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방법 논문

오일 레드 O 염색에 의한 AAV8-PCSK9 주사 마우스의 대동맥 죽상동맥경화증 평가

1.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68795

⸱

2025년 8월 8일

 , 
1Department of Endocrinology, The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China, 2Anhui Provincial Key Laboratory of Metabolic Health and Panvascular Diseases

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 Oil Red O 염색을 사용하여 마우스 대동맥의 안면 죽상동맥경화성 병변을 해부, 관용, 염색, 이미징 및 정량화하기 위한 단계별 방법을 설명합니다.

초록

마우스 모델은 오랫동안 죽상동맥경화증 연구의 기본 도구였으며 플라크 형성, 지질 대사 및 심혈관 염증의 기초가 되는 분자 및 세포 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공해 왔습니다. Apoe-/- 또는 Ldlr-/- 마우스를 넘어 정상 C57BL/6J 마우스에 AAV8-PCSK9D377Y 주사가 동시 서양식 식이 수유가 죽상동맥경화증의 중개 연구에 일반적으로 사용되는 모델로 부상합니다. 오일 레드 O 염색은 혈관 조직의 중성 지질 축적을 시각화하기 위한 초석 기술입니다. 단순성, 비용 효율성 및 지질이 함유된 병변을 감지하기 위한 높은 민감도로 인해 전임상 연구에서 죽상동맥경화반 부담을 평가하기 위한 황금 표준이 되었습니다. 이 연구에서 우리는 핀이나 복잡한 장착 단계 없이 안면 대동맥의 죽상동맥경화성 부담의 해부, 관류, 세로 개구부, 오일 레드 O 염색, 이미징 및 반자동 정량화에 대한 상세하고 재현 가능한 프로토콜을 제공합니다. 우리의 결과는 AAV8-PCSK9D377Y 주사와 서양식 식이 수유의 조합이 마우스에서 상당한 죽상동맥경화성 병변 형성을 효과적으로 유도하고 얼굴 오일 레드 O 염색이 지질 침착 및 플라크 부담을 평가하는 신뢰할 수 있고 효율적인 기술임을 보여줍니다. 또한, 이 프로토콜은 C57BL/6J 마우스에서 AAV8-PCSK9 유도 모델에 최적화되어 있지만, Apoe-/- 마우스, Ldlr-/- 마우스 및 Ldlr-/- 황금 시리아 햄스터와 같은 다른 모델 및 종에 사용하도록 쉽게 적응할 수 있습니다.

서론

동맥 내막 내 지질 침착과 염증을 특징으로 하는 죽상동맥경화증은 관상동맥질환과 심근경색 및 뇌졸중을 포함한 광범위한 심혈관 질환(CVD)의 병리학적 기초를 나타냅니다 1,2,3,4. CVD는 전 세계적으로 이환율과 사망률의 주요 원인으로 남아 있으며 전 세계적으로 심각한 건강 및 경제적 부담을 초래하고 있습니다 3,5. CVD의 주요 병리학적 기초인 죽상동맥경화증은 그 기본 메커니즘을 밝히고 효과적인 치료 전략을 개발하기 위해 광범위한 연구의 주목을 받았습니다. 마우스 모델은 죽상경화의 기저에 있는 메커니즘을 밝히고 잠재적인 치료 개입을 평가하는 데 중심적인 역할을 합니다6. 동물 모델의 개발은 죽상경화에 대한 이해를 발전시키는 데 중요한 역할을 했으며, 이를 통해 연구자들은 관련된 세포 및 분자 메커니즘을 분석하고 새로운 치료 전략을 평가할 수 있습니다 6,7. 아포지단백 E 결핍(Apoe−/-) 및 저밀도 지단백 수용체 결핍(Ldlr−/−) 마우스와 같은 죽상동맥경화증의 고전적인 쥐 모델은 고지혈증과 강력한 플라크 형성을 유도하는 데 오랫동안 사용되어 왔습니다. 그러나 이러한 유전자 변형 계통의 생성 및 유지에는 광범위한 육종이 필요하며, 이는 시간이 많이 걸리고 실험 유연성을 제한할 수 있습니다 8,9,10. 이러한 한계를 극복하기 위해 프로단백질 전환효소 서브틸리신/케신 9형(AAV8-PCSK9D377Y)의 기능 획득 돌연변이를 암호화하는 아데노 관련 바이러스 혈청형 8을 활용하는 대체 접근법이 주목을 받았습니다. 서양식 고지방, 고콜레스테롤 식이와 함께 야생형 C57BL/6J 마우스에 투여할 때, 이 방법은 복잡한 유전적 교배나 죽상동맥경화증이 발생하기 쉬운 배경으로의 역교배 없이 비교적 짧은 시간 내에 고콜레스테롤혈증 및 죽상동맥경화성 병변을 효율적으로 유도합니다. 장점에도 불구하고 AAV8-PCSK9 모델에는 고려해야 할 특정 제한 사항이 있습니다. 특히, 고콜레스테롤혈증 및 죽상동맥경화성 병변 발생의 정도는 바이러스 용량 및 투여 수단과 같은 변수에 의해 영향을 받을 수 있으며, 이는 동물 간 가변성을 도입하고 실험 결과의 재현성에 영향을 미칠 수 있습니다11.

