및 기타 점진적인 개선은 우리 실험실의 여러 프로젝트에서 시스템의 광범위한 사용을 기반으로 한 반복적인 최적화를 반영합니다.

Protocol

참고: 이 프로토콜은 단일 MBRA 스트립의 준비 및 조립을 위한 것입니다(그림 1). 각 MBRA는 3D 프린팅 바이오리액터, 성장 배지의 유입을 촉진하는 튜브, 바이오리액터 챔버에서 폐기물의 유출을 용이하게 하는 튜브로 구성됩니다. 이미지를 포함하여 단일 MBRA를 구성하는 부품의 전체 목록은 표 1에서 찾을 수 있습니다. 필요한 추가 장비에는 2개의 연동 펌프와 교반판이 포함됩니다(장치 세부 사항은 재료 표 참조).

1. 조립 전 준비

1. 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 에칭
   참고: PTFE의 화학적 특성으로 인해 이 MBRA 시스템에 사용하기에 이상적이지만 윤활성으로 인해 에폭시만으로는 다른 바이오리액터 부품에 접착할 수 없습니다. PTFE 튜브를 나사산 수 루어에 고정하려면 먼저 에폭시의 결합을 허용하기 위해 화학적으로 에칭해야 합니다. 탄화불소 식각액이 사용됩니다( 재료 표 참조). 그림 2A 는 이 에칭 공정을 용이하게 하기 위해 PTFE 튜브를 테이핑하는 시각적 가이드 역할을 합니다.
   1. 25mm 길이의 PTFE 튜브 12개를 절단합니다. 이 중 6개는 에칭 후 반으로 잘려 공급 라인("미디어 빨대")의 빨대 역할을 합니다.
      알림: 접착되는 부분만 에칭해야 합니다. 내부 표면과 원치 않는 부분의 에칭을 방지하려면 튜브의 양쪽 끝을 테이프로 감고 밀봉해야 합니다.
   2. 범용 실험실 라벨링 테이프(너비 19mm)를 사용하여 PTFE 튜브의 ~5mm를 덮는 상단에 테이프를 완전히 감습니다(그림 2A). PTFE 튜브의 ~10mm를 덮는 바닥 주위에 테이프의 다른 부분을 붙입니다(그림 2A).
   3. 에칭 용액이 PTFE 내부에 도달하지 않도록 테이프 끝을 단단히 꼬집습니다(그림 2A). 이렇게 하면 에칭을 위해 ~10mm의 PTFE 튜브가 노출됩니다.
   4. 4가지 용액을 준비합니다: 55°C로 가열된 탄화불소 에칭액(탄화불소 에칭액에 대한 자세한 내용은 재료 표 참조), 100% 에탄올(EtOH), 70°C로 가열된 증류된 H₂O, 70°C로 가열된 증류된 H₂O + 2-5% 아세트산.
      주의: 플루오로카본 에칭액은 부식성이 높습니다. PPE를 사용하여 흄 후드에서 모든 단계를 수행합니다. 기관 지침에 따라 화학 물질을 폐기하십시오.
   5. 모든 용액을 1.1.4단계에 표시된 온도로 가열합니다. 탄화불소 에칭액은 수조에서 가열해야 하며 다른 용액은 핫 플레이트에서 가열할 수 있습니다. 테이프로 감싼 튜브를 완전히 잠길 수 있을 만큼 깊이의 4개의 개별 유리 용기에 용액을 붓습니다.
   6. 모든 PTFE 튜브를 탄화불소 에칭액에 담그십시오. 균일한 표면 노출을 보장하기 위해 소용돌이치십시오. 에칭된 표면이 갈색으로 변할 때까지 1분 동안 담가둡니다.
      알림: 금속 스키머 스트레이너 스푼을 사용하여 용액 간에 PTFE 튜브를 옮길 수 있습니다.
   7. 튜브를 EtOH 수조로 5-20초 동안 옮깁니다.
   8. 튜브를 70°C H₂0 수조로 15-30초 동안 옮깁니다.
   9. 튜브를 70°C H₂0 + 2-5% 아세트산 수조에 1분 동안 옮깁니다.
   10. 튜브를 제거하고 퓨ム 후드 내부의 흡수 패드 위에 놓습니다. 에칭된 튜브를 밤새 건조시키십시오(최소 16시간). 건조 후 에칭된 튜브에서 테이프를 제거합니다.
   11. 에칭 된 PTFE는 결합 준비가 되어 있으며 실온에 보관하면 몇 달 동안 결합 가능합니다. 에칭 표면의 갈색 색상이 퇴색되면 더 이상 접착할 수 없습니다.
       알림: 에칭된 PTFE를 UV광선에 노출시키면 에칭이 저하될 수 있으므로 사용하지 마십시오.
   12. 에칭된 PTFE 튜브 중 6개를 반으로 잘라 공급 라인의 빨대 역할을 합니다(그림 2A).
2. 에폭시 폐기물 및 매체 빨대
   1. 6개의 에칭된 PTFE 폐기물 빨대와 6개의 에칭된 PTFE 미디어 빨대를 각각의 나사산 수 루어에 삽입합니다. 에칭된 표면이 수 루어의 바닥과 정렬되는지 확인합니다(그림 2).
   2. 에폭시 수지와 경화제를 계량 보트 또는 페트리 접시에 1:1 비율로 혼합합니다. 1mL 피펫 팁을 사용하여 PTFE 튜브와 만나는 나사산 수 루어의 바닥 주위에 에폭시를 도포합니다.
   3. 각 조각을 수직으로 배치하고 에폭시가 24시간 동안 굳도록 합니다.
      참고: 빈 피펫 1mL 팁 상자는 똑바로 세우는 데 적합합니다.

