오일 레드 O 염색에 의한 AAV8-PCSK9 주사 마우스의 대동맥 죽상동맥경화증 평가

요약

이 프로토콜은 Oil Red O 염색을 사용하여 마우스 대동맥의 안면 죽상동맥경화성 병변을 해부, 관용, 염색, 이미징 및 정량화하기 위한 단계별 방법을 설명합니다.

초록

마우스 모델은 오랫동안 죽상동맥경화증 연구의 기본 도구였으며 플라크 형성, 지질 대사 및 심혈관 염증의 기초가 되는 분자 및 세포 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공해 왔습니다. Apoe^-/- 또는 Ldlr^-/- 마우스를 넘어 정상 C57BL/6J 마우스에 AAV8-PCSK9^D377Y 주사가 동시 서양식 식이 수유가 죽상동맥경화증의 중개 연구에 일반적으로 사용되는 모델로 부상합니다. 오일 레드 O 염색은 혈관 조직의 중성 지질 축적을 시각화하기 위한 초석 기술입니다. 단순성, 비용 효율성 및 지질이 함유된 병변을 감지하기 위한 높은 민감도로 인해 전임상 연구에서 죽상동맥경화반 부담을 평가하기 위한 황금 표준이 되었습니다. 이 연구에서 우리는 핀이나 복잡한 장착 단계 없이 안면 대동맥의 죽상동맥경화성 부담의 해부, 관류, 세로 개구부, 오일 레드 O 염색, 이미징 및 반자동 정량화에 대한 상세하고 재현 가능한 프로토콜을 제공합니다. 우리의 결과는 AAV8-PCSK9^D377Y 주사와 서양식 식이 수유의 조합이 마우스에서 상당한 죽상동맥경화성 병변 형성을 효과적으로 유도하고 얼굴 오일 레드 O 염색이 지질 침착 및 플라크 부담을 평가하는 신뢰할 수 있고 효율적인 기술임을 보여줍니다. 또한, 이 프로토콜은 C57BL/6J 마우스에서 AAV8-PCSK9 유도 모델에 최적화되어 있지만, Apoe^-/- 마우스, Ldlr^-/- 마우스 및 Ldlr^-/- 황금 시리아 햄스터와 같은 다른 모델 및 종에 사용하도록 쉽게 적응할 수 있습니다.

서론

동맥 내막 내 지질 침착과 염증을 특징으로 하는 죽상동맥경화증은 관상동맥질환과 심근경색 및 뇌졸중을 포함한 광범위한 심혈관 질환(CVD)의 병리학적 기초를 나타냅니다 1,2,3,4. CVD는 전 세계적으로 이환율과 사망률의 주요 원인으로 남아 있으며 전 세계적으로 심각한 건강 및 경제적 부담을 초래하고 있습니다 ^3,5. CVD의 주요 병리학적 기초인 죽상동맥경화증은 그 기본 메커니즘을 밝히고 효과적인 치료 전략을 개발하기 위해 광범위한 연구의 주목을 받았습니다. 마우스 모델은 죽상경화의 기저에 있는 메커니즘을 밝히고 잠재적인 치료 개입을 평가하는 데 중심적인 역할을 합니다⁶. 동물 모델의 개발은 죽상경화에 대한 이해를 발전시키는 데 중요한 역할을 했으며, 이를 통해 연구자들은 관련된 세포 및 분자 메커니즘을 분석하고 새로운 치료 전략을 평가할 수 있습니다

프로토콜

모든 동물 절차는 NIH에 설명된 지침에 따라 수행되었으며 중국 과학 기술 대학의 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다(윤리 승인 번호. USTCACUC27120124102).

알림: AAV8-PCSK9와 관련된 모든 절차는 생물안전 레벨 2(BSL-2) 조건에서 인증된 Class II 생물학적 안전 캐비닛에서 수행되어야 합니다. 직원은 실험실 가운, 일회용 장갑, 보안경을 포함한 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용해야 합니다.

1. 마우스의 죽상동맥경화증 유도

1. 8주 된 C57BL/6J 마우스에 AAV8-PCSK9^D377Y (꼬리 정맥을 통해 5 × 10¹¹ vg/마우스)를 정맥 주사합니다.
2. 주사 직후 마우스를 WD(지방에서 40kcal, 콜레스테롤 1.25% 함유)에 놓습니다.
3. 죽상동맥경화성 병변 형성을 유도하기 위해 12-16주 동안 마우스 WD를 먹입니다.
   참고: 12주간의 수유 기간이 일반적으로 사용되며 특히 AAV8-PCSK9 유도 모델에서 명백한 죽상동맥경화반 형성을 유도하는 것으로 나타났....

결과

대동맥벽의 지질 침착 정도를 평가하기 위해, AAV8-PCSK9^D377Y 를 주사하고 연령이 일치하는 대조군 마우스와 함께 12주 동안 서양식 식단을 먹인 수컷 C57BL/6J 마우스로부터 분리된 대동맥에 대해 안면 오일 레드 O 염색을 수행했습니다. PBS로 전신 관류하고 주의 깊게 해부한 후 전체 대동맥을 세로로 조심스럽게 해부하고 Oil Red O로 염색하여 지질이 함유된 죽상동맥경화성 병변을 시각화했습니다. 전체 실험 절차는 그림 2에 나와 있습니다. 그림 3에서 볼 수 있듯이, 오일 레드 O-양성 영역(빨간색)은 대조군 마우스(플라크 커버리지 0%)에서 거의 관찰되지 않았지만, AAV8-PCSK9 ^D377Y 주사 마우스(평균 플라크 커버리지 17%), 특히 대동맥궁 및 분지점 주변에서 현저하게 증가했습니다(병변 부위는 Apoe- 또는 Ldlr 결핍 마우스에서 관찰된 것과 유사.......

토론

이 연구에서 설명한 en face Oil Red O 염색 방법은 전체 대동맥의 죽상동맥경화성 병변 부담을 평가하기 위한 강력하고 재현 가능하며 시간 효율적인 접근 방식을 제공합니다. 본 연구에서는 대동맥 전체가 아닌 플라크 분석의 관심 영역으로 대동맥궁과 흉부 대동맥을 구체적으로 선택하였다. 이 결정은 일반적으로 Apoe^-/- 및 Ldlr^-/- 마우스와 같은 고전적인 유전적 녹아웃 모델에 비해 덜 광범위한 죽상동맥경화반 형성을 생성하는 AAV8-PCSK9^D377Y 모델²⁰의 특성에 의해 안내되었습니다. 동일한 기간의 WD 공급(예: 12-16주)을 받을 때 AAV8-PCSK9^D377Y 모델은 플라크 축적이 주로 대동맥궁에 국한되어 더 작은 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
C57BL/6J 마우스	GemPharmatech	아니오 N000013
4% 파라포름알데히드	Beyotime	P0099	조직 고정
AAV8-PCSK9D377Y 바이러스 입자	Wzbio	pAV208001	죽상동맥경화증을 유도하기 위해
미세 겸자	정밀 과학 도구	번호 11254-20	대동맥 해부용
ImageJ	NIH	1.47
이소프로판올	Sangon 생명 공학	A600918	을 청소하기 위해
	Scientific R& D Corp	S1849-32OZ	오일 레드 O 염색
산염 완충 식염수	Servicebio	G4202	대동맥 관류 및 청소용
스프링 가위	정밀 과학 도구	번호 15003-08	대동맥 해부 입
체 현미경	Mshot	MZ62	대동맥 해부 및 이미징
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