이러한 모델에서 질병 부담을 평가하기 위해 대동맥의 en face Oil Red O 염색은 맥관 구조의 내강 표면을 따라 지질이 풍부한 죽상동맥경화성 병변을 시각화하고 정량화하기 위한 잘 확립되고 민감한 기술을 제공합니다12,13. 이 접근법은 정성적 및 정량적 데이터를 모두 제공하며 유전자 조작, 약리학적 개입 또는 식이 조절의 효과를 평가하기 위한 전임상 연구에서 널리 사용됩니다14.

이 연구에서 우리는 전체 마운트 마우스 대동맥에서 죽상동맥경화성 병변의 분리, 관류, 세로 개방, 오일 레드 O 염색, 이미징 및 반자동 정량화를 위한 실용적이고 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜에서, AAV8-PCSK9D377Y는 꼬리 정맥 주사를 통해 마우스당 5 × 1011 벡터 게놈(vg)의 용량으로 투여된다. 지방에서 40kcal, 콜레스테롤 1.25%를 함유한 서양식 식단(WD)과 병용하면 12-16주 이내에 강력한 죽상동맥경화성 병변 발달을 관찰할 수 있습니다. 여기서의 프로토콜은 프로세스의 각 단계를 간소화하여 조직을 왁스 표면에 고정할 필요가 없으며 대신 변동성과 기술적 요구를 줄이는 단순화된 평탄화 기술을 사용합니다. 이 방법은 C57BL/6J 마우스에서 AAV8-PCSK9D377Y 유도 모델에 최적화되어 있을 뿐만 아니라 Apoe-/- 및 Ldlr-/- 마우스 및 Ldlr-/- 시리아 골든 햄스터를 포함하여 널리 사용되는 다른 죽상동맥경화증 모델에도 쉽게 적용할 수 있습니다 15,16,17,18,19, 인간과 유사한 지질 대사로 인해 유망한 모델로 떠올랐습니다.

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프로토콜

모든 동물 절차는 NIH에 설명된 지침에 따라 수행되었으며 중국 과학 기술 대학의 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다(윤리 승인 번호. USTCACUC27120124102).

알림: AAV8-PCSK9와 관련된 모든 절차는 생물안전 레벨 2(BSL-2) 조건에서 인증된 Class II 생물학적 안전 캐비닛에서 수행되어야 합니다. 직원은 실험실 가운, 일회용 장갑, 보안경을 포함한 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용해야 합니다.

1. 마우스의 죽상동맥경화증 유도

  1. 8주 된 C57BL/6J 마우스에 AAV8-PCSK9D377Y (꼬리 정맥을 통해 5 × 1011 vg/마우스)를 정맥 주사합니다.
  2. 주사 직후 마우스를 WD(지방에서 40kcal, 콜레스테롤 1.25% 함유)에 놓습니다.
  3. 죽상동맥경화성 병변 형성을 유도하기 위해 12-16주 동안 마우스 WD를 먹입니다.
    참고: 12주간의 수유 기간이 일반적으로 사용되며 특히 AAV8-PCSK9 유도 모델에서 명백한 죽상동맥경화반 형성을 유도하는 것으로 나타났습니다. 더 긴 기간(예: 16주)은 더 진행된 병변을 초래할 수 있으며 특정 실험 목표에 따라 최적의 시점을 선택해야 합니다.
  4. 수유 기간 동안 체중, 전반적인 건강 상태 및 혈장 지질 수치를 정기적으로 모니터링하십시오. 지질 프로파일링의 경우, 짧은 이소플루란 마취 하에 턱밑 또는 꼬리 정맥 출혈을 통해 기준선 및 선택된 시점(예: 4주마다)에서 혈액 샘플을 수집합니다.