2. MBRA 어셈블리

1. MBRA 및 부품 준비
   1. Minibioreactor 어레이 스트립이 3D 프린팅( 보충 파일 1 참조)이고 6개의 독립적인 바이오리액터 챔버가 포함되어 있는지 확인합니다. 각 챔버에는 피팅을 삽입하기 위해 나사산을 끼워야 하는 3개의 1/4인치 포트가 있습니다. T-핸들 탭 렌치를 사용하여 1/4인치-28NF 분수 탭으로 스레딩을 수행합니다.
      알림: 수직 나사산을 보장하기 위해 포트에 나사산을 끼울 때 탭 가이드를 사용하는 것이 좋습니다.
   2. 나사산이 끼워지면 각 바이오리액터 챔버를 물로 씻어내어 플라스틱 잔여물을 제거합니다. 각 챔버에 10 x 3mm 마그네틱 교반 바와 증류수 1mL를 추가합니다. 물은 고압멸균 중 멸균 과정에 도움이 됩니다.
   3. 바이오리액터의 각 포트 위에 고무 와셔를 배치합니다. 각 챔버에 대해 그림 2B에 표시된 대로 폐 빨대 나사산 수 루어 1개, 매체 빨대 나사 수 루어 1개, 빈 나사산 수 루어 1개를 각 포트에 나사로 고정합니다.
   4. 6/3인치 암 루어 미늘에 32개의 고무 격막을 삽입합니다. 격막의 윗소매를 아래로 접어 목을 덮습니다. 그림 2B에 표시된 각 챔버의 포트에 부착합니다.
   5. 2 3/8인치, 3 11/16인치, 5 1/4인치, 6 1/2인치, 7 13/16인치, 9인치, 9인치 길이의 C-flex 튜빙 스트립을 절단합니다(폐기물 라인과 공급 라인 모두에 각 길이가 2개씩 필요함). 절단이 완료되면 1/8인치 암 루어 미늘을 한쪽 끝에 부착하고 각 길이의 튜브의 반대쪽 끝에 수 루어 잠금 커넥터를 부착합니다.
      알림: 여기에 사용된 길이는 혼란을 줄이고 교반판에서 ~1인치 떨어진 곳에 배치된 펌프에 최적화되어 있습니다. 원하는 설정에 따라 더 긴 길이가 필요할 수 있습니다.
   6. 빨간색 2스톱 E-lab 튜브(1.14mm ID)와 주황색 2스톱 E-lab 튜브(0.89mm ID)의 양쪽 끝에 1/16인치 암 루어 미늘을 삽입합니다. 각 MBRA 스트립에 대해 이 프로세스를 6회 반복합니다.
      알림: 1/16인치 암 루어 미늘을 더 쉽게 삽입하려면 E-lab 튜브의 끝을 끓는 물에 잠시 담가 플라스틱을 부드럽게 합니다.
   7. 2.1.5단계에서 준비한 C-flex 튜브에 E-lab 튜브를 연결합니다. 6가지 길이의 C-flex 튜브 각각은 암 루어 를 통해 하나의 빨간색 및 하나의 주황색 E-lab 라인에 연결되어야 합니다.
   8. C-flex 튜브 1인치 조각 21개, 2인치 조각 1개, 3인치 조각 3개, 12인치 조각 1개를 자릅니다. 1/8인치 암 루어 미늘과 수 루어 잠금 커넥터를 3인치 조각 1개와 12인치 튜브 조각의 끝에 부착합니다. 나머지 튜브에 수 루어 잠금 커넥터를 양쪽 끝에 부착합니다. 이 조각은 폐기물 라인과 공급 라인 트리 어셈블리로 구성됩니다.
2. 폐기물 라인 나무 조립
   1. 그림 3B에 표시된 3D 다이어그램에 따라 폐기물 라인 트리를 조립합니다.
   2. 빨간색 2스톱 E-lab 튜브(1.14mm ID)의 노출된 끝을 조립된 폐기물 라인 트리의 단자 수 루어 잠금 장치에 부착합니다. 2-stop E-lab 튜브에 부착된 C-flex 튜브의 길이를 기준으로 오름차순으로 부착합니다. 3/1인치 암 루어 미늘 및 8인치 암 루어 잠금 커넥터가 있는 8인치 C-flex 튜브를 폐기물 라인 트리의 맨 위에 부착합니다.
3. 피드 라인 트리 어셈블리
   1. 그림 3A에 표시된 3D 다이어그램에 따라 피드 라인 트리를 조립합니다.