2. 안락사 및 관류

  1. 펜토바르비탈나트륨(200mg/kg, 복강내 주사)을 투여하여 마우스를 안락사시킨다.
  2. 흉강을 열어 심장을 노출시킵니다.
  3. 우심방이를 절개하고 21G 바늘을 사용하여 좌심실을 통해 차가운 인산염 완충 식염수(PBS, 약 10mL)를 관류하여 혈액을 씻어냅니다.

3. 대동맥 박리

  1. 폐, 흉선 등 과도한 조직을 제거하여 흉부 대동맥을 심장에서 횡격막으로 노출시킵니다.
  2. 미세 해부 가위와 정밀 겸자를 사용하여 대동맥궁 주변의 주변 지방 조직을 제거합니다. 횡격막 근처의 흉부 대동맥 기저부를 둘러싼 지방 조직을 부드럽게 들어 올립니다. 미세 해부 가위를 사용하여 지방 조직의 뿌리를 따라 절제하고(혈관 구조가 손상되지 않은지 확인) 대동맥궁까지 위쪽으로 해부를 계속하여 대동맥 혈관을 완전히 노출시킵니다.
    참고: 대동맥에서 혈관주위 지방 조직의 해리가 중요하며, 대동맥을 해부하고 PBS에 배치하면 대동맥에서 혈관주위 지방을 해부하는 것이 기술적으로 어렵기 때문에 이 단계는 대동맥을 제자리에서 (마우스에서 절단하기 전에) 수행하는 것이 좋습니다.
  3. 정밀 가위를 사용하여 흉부 대동맥 기저부의 혈관을 횡단합니다. 집게로 절단된 끝을 들어 올리고 대동맥궁을 향해 혈관을 따라 위쪽으로 해부합니다. 적절한 거리에서 대동맥의 세 가지 기본 가지를 절단합니다.
  4. 대동맥 뿌리에서 횡단하여 흉부 대동맥을 심장에서 분리하고 추가 분석을 위해 전체 세그먼트를 분리합니다.
  5. 절제된 용기를 미리 냉각된 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액으로 옮기고 4°C에서 밤새도록 배양합니다(12-16시간). 취급을 표준화하고 배치 처리를 용이하게 하려면 고정 중에 개별 대동맥을 24웰 또는 48웰 플레이트의 웰에 배치합니다.
    참고: PFA에서 과도한 배양은 혈관 경화를 유발하여 세로 절편 및 추가 분석을 방해할 수 있으므로 장기간 고정(24시간 이상)을 피하십시오.
    주의: 4% PFA는 호흡기 및 피부 노출의 위험을 초래하는 독성 및 휘발성 고정제입니다. PFA 고정과 관련된 모든 단계는 니트릴 장갑, 실험실 가운 및 보안경을 포함하여 PPE를 착용한 상태에서 흄 후드에서 수행해야 합니다. 흡입 및 피부 접촉을 피하십시오. 사용된 PFA 용액은 지정된 포름알데히드 폐기물 용기에 수거하고 명확하게 라벨을 부착한 후 기관 또는 허가를 받은 화학 폐기물 처리 서비스에서 유해 화학 폐기물로 폐기해야 합니다.