      알림: 피드 라인 트리에는 폐기물 라인 트리에 사용되는 수-수 루어 커넥터가 통합되어 있지 않습니다. 우리의 경험에 따르면 이러한 커넥터는 누출되기 쉽고 쉽게 느슨해질 수 있어 바이오리액터 챔버와 미디어 병 모두에서 오염 위험이 증가합니다. 이를 완화하기 위해 피드 라인 트리는 이러한 구성 요소 없이 구성됩니다.
   2. 주황색 2-스톱 E-lab 튜브(0.89mm ID)의 노출된 끝을 조립된 피드 라인 트리의 단자 수 루어 잠금 장치에 부착합니다. 2-stop E-lab 튜브에 부착된 C-flex 튜브의 길이를 기준으로 오름차순으로 부착합니다. 12인치 C-flex 튜브를 피드 라인 트리의 맨 위에 부착합니다.
4. 완전한 조립: 준비된 구성 요소를 MBRA 배양 시스템에 결합합니다.
   1. 공급 라인 트리 끝에 있는 가변 길이 C-flex 튜브를 바이오리액터 스트립의 왼쪽에 가장 짧은 선과 오른쪽에 가장 긴 선으로 오름차순으로 바이오리액터에 부착합니다.
   2. 폐기물 라인 트리 끝에 있는 가변 길이 C-flex 튜브를 바이오리액터 스트립에 내림차순으로 부착하고 가장 긴 선은 왼쪽에, 가장 짧은 선은 오른쪽에 배치합니다. 가장 짧은 폐기물 라인은 폐기물 펌프에 가장 가깝기 때문에 바이오리액터 스트립의 오른쪽에 있습니다. 반면, 공급 펌프가 왼쪽에 있기 때문에 가장 긴 공급 라인은 오른쪽에 있습니다(그림 1).
5. 조립된 어레이의 멸균: 멸균을 위해 조립된 시스템을 준비합니다.
   1. 모든 C-flex 피드 라인을 MBRA의 왼쪽에 함께 묶고 트위스트 타이로 고정합니다. 스트립 오른쪽에 있는 폐기물 라인에 대해서도 동일한 작업을 수행합니다.
   2. C-flex 라인 사이에 주황색 2스톱 E-lab 튜브로 루프를 형성합니다. 오토클레이브 테이프를 사용하여 루프를 고정합니다. 바이오리액터 스트립의 폐기물 쪽에 있는 빨간색 2스톱 E-lab 튜브에 대해서도 동일한 작업을 수행합니다. 이렇게 하면 고압멸균 중에 공간이 절약됩니다.
   3. 폐기물 라인 끝에 있는 암 루어를 덮고 오토클레이브에서 제거한 후 오염을 방지하기 위해 호일 조각으로 라인 트리를 공급합니다. 각 바이오리액터 챔버의 격막이 있는 수나사 루어를 풀어 고압멸균 중에 증기가 빠져나갈 수 있도록 합니다.
      알림: 이 단계는 고압멸균 중에 증기가 바이오리액터에서 빠져나갈 수 있도록 하는 데 중요합니다. 환기가 제대로 되지 않으면 생물반응기 챔버에 균열이 발생할 수 있습니다.
   4. MBRA를 오토클레이브 빈에 넣고 공급 라인과 폐기물 라인 나무를 MBRA가 들어 있는 빈에 인접한 별도의 빈으로 늘립니다. 1/16인치 암 루어 미늘 근처의 E-lab 튜빙 또는 C-flex 튜빙의 섹션이 고압멸균 중에 꼬이면 튜빙이 막혀 매체 또는 폐기물 흐름을 방해할 수 있습니다.
   5. 121°C에서 오토클레이브, 15psi에서 25분 동안 ≥합니다. 액체 사이클의 일반적인 느린 배기 프로그램을 사용하십시오. 오토클레이브 사이클 후 바이오리액터를 실온에서 식히십시오. MBRA가 충분히 냉각된 후 나사산 수 루어를 격막으로 다시 조입니다.
      알림: 고압멸균된 생물반응기 스트립은 가단성이 생기고 압축되면 균열이 발생하기 쉽습니다. 피팅을 조이기 전에 식힐 때까지 충분한 시간을 두십시오.
      알림: 주황색 2스톱 E-lab 튜브는 오토클레이브 공정 중에 균열이 발생하기 쉬우며 1/16인치 암 루어 미늘과 분리될 수 있습니다. 균열이 발생하면 양쪽 끝에 70% 에탄올을 뿌린 다음 멸균 면도기로 금이 간 끝을 자르고 튜브를 루어 미늘에 다시 부착합니다. 또는 1/16인치 암 루어가 부착된 추가 E-lab 튜브를 오토클레이브 백에 담아 별도로 멸균할 수 있으며 전체 튜브를 교체할 수 있습니다.