4. 오일 레드 O 염색

  1. 고정 대동맥을 PBS로 세 번 세척하여 잔류 PFA를 제거합니다.
  2. 그림 1과 같이 미세한 가위를 사용하여 해부 현미경으로 대동맥을 세로로 열어 내부 곡률을 따라 대동맥 뿌리에서 시작합니다. 또는 고정하기 전에 대동맥을 열면 장착 중에 혈관을 더 쉽게 펼치고 정렬할 수 있습니다. 필요한 경우 상완두동맥(BCA), 우측 경동맥(RCA) 및 좌측 쇄골하 동맥과 같은 대동맥궁의 주요 가지를 세로로 열어 추가 영역을 노출시킵니다11. 이 부위의 플라크가 분리되거나 손상될 수 있으므로 이 단계에서 주의하십시오.
    참고: 두 가지 접근 방식 중 하나는 시술자 선호도와 조직 상태에 따라 선택할 수 있습니다.
  3. 이소프로판올의 0.5% 스톡을 탈이온수로 3:2 비율(v/v, 최종 농도 0.3%)으로 희석하여 오일 레드 O 작업 용액을 준비합니다. 염료를 완전히 용해시키기 위해 37°C 수조에서 5분 동안 배양합니다.
  4. 침전물을 제거하기 위해 0.22-0.45μm 멤브레인을 통해 여과합니다. 사용할 때까지 용액을 37°C 수조에 보관하십시오.
  5. 각 웰에서 PBS를 제거합니다. 오일 레드 O 작업 용액을 첨가하여 대동맥을 완전히 담그십시오. 실온(RT)에서 10분 동안 배양합니다.
  6. 배양 후 용액을 흡인하고 즉시 각 웰에 60% 이소프로판올 1mL를 첨가합니다. 접시를 셰이커에 놓고 부드럽게 저어서 씻습니다.
  7. 약 30초 후 혈관의 비병변 부위가 반투명하게 나타나면 이소프로판올을 흡인하여 세척을 중지합니다. 샘플을 PBS로 두 번 헹구십시오.
  8. 오일 레드 O 염색 후 필요한 경우 잔여 혈관 주위 지방 조직을 더 잘라냅니다. 이 단계에서 지방 조직은 일반적으로 염색이 잘 되어 있고 시각적으로 구별할 수 있으므로 혈관벽의 무결성을 손상시키지 않으면서 보다 정확하게 식별하고 제거할 수 있습니다.
  9. 오일 레드 O 염색 후 대동맥을 세로로 열고 유리 슬라이드에 조심스럽게 평평하게 장착하여 입체 현미경으로 즉시 이미징합니다.
  10. 또는 이미징하기 전에 샘플을 4°C의 PBS에 단기간 보관합니다. 평평하게 하기 어려운 동맥의 경우 가는 바늘을 사용하여 혈관을 검은색 왁스 플레이트에 고정하여 최적의 위치와 선명도를 보장합니다. 장기간 보존을 위해 염색된 혈관을 슬라이드 유리판에 장착하고 글리세롤 젤라틴으로 밀봉한 다음 직접 이미지화합니다.
    알림: 잔류 오일 레드 O로 인한 오염을 방지하기 위해 염색된 대동맥을 새 플레이트로 옮겨 세척합니다.
    주의: 오일 레드 O는 일반적으로 가연성 및 자극제인 이소프로판올로 제조되는 친유성 염료입니다. 연기 흡입을 방지하기 위해 화학 연기 후드에서 ORO 용액을 취급하십시오. 피부와 눈에 닿지 않도록 하십시오. 오일 레드 O 염색 용액은 가연성 화학 폐기물 용기에 별도로 수집해야 합니다. 지역 유해 폐기물 처리 규정에 따라 폐기하십시오.

5. 이미징

  1. 대비를 강화하기 위해 흰색 배경에 얼룩진 대동맥을 장착합니다. 선박의 유연성을 유지합니다.
    참고: 고대비 배경은 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 보다 효율적인 플라크 인식을 용이하게 합니다. 사용자 기본 설정에 따라 다른 배경색을 사용할 수도 있습니다.
  2. 평판 스캐너 또는 고해상도 카메라가 있는 해부 현미경을 사용하여 전체 대동맥을 이미지화합니다.
  3. 샘플 전체에서 균일한 조명과 일관된 배율(예: 6-8배 배율)을 보장합니다. 이미징 중에 대동맥이 건조되면 식염수 또는 PBS에 적신 키위 물티슈를 사용하여 수분을 보충하십시오.

6. 죽상동맥경화성 병변의 정량화

  1. ImageJ에서 이미지를 엽니다. 다음 단계에서는 ImageJ를 예로 들어 분석 절차를 설명합니다.
    참고: 다른 이미지 분석 소프트웨어(예: Zeiss Zen, Fiji)도 사용자 선호도 및 가용성에 따라 사용할 수 있습니다.
  2. 알려진 참조(예: 축척 막대 또는 눈금자)를 사용하여 축척을 설정합니다. 직선 도구를 사용하여 알려진 거리를 그립니다. Analyze > Set Scale로 이동하여 거리와 단위를 입력하고 Global을 선택한 다음 OK를 클릭합니다.
  3. 다각형 또는 자유형 선택 도구를 사용하여 전체 대동맥 영역의 윤곽을 그립니다.
  4. 분석 > 측정을 사용하여 면적을 측정합니다.
  5. 이미지 > 색상 임계값 조정을 사용하여 죽상동맥경화반 영역> 식별합니다. 채도와 밝기를 조정하여 오일 레드 O-포지티브 영역을 분리합니다.
  6. 선택을 클릭하여 스테인된 영역의 이진 선택을 생성합니다. 분석 > 측정을 사용하여 선택한 영역을 측정합니다. 일괄 처리의 모든 이미지에 동일한 임계값 설정을 적용합니다.
    참고: 잔류 지방이나 인공물로 인해 위양성 염색이 발생할 수 있다는 점을 감안할 때 사용자는 특정 실험 요구 사항과 이미지 품질에 따라 플라크 영역을 수동 또는 반자동으로 정의하도록 선택할 수 있습니다. 플라크 영역의 수동 추적은 전체 혈관 영역을 정의하는 것과 동일한 방법을 사용하여 수행할 수 있습니다.
  7. 추가 분석을 위해 결과(파일 > 다른 이름으로 저장 > 결과)를 .csv으로 내보냅니다.
  8. 플라크 면적/총 대동맥 면적을 100%× 표현합니다. 죽상동맥경화반 부담에 대한 보다 정확한 평가를 얻으려면 해부학적 영역(예: 대동맥궁, 특히 작은 곡률 및 총 대동맥)별로 플라크 면적을 정량화하고 결과를 각 각 영역의 총 표면적에 대한 플라크 면적의 백분율로 표현합니다: 플라크 면적(%) = (플라크 면적 / 영역의 총 면적) × 100%.
    참고: 잠재적인 편향을 최소화하려면 맹검 분석이 권장됩니다. 많은 수의 이미지를 분석하는 경우 임계값에서 측정에 이르는 전체 워크플로우를 매크로 레코더(플러그인 > 매크로 > 레코드)를 사용하여 자동화하고 프로세스 > 배치 > 매크로를 사용하여 대량으로 처리할 수 있습니다. 이를 통해 효율적이고 재현 가능한 높은 처리량 분석이 가능합니다.

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결과

대동맥벽의 지질 침착 정도를 평가하기 위해, AAV8-PCSK9D377Y 를 주사하고 연령이 일치하는 대조군 마우스와 함께 12주 동안 서양식 식단을 먹인 수컷 C57BL/6J 마우스로부터 분리된 대동맥에 대해 안면 오일 레드 O 염색을 수행했습니다. PBS로 전신 관류하고 주의 깊게 해부한 후 전체 대동맥을 세로로 조심스럽게 해부하고 Oil Red O로 염색하여 지질이 함유된 죽상동맥경화성 병변을 시각화했습니다. 전체 실험 절차는 그림 2에 나와 있습니다. 그림 3에서 볼 수 있듯이, 오일 레드 O-양성 영역(빨간색)은 대조군 마우스(플라크 커버리지 0%)에서 거의 관찰되지 않았지만, AAV8-PCSK9 D377Y 주사 마우스(평균 플라크 커버리지 17%), 특히 대동맥궁 및 분지점 주변에서 현저하게 증가했습니다(병변 부위는 Apoe- 또는 Ldlr 결핍 마우스에서 관찰된 것과 유사...

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토론

이 연구에서 설명한 en face Oil Red O 염색 방법은 전체 대동맥의 죽상동맥경화성 병변 부담을 평가하기 위한 강력하고 재현 가능하며 시간 효율적인 접근 방식을 제공합니다. 본 연구에서는 대동맥 전체가 아닌 플라크 분석의 관심 영역으로 대동맥궁과 흉부 대동맥을 구체적으로 선택하였다. 이 결정은 일반적으로 Apoe-/- 및 Ldlr-/- 마우스와 같은 고전적인 유전적 녹아웃 모델에 비해 덜 광범위한 죽상동맥경화반 형성을 생성하는 AAV8-PCSK9D377Y 모델20의 특성에 의해 안내되었습니다. 동일한 기간의 WD 공급(예: 12-16주)을 받을 때 AAV8-PCSK9D377Y 모델은 플라크 축적이 주로 대동맥궁에 국한되어 더 작은 ...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국가자연과학재단(보조금 번호 82370444)의 보조금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
C57BL/6J 마우스GemPharmatech 아니오 N000013
  4% 파라포름알데히드BeyotimeP0099조직 고정
AAV8-PCSK9D377Y 바이러스 입자 WzbiopAV208001죽상동맥경화증을 유도하기 위해
미세 겸자정밀 과학 도구번호 11254-20대동맥 해부용
ImageJNIH1.47
이소프로판올Sangon 생명 공학A600918을 청소하기 위해
Scientific R& D CorpS1849-32OZ오일 레드 O 염색
산염 완충 식염수ServicebioG4202대동맥 관류 및 청소용
스프링 가위정밀 과학 도구번호 15003-08대동맥 해부 입
체 현미경MshotMZ62대동맥 해부 및 이미징
서양식 식단 연구 다이어트D12108C죽상동맥경화증을 유발하기 위해
이소프로판올의 과도한 오일 빨간색 오일 빨간색 O 0.5% 용액 Poly 인

참고문헌

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