3. 매체 및 폐기병 조립

1. 미디어 병 조립
   알림: 이 예에서 전체 시스템은 단일 2L 병으로 공급됩니다. 미디어 병 캡 어셈블리의 이미지는 그림 4A 를 참조하십시오.
   1. Dibafit 어댑터(병뚜껑 어댑터)를 Q 시리즈 병뚜껑 상단의 두 개의 나사산 포트에 나사로 고정합니다. 어댑터 중 하나에 C-flex 튜브의 3인치 섹션을 추가하고 다른 어댑터에 C-flex 튜브의 12인치 섹션을 추가합니다. 각 튜빙 섹션의 끝에 수 루어 잠금 커넥터를 추가합니다.
      알림: MBRA의 피드 라인 트리에 도달하는 데 필요한 튜브의 길이는 다를 수 있으며 그에 따라 조정할 수 있습니다.
   2. 12인치 PTFE 튜브 조각을 잘라 미디어를 끌어올 빨대 역할을 합니다. 병 측벽이 막히는 것을 방지하기 위해 면도날을 사용하여 끝을 45° 각도로 자릅니다. C-flex 튜브의 12인치 섹션에 연결된 병뚜껑 바닥의 작은 구멍에 PTFE를 삽입합니다.
   3. 2인치 C-flex 튜브 조각을 자르고 한쪽 끝에 암 루어 미늘을 부착하고 다른 쪽 끝에 수 루어 잠금 커넥터를 부착합니다. 이 튜브를 결국 피드 라인 트리에 연결될 튜브의 12인치 섹션에 연결합니다. 핀치콕으로 2인치 조각을 고정합니다. 병뚜껑의 3인치 튜브 주위에 핀치콕의 루프를 놓습니다. 이는 고압멸균 중 및 후에 매체 누출을 방지하기 위한 임시 마개 역할을 합니다.
   4. 원하는 미디어를 준비합니다. 완전히 조립된 병뚜껑을 미디어 병에 설치합니다. 위에서 설명한 대로 12인치 C-flex 튜브를 병 주위에 감고 끝을 2인치 튜브의 핀치콕으로 고정합니다. 캡을 단단히 조이지 말고 오히토클레이브 중 압력이 가해지는 것을 방지하기 위해 약간 풉니다.
   5. 호일을 사용하여 병뚜껑에서 나온 3인치 튜브의 끝을 덮습니다. 배지 프로토콜에 적합한 시간 동안 오토클레이브합니다. 멸균 후 3인치 튜브에서 호일을 제거하고 0.22μm 주사기 필터를 수 루어 잠금 커넥터에 나사로 고정합니다. 이렇게 하면 펌핑하는 동안 미디어 병으로 공기가 흐르지만 오염을 방지할 수 있습니다.
      알림: 부적절한 밀봉으로 인해 적절한 흐름이 방해될 수 있으므로 사용하기 전에 Q 시리즈 병뚜껑이 병에 단단히 밀봉되어 있는지 확인하십시오.
2. 폐기물 병 조립: 매일 폐기물병을 교체하지 않기 위해 실험실에서는 실험 중에 여러 개의 2L 병에 폐기물을 채울 수 있는 계층형 폐기물 수집 시스템(그림 4B)을 만들었습니다. 이 계층화된 폐기물 시스템의 설정은 다음과 같습니다.
   1. 병뚜껑 어댑터를 Q 시리즈 병뚜껑 상단의 두 나사산 포트에 나사로 고정합니다. 필요한 폐기물 보관 병의 수에 따라 2-4개의 병뚜껑에 대해 반복합니다.
   2. 모든 병뚜껑에 대해 2인치 PTFE 조각을 자릅니다. 이 부품을 시스템의 다음 병으로 폐기물을 제거하기 위해 지정된 구멍의 병뚜껑 안쪽에 삽입합니다.
   3. 펌프에서 나오는 폐기물 라인 트리 사이에서 폐기물 병 시스템의 위치까지 늘어날 수 있을 만큼 충분히 긴 길이의 C-flex 튜브를 자릅니다. 폐기물 라인 트리에 인접한 끝에 수 루어 잠금 커넥터를 끼우고 다른 쪽 끝을 병뚜껑에 PTFE 튜브 없이 병뚜껑 어댑터에 연결합니다.
   4. 두 번째 길이의 C-flex 튜브를 절단하여 첫 번째와 두 번째 폐기물 병의 병 뚜껑을 연결합니다. 첫 번째 병에는 PTFE 빨대가 있는 병뚜껑 어댑터에 튜브를 부착하고 두 번째 병에는 PTFE 빨대가 없는 병뚜껑 어댑터에 튜브를 부착합니다.
      알림: 계층화된 폐기병 캐스케이드의 각 병은 중력이 한 병에서 다음 병으로의 흐름을 도울 수 있도록 첫 번째 병 위에 위치해야 합니다(그림 4B). 모든 병을 보조 용기(예: 개방형 플라스틱 보관함)에 넣고 거꾸로 된 날카로운 용기와 같은 라이저를 사용하여 내림차순으로 배열하는 것이 좋습니다.
   5. 원하는 만큼 병에 대해 이 체인을 계속하십시오. 최종 병에서 수 루어 잠금 커넥터가 있는 3인치 C-flex 튜빙 세그먼트를 무료 병뚜껑 어댑터에 부착합니다. 그런 다음 20mL 주사기를 연결하여 진공을 적용하고 폐기물 캐스케이드를 용이하게 합니다.

4. MBRA 연결, 작동 및 분해

1. 펌프에 부착
   1. 폐기물 및 공급 라인 모두에 대해 E-lab 튜브를 함께 고정하는 오토클레이브 테이프를 제거합니다. C-flex 튜브 묶음을 풉니다.
   2. 교반판 상단의 두 펌프 사이에 MBRA를 배치합니다. 3D 프린팅 홀더를 사용하여 플레이트에 고정할 수 있습니다( 보충 파일 2 참조). 교반판에 표시된 교반 위치와 정렬되어 있는지 확인하십시오.
   3. 공급 라인 E-lab 튜브를 연동 펌프 카트리지에 부착합니다. E-lab 튜브의 스톱을 카트리지의 슬롯에 배치합니다. 교반판 오른쪽에 있는 펌프의 폐기물 라인 E-lab 튜브에 대해서도 동일한 작업을 수행합니다.
   4. 연동 펌프 카트리지를 펌프에 잠급니다. 카트리지가 펌프에 완전히 장착되고 튜브가 카트리지 채널 내부에 있는지 확인하십시오.
      알림: 24시간 이내에 흐름을 시작하려는 경우에만 카트리지를 펌프의 제자리에 잠그십시오. 매체 흐름 없이 24시간 이상 클램핑된 상태로 두면 튜브가 압축되어 막힐 수 있습니다. 이런 일이 발생하면 클램프를 제거하고 압축 지점에서 튜브를 부드럽게 마사지하십시오.
   5. 3D 프린팅 튜브 홀더를 사용하여 C-flex 튜브를 정리합니다(보충 파일 3).
   6. 폐기물 라인 트리의 끝을 폐기물병으로 이어지는 튜브에 부착합니다.
      알림: 여러 MBRA를 실행할 때 폐기물병으로 이어지는 튜브에 부착하기 전에 폐기물 라인 트리를 함께 갈라야 합니다. 이 작업은 각 추가 MBRA에 대한 간단한 분기 트리를 만들어 수행할 수 있습니다.
   7. 피드 라인 입구 튜브의 암 루어를 미디어 병 뚜껑의 12인치 튜브에 있는 수 커넥터에 부착합니다.
      알림: 이 시점에서 양쪽 끝은 멸균되어야 합니다. 잠재적인 오염원으로 만지지 마십시오. 오염이 의심되는 경우 연결하기 전에 양쪽 끝을 10% 표백제에 10분 동안 담가두십시오.
   8. 두 펌프를 모두 켜서 매체 흐름을 시작합니다. 펌프가 올바른 방향으로 흐르는지 확인하십시오(폐기물이 펌프 오른쪽에 있는 경우 둘 다 시계 방향("CW")으로 설정됨).
   9. 각 바이오리액터 챔버로 떨어지는 배지 방울의 크기와 케이던스를 관찰하십시오. 이것의 큰 차이는 유속 변동성을 나타낼 수 있습니다. 변동성이 관찰되면 문제가 되는 바이오리액터 챔버에 연결된 주황색 2-스톱 E-lab 공급 튜브를 교체하는 것이 좋습니다. 이는 실험 실행에서 유속 변동성을 제한하는 데 도움이 됩니다.
      알림: 시스템의 누출을 진단하고 수정해야 할 때이므로 초기 충전 프로세스를 면밀히 모니터링하십시오.
   10. 생물반응기 챔버가 용량에 도달하면 두 펌프를 모두 끄고 생물반응기를 24-48시간 동안 그대로 두십시오. 이 단계는 실험이 시작되기 전에 챔버에 잠재적인 오염이 있는지 확인하는 데 필수적입니다.
2. MBRA 접종
   참고: 여기에서는 격막을 멸균하고 접종물을 주입하기 위한 기본 프로토콜을 설명합니다.
   1. 원하는 사양에 따라 접종물을 준비합니다.
   2. 플라스틱 점적기를 사용하여 각 바이오리액터 챔버의 격막 상단에 새로 만든 10% 표백제 용액을 바릅니다. 중격 상단을 완전히 코팅할 수 있을 만큼 충분한 표백제를 침투합니다. 10분 동안 그대로 두십시오. 멸균 실험실 물티슈를 사용하여 격막을 건조시킵니다.
   3. 3인치 길이의 22G 바늘과 샘플이 들어 있는 주사기를 사용하여 중격의 중앙을 뚫습니다. 바늘이 챔버 내부의 배지에 닿는지 확인한 다음 접종물을 바이오리액터 챔버에 주입합니다. 매체를 제거하고 챔버에 다시 주입하여 주사기를 세척합니다. 격막에서 바늘을 제거하고 날카로운 용기에 버립니다.
   4. 흐름을 시작하기 전에 실험 설계에 따라 적절한 기간 동안 접종물이 성장하도록 하십시오. 예를 들어, 분변 박테리아 군집은 충분한 바이오매스를 증가시키기 위해 4-16시간의 초기 배치 성장이 필요합니다⁸.
   5. 필요한 회전율 시간에 따라 원하는 유량으로 두 펌프를 모두 켭니다. 유량에 대한 자세한 내용은 연동 펌프 설명서를 참조하십시오.
      참고: 원하는 유량에 관계없이 폐기물 펌프는 바이오리액터 챔버가 넘치지 않도록 항상 매체 펌프보다 더 빠른 속도로 작동해야 합니다. 위장관 박테리아 군집 배양의 경우 배지 펌프를 1.0rpm으로, 폐기물 펌프를 2.0rpm으로 설정하여 달성한 1.92mL/h 회전율을 사용합니다.
   6. 다시 말하지만, 각 바이오리액터 챔버로 떨어지는 매체 방울의 크기와 케이던스를 관찰하면 이것의 큰 차이는 유속 변동성을 나타낼 수 있습니다. 변동성이 관찰되면 문제가 되는 바이오리액터 챔버에 연결된 주황색 2스톱 E-lab 공급 튜브를 교체하는 것이 좋습니다. 이는 실험 실행에서 유속 변동성을 제한하는 데 도움이 됩니다.
3. MBRA 샘플링
   1. 각 바이오리액터 챔버의 격막 상단에 표면을 완전히 코팅할 수 있을 만큼 10% 표백제 용액을 도포합니다. 10분 동안 그대로 두십시오. 10분 후 멸균 실험실 물티슈를 사용하여 격막을 건조시킵니다.
   2. 3인치 길이의 22게이지 바늘과 주사기를 사용하여 격막의 중앙을 뚫고 바늘을 바이오리액터 챔버에 완전히 삽입합니다. 주사기를 잡은 상태에서 플런저를 뒤로 당겨 챔버에서 샘플을 꺼냅니다.
      알림: 한 번에 생물반응기 챔버 전체 부피의 20% 이상을 제거하지 마십시오. 이보다 더 많이 제거하면 신선한 매체가 챔버를 PTFE 폐기물 빨대 수준까지 다시 채워질 때까지 폐기물 유출이 중단되기 때문에 미생물 군집이 중단될 수 있습니다.
   3. 바늘을 제거하고 샘플을 적절한 용기에 분배합니다. 바늘은 날카로운 용기에 버리십시오.
4. MBRA 분해 및 개조
   참고: 실험 후 MBRA를 멸균하고 향후 실험을 준비해야 합니다.
   1. 탈이온화(DI) 물에 10% 표백제 1L를 넣어 미디어 입력을 전환합니다. 두 펌프의 유량을 최대로 높여 생물반응기 챔버의 내용물을 표백제 용액으로 대체합니다.
   2. 챔버가 깨끗해지면(모든 매체가 표백제로 교체됨) MBRA를 뒤집어 충전 라인 위에서 5분 동안 소독합니다. 5분 후 스트립을 올바르게 펴고 멸균을 위해 5분 더 기다립니다.
      알림: 표백제는 위에서 설명한 대로 10분 이상 방치하지 마십시오., 플라스틱의 변색과 매체 및 폐기물 튜브의 약화를 유발할 수 있습니다.
   3. 10% 표백제 용액을 1L의 DI 물로 교체합니다. 모든 물이 통과할 때까지 DI 물로 시스템을 세척하십시오. 펌프에서 바이오리액터 E-lab 튜브를 분리하고 MBRA를 제거합니다.
   4. 개조하려면 사용한 격막과 각 챔버에서 1mL를 제외한 모든 물을 제거하십시오.
   5. 격막과 주황색 2-스톱 E-lab 튜브를 교체하고 이전 단계에 따라 오토클레이브(단계 2.5.1 - 2.5.5)를 최대 3회까지 준비합니다. 세 번째 재사용 후 MBRA를 완전히 분해하고 C-flex 튜브를 교체한 다음 각 개별 부품을 70% EtOH로 멸균하거나 파손된 경우 교체해야 합니다. 폐기물과 공급 PTFE를 담고 있는 에폭시는 여러 번의 오토클레이브 사이클 후에 부서지기 쉬워지므로 다시 도포해야 합니다.
      알림: 주황색 2스톱 E-lab 튜브는 마모 및 반복되는 오토클레이브 사이클로 인한 유속 변동성을 제한하기 위해 각 실행 사이에 교체됩니다.

Results

위장관에서 발견되는 것과 같은 혐기성 박테리아의 성장을 촉진하기 위해 MBRA는 혐기성 챔버 내부에 설치하고 작동할 수 있습니다. 인체의 관련 부위에서 직접 복잡한 박테리아 군집을 성장시키는 능력을 입증하기 위해 인간 대변 샘플을 준비하고 이 시스템에서 성장시켰습니다. 모든 작업은 37°C로 설정된 혐기성 챔버에서 수행되었으며 배양은 당사의 바이오리액터 배지인 BRM3⁷에서 성장했습니다.

대변 슬러리는 인간의 대변을 혐기성 방식으로 해동한 다음 인산염 완충 식염수(PBS)와 최종 농도 25% w/v로 혼합하여 제조했습니다. 무균성을 확인한 후, 9개의 바이오리액터 챔버에 각각 3mL의 동일한 대변 슬러리를 접종했습니다. 미생물 군집은 배지 투입이나 폐기물 제거 없이 밤새 성장하여 16시간 동안 별도의 배치 배양을 수행했습니다. 그런 다음 공급 펌프를 켜고 시간당 1.92mL의 유량으로 설정했습니다. 4일간의 연속 흐름 후, 바이오리액터에서 샘플을 수집하고 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 사용하여 미생물 군집 구성을 분석한 다음 Deblur로 노이즈 제거를 수행하고 QIIME 2¹³의 SILVA 138 SSU 데이터베이스를 사용하여 분류학적 분류를 수행했습니다. 총 65개의 속이 9개의 반복실험 모두에서 검출되었지만 생물반응기는 18개의 속만이 지배적이었고 각 속은 9개의 반복실험 중 하나에서 최소 2%의 풍부도를 구성했습니다(그림 5). 생물반응기는 65개 속 중 22개가 9개의 반복실험 모두에서 검출되었고 추가로 17개의 속이 복제의 절반 이상에서 검출될 정도로 높은 재현성을 보였다. 적어도 하나의 반응기에 없는 대부분의 속(43속 중 37속)은 희귀종이었으며 각각 생물반응기에서 상대적 풍부도가 2% 미만이었습니다. 요약하면, 연속 흐름 MBRA 배양은 각 바이오리액터 챔버 내에서 16시간 동안 별도의 배치 배양을 한 후에도 동일한 대변 샘플에서 파생된 복잡하고 재현 가능한 미생물 군집을 지원했습니다.

그림 1: 미니바이오리액터 어레이(MBRA). 공급 및 폐기물 라인 튜빙 트리, 바이오리액터 챔버 및 바이오리액터 스트립에 대한 라벨을 포함하여 완전히 조립된 MBRA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: PTFE 에칭 가이드 및 MBRA 포트 레이아웃. (A) 미디어 및 폐 PTFE 빨대의 에칭을 위해 따라야 할 순서도. (B) 각 바이오리액터 챔버에는 배지 빨대 + 나사산 수 루어, 폐 빨대 + 나사산 수 루어 및 격막 + 나사산 수 루어용 포트가 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: MBRA 사료 및 폐기물 라인 나무. (A) 피드 라인 트리와 (B) 폐기물 라인 트리의 조립에서 따라야 할 대표적인 이미지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 미디어 병뚜껑 및 폐기물 계층 시스템. (A) 미디어를 MBRA로 끌어당기는 데 사용되는 조립된 Q 시리즈 병뚜껑의 예. (B) 계층화된 폐기물 수거 시스템의 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 박테리아 속의 상대적 풍부도. (A) 누적 막대 그래프는 표시된 샘플에서 최소 2%의 풍부도를 구성하는 모든 속의 상대적 풍부도를 보여줍니다. (B) 9개의 생물반응기 챔버 모두에서 관찰된 OTU 및 Shannon 다양성의 알파 다양성 메트릭. 9개의 생물반응기 챔버 모두에 인간의 대변에서 준비된 동일한 대변 슬러리를 접종했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: MBRA 구성 요소. MBRA를 완전히 조립하는 데 필요한 모든 개별 부품의 이미지 및 설명과 각 구성 요소에 필요한 수량. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: 문제 해결 가이드. MBRA를 실행할 때 발생하는 일반적인 문제와 잠재적인 원인 및 권장 해결 방법입니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: Minibioreactor Array 스트립을 3D 프린팅하기 위한 Stl 파일입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: 생물 반응기를 교반 플레이트에 고정하는 데 사용되는 생물 반응기 홀더를 3D 프린팅하기 위한 Stl 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 3.: MBRA에서 확장되는 C-flex 폐기물 및 공급 튜브를 구성하는 데 사용되는 튜브 홀더를 3D 프린팅하기 위한 Stl 파일입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 프로토콜은 박테리아 군집의 고처리량 배양을 위한 미니바이오리액터 어레이(MBRA)의 완전한 조립 및 기본 작동을 설명하며, 이전에 발표된 방법에 대한 몇 가지 주요 개선 사항을 통합합니다. MBRA 시스템은 연구자들이 수많은 실험 복제를 병렬로 지원하면서 복잡한 미생물 생태계를 배양할 수 있도록 하는 다재다능하고 비용 효율적인 도구로 남아 있습니다. 이 업데이트된 버전에서는 재현성을 향상시키고 작업 흐름을 간소화하며 오염 위험을 줄이는 개선 사항을 도입했습니다. 여기에는 분리를 방지하기 위해 화학적으로 에칭된 PTFE 빨대(그림 2), 생물막 형성을 최소화하기 위한 배지 라인의 공급 빨대(그림 2), 보다 컴팩트하고 체계적인 설정을 위한 3D 프린팅 튜브 홀더(보충 파일 3)가 포함된 표준화된 튜브 길이, 실험 사이에 완전히 분해할 필요가 없는 최적화된 재사용 프로토콜이 포함됩니다. 이러한 개선 사항은 우리 실험실의 다양한 실험 응용 분야에서 MBRA 시스템을 광범위하게 사용하여 개발된 반복적인 개선을 나타냅니다. 중요한 조립 단계와 실질적인 개선 사항을 모두 다루면서 이 논의는 마이크로바이옴 연구를 위한 지속적으로 발전하는 모델 시스템으로서 MBRA의 유용성을 강조합니다.

MBRA 시스템의 성공은 오염 없는 작동을 보장하기 위해 구성 요소의 정확한 조립 및 멸균에 크게 좌우됩니다. 주요 단계에는 모듈식 조립을 용이하게 하고 미디어 입력 및 폐기물 수거를 가능하게 하는 Q 시리즈 캡, 튜브 및 커넥터의 적절한 장착이 포함됩니다. 배지 병, 폐기물 저장소 및 생물반응기 챔버 사이의 단단한 밀봉을 보장하는 것은 누출을 방지하고 멸균 상태를 유지하는 데 필수적입니다. 또 다른 중요한 단계는 실험 전에 연동 펌프 유량을 검증하는 것인데, 불일치로 인해 배지 전달이 고르지 않게 되고 미생물 성장 역학에 영향을 미칠 수 있기 때문입니다. 카세트를 사용하는 대부분의 다중 채널 연동 펌프에는 각 채널의 유량을 미세 조정하는 데 사용해야 하는 폐색 조정 메커니즘이 포함되어 있습니다. 적절한 교정을 수행하더라도 E-lab 튜브는 여전히 변동성의 주요 원인으로 남아 있습니다. 이를 완화하려면 초기 충전과 실험 시작 중에 각 바이오리액터 챔버로 들어가는 배지 방울의 빈도와 크기를 시각적으로 모니터링하는 것이 중요합니다. 이러한 시각적 검사를 통해 실험 재현성을 손상시킬 수 있는 유량 불일치를 조기에 감지할 수 있습니다. 표 2에서는 MBRA를 조립하고 사용하는 동안 발생하는 일반적인 문제에 대한 문제 해결 전략을 제공합니다. 이러한 문제 해결 단계는 실험 전반에 걸쳐 재현성을 보장하고 장기 배양 중 중단을 방지합니다.

장점에도 불구하고 MBRA 시스템에는 실험을 설계할 때 고려해야 할 특정 제한 사항이 있습니다. 고급 시스템과 달리 MBRA에는 실시간 광학 밀도(OD) 측정, pH 제어 및 온도 조절과 같은 능동 모니터링 기능이 부족합니다. 이러한 능동 측정의 부재는 미생물 성장 및 대사 활동의 동적 변화를 실시간으로 모니터링하는 시스템의 능력을 제한합니다. 또한 이 시스템은 챔버 내 혐기성 재배를 지원하지만 통합 가스 제어는 포함되어 있지 않으므로 정밀한 미호기성 또는 CO₂가 풍부한 환경이 필요한 응용 분야가 제한될 수 있습니다. 이러한 제어가 필요한 연구의 경우 가스 조절이 내장된 대체 시스템이 더 적합할 수 있습니다.

MBRA 시스템은 높은 처리량, 확장성 및 비용 효율성을 포함하여 기존 바이오리액터 모델에 비해 주요 이점을 제공하는 동시에 인간 위장관과 같은 동적 환경을 모방하기 위해 연속 흐름 하에서 복잡한 박테리아 군집을 배양할 수 있는 능력을 유지합니다 ^6,8,10. 컴팩트한 모듈식 설계로 여러 바이오리액터를 동시에 작동할 수 있으며, 병원체 침입에 대한 저항성을 위해 대변 유래 군집을 스크리닝하는 것과 같은 높은 처리량 연구에 이상적입니다⁹. 이 모듈식 설계는 광범위한 실험 유연성을 제공합니다: 각 스트립은 이 프로토콜에서 시연된 것처럼 단일 배지 병 또는 각 바이오리액터 챔버에 대해 하나씩 최대 6개의 개별 배지 소스로 공급될 수 있습니다. 작업량은 액체 높이를 설정하는 각 챔버의 폐기물 포트에 삽입된 슬림한 PTFE 폐기물 빨대의 길이에 의해 결정됩니다. 이 프로토콜에서 25mm 빨대는 15mL 작업 부피를 유지하지만 빨대를 다듬거나 확장하여 1-20mL 사이의 부피를 달성할 수 있습니다. 또한 더 짧은 공급 빨대를 매체 입구에 삽입하여 챔버 베이스 쪽으로 유입을 유도하여 매체가 챔버 벽 아래로 떨어지는 것을 방지하고 충전 라인 위의 생물막 형성을 줄입니다. 펌프 속도 또는 펌프 튜브 직경을 조정하여 시스템의 회전율을 변경할 수도 있습니다. 현재까지 MBRA 시스템은 항생제¹⁰, 항암제¹⁴ 및 다양한 식이 화합물 12,15,16,17을 포함한 다양한 요인에 대한 반응으로 미생물 군집의 기능 및 구성 변화를 연구하는 데 널리 사용되어 왔습니다. 단순하고 모듈식 설계로 다양한 실험 요구에 적응하는 데 이상적입니다. 예를 들어, MBRA는 화학저항과 유사한 조건에서 생물막을 연구하도록 수정되었으며¹⁸, 플랑크톤 배양을 넘어 미생물 생태학 연구에 대한 다양성을 입증했습니다.

MBRA 시스템의 향후 반복은 기능, 정밀도 및 처리량 잠재력을 확장하는 추가 엔지니어링 업그레이드의 이점을 누릴 수 있습니다. 그러한 개선 사항 중 하나는 각 생물반응기 챔버에 추가 포트를 통합하는 것입니다. 이러한 포트는 pH, 온도, 가스 또는 광학 밀도와 같은 환경 매개변수의 능동 모니터링을 지원하는 데 사용할 수 있습니다. 이는 실시간 피드백 및 모니터링을 허용함으로써 모델의 가장 중요한 한계 중 하나를 해결할 것입니다. 챔버 또는 포트 형상을 개선하면 보다 철저하고 접근 가능한 세척이 가능하여 잔여물 축적 및 변색을 줄이고 장기적인 재사용성을 향상시킬 수 있습니다. 프로그래밍 가능한 타이머와 추가 연동 펌프를 통합하면 펄스 또는 주간 배지 입력이 가능하여 인간 장의 수유 주기와 같은 숙주 관련 환경을 더 잘 시뮬레이션할 수 있습니다. 마지막으로, 내화학성, 오토클레이브 가능 폴리머와 같은 대체 재료를 사용한 3D 프린팅은 더 큰 내구성과 더 넓은 범위의 시약과의 호환성을 가능하게 할 수 있습니다. 이러한 개선 사항을 통해 MBRA 플랫폼의 실험 범위와 충실도를 크게 확장할 수 있습니다.

결론적으로, MBRA는 통제된 조건에서 미생물 군집을 배양하고 연구하기 위한 강력하고 처리량이 많은 플랫폼을 제공합니다. 능동 모니터링 및 pH 제어에는 한계가 있지만 유연성, 확장성 및 비용 효율성으로 인해 광범위한 미생물 연구, 특히 높은 복제성 및 실험 처리량이 필요한 연구에 귀중한 도구가 됩니다. 중요한 것은 시스템의 모듈식 설계 및 제작 접근 방식이 본질적으로 적응할 수 있다는 것입니다. 연구자들은 다양한 실험 목표에 맞게 MBRA를 맞춤화해 왔으며 앞으로도 계속 조정할 수 있습니다. 이러한 적응성을 통해 MBRA는 새로운 과학적 질문 및 기술과 함께 계속 발전하여 마이크로바이옴 연구를 위한 다목적 플랫폼으로서의 관련성을 유지할 수 있습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
V-Tap 가이드, 표준 크기 0-80 - 5/8"	빅 게이터 도구	STD500NP
0.22 &무; M 주사기 필터	어부	SLGVR33RS
2mag MIXdrive 60 교반 드라이브(드라이브 전용)	2매그	MF 41060
Air-tite 피하 주사 바늘, 22G x3"	VWR	89219-274
BD 1mL 슬립 팁 멸균 주사기 멸균	어부	14-823-434
바이오리액터	프로토 랩	NA	DMS Somos Watershed Plastic으로 3D 프린팅되었습니다. 템플릿은 보충 파일 1을 참조하십시오.
바이오리액터 홀더	프로토 랩	NA	PA 12 Black에서 3D 프린팅되었습니다. 템플릿은 보충 파일 2를 참조하십시오.
Diba Omnifit Q-시리즈 솔벤트 병 뚜껑, GL38/38-430(유리), 2개의 UNF(F) 포트 (밸브 제외), 파란색	콜 파머	EW-21942-86
Diba Omnifit 튜빙, PTFE, 1/8"(3.2mm) OD x 1.5mm ID	콜 파머	EW-21942-76
Dibafit 어댑터, 1/4"-28 UNF(M) 평평한 바닥에서 3.2mm 내경까지, PEEK	콜 파머	EW-21941-49
IRWIN 12001ZR 탭 렌치 #0-1/4" T-핸들	아마존	B00004YOB0
Irwin Hanson 고탄소강 SAE 분수 탭 1/4인치. 1 개	조로	G7695682
록타이트 헤비 듀티 에폭시 퀵 세트 8액량 온스 병	아마존	B0044F59N0
수-수 루어 잠금 커넥터	다윈 미세유체공학	DM-MM-LUER-PP	대안: Strategic Applications Inc 수-수 루어 커넥터 - 10/pk - Fisher - NC9876577
Masterflex 어댑터 피팅, 루어-루어, 나일론, Avantor	VWR	MFLX45502-56
Masterflex 피팅, 나일론, 스트레이트, 암 루어-호스 미늘 어댑터, 1/16" ID	VWR	MFLX45502-00
Masterflex 피팅, 나일론, 스트레이트, 암 루어-호스 바브 어댑터, 3/32" ID	VWR	MFLX45502-02
Masterflex 피팅, 나일론, 스트레이트, 암 루어-호스 미늘 어댑터, 1/8"	VWR	MFLX45502-04
Masterflex 피팅, 나일론, 스트레이트, 수 루어 잠금 장치 - 호스 미늘 어댑터, 1/8	VWR	MFLX45505-04
Masterflex 피팅, 나일론, 스트레이트, 수 루어 x 1/4-28 UNF	VWR	MFLX45505-82
Masterflex 피팅, 폴리프로필렌, 엘보우, 암 루어-암 루어 어댑터	VWR	MFLX45508-26
Masterflex Ismatec 펌프 튜빙, 2스톱, Tygon S3 E-Lab, 0.89mm ID	VWR	MFLX96460-26
Masterflex Ismatec 펌프 튜빙, 2스톱, Tygon S3 E-Lab, 1.14mm ID	VWR	MFLX96460-30
마스터플렉스® 이송 튜브, C-Flex, 불투명 흰색, 1/8" ID x 1/4" OD; 25피트	VWR	MFLX06424-67
모어' s 튜빙용 핀치콕	VWR	470201-374
네오프렌 고무 펜더 와셔 ½ ” 외경 x & frac14; ” ID x 1/16" 두께	아마존	B01A29F1R0
정밀 씰 고무 격막	시그마 알드리치	Z553905
스핀바 마이크로 교반 바	VWR	58948-375
테트라 에칭	RS 휴게스트 컴퍼니	TE-500
튜빙 홀더	프로토 랩	NA	PA 12 Black에서 3D 프린팅되었습니다. 템플릿은 보충 파일 3을 참조하십시오.
Watson-Marlow 205S 다중 채널 카트리지 펌프	왓슨-말로	020.3724.00A	할인, 대안: Ismatec IPC 디지털 연동 펌프 MFLX7800142 - FISHER - 113-200-014 또는 Masterflex Ismatec IPC 연동 펌프, 0.1 - 11.25 rpm, 24 채널, 115/230 VAC, Avantor, VWR, MFLX78006-48-CH