방법 논문

저밀도 지단백질의 존재 하에서 호중구 세포외 트랩을 이용한 혈관 내피 세포의 자극

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DOI:

10.3791/68830

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2025년 8월 12일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, Showa Medical University Graduate School of Pharmacy

이 논문에서

요약

인간 혈장에서 저밀도 지단백(LDL)의 분리, HL-60 세포의 호중구 유사 세포로의 분화, LDL의 존재 하에서 호중구 세포외 트랩(NET)의 제조, NET과 LDL의 혼합물로 인간 대동맥 내피 세포의 자극.

초록

호중구 세포외 트랩(NET)은 다양한 비감염성 질환의 원인 인자로 등장했으며 죽상동맥경화증 및 혈전증과 같은 심혈관 질환과 관련이 있습니다. NET 형성은 혈관벽에서 관찰되며 NET 형성의 혈장 마커가 질병의 중증도에 따라 증가한다는 강력한 증거가 있습니다. 골수과산화효소 및 프로테아제를 포함한 호중구 유래 NET 성분은 혈장 지단백질과 혈관 항상성에 영향을 미칩니다. 여기에서는 저밀도 지단백(LDL)의 존재 하에서 형성된 NET으로 혈관 세포를 자극하는 일련의 방법이 설명되어 있습니다. LDL은 초원심분리에 의해 인간 혈장에서 분획되었습니다. HL-60 세포를 all-trans retinoic acid로 처리하여 호중구 유사 세포로 분화시킨 다음 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)로 자극하여 NET 형성을 유도했습니다. PMA를 제거하고 세척한 후, 세포를 LDL과 함께 추가로 배양했습니다. NET과 LDL을 함유한 수집된 상청액은 즉시 인간 대동맥 내피 세포(HAEC)를 자극하는 데 사용되었습니다. 대표적인 반응으로서, NET 치료에 의해 유도된 HAEC의 형태학적 변화는 LDL의 존재에 의해 향상되었으며, 이는 LDL과 결합된 NET 형성이 HAEC의 반응을 향상시킴을 시사합니다. 이러한 방법은 호중구 활성화 및 NET 관련 염증 하에서 내피 세포에 대한 LDL의 효과를 탐색하는 데 유용하므로 혈장 LDL 증가와 관련된 심혈관 질환의 기본 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.

서론

박테리아 감염 시 활성화된 호중구에 의해 생성되는 호중구 세포외 트랩(NET)은 비감염성 생리학적으로 그럴듯한 조건에서 히스톤, 골수과산화효소(MPO) 및 호중구 엘라스타제1과 같은 응축된 DNA 및 단백질을 방출합니다. 이러한 성분은 변연 세포와 조직을 분해하여 지속적인 염증을 유발할 수 있기 때문에 NET 형성은 류마티스 관절염, 건선, 당뇨병, 알츠하이머병, 암 전이, 심혈관 질환 등 다양한 급성 및 만성 질환의 시작과 진행의 원인 요인으로 부상하고 있습니다2. 죽상동맥경화증3 및 복부 대동맥류4의 인간 혈관 병변에 대한 조직학적 분석은 호중구 침윤과 NET 형성이 공국화되는 것으로 나타났습니다. 순환 혈액에서 시트룰린화 히스톤, NET-DNA 및 MPO와 같은 NET 마커 수치는 관상 동맥 질환의 중증도에 따라 증가합니다5. 죽상동맥경화증의 초기 단계에서 NET 형성은 종종 대식세포 구동 거품 세포 형성을 통해 발생하는 지질 축적에 선행합니다 6,7. 이러한 현상은 NET 형성 중에 세포외로 방출되는 MPO 및 단백질 분해 효소가 혈관 조직뿐만 아니라 지단백질과 같은 혈액 성분에도 작용할 수 있음을 강력하게 시사합니다. 지단백질은 MPO8과 같은 NET 유래 단백질에 의해 손상될 수 있는 깨지기 쉬운 지질-단백질 복합체입니다. 따라서 NET 형성은 지단백질의 구조적, 생화학적 변화를 일으켜 혈관 항상성에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나 혈관 세포 유발 조절 장애 및 염증 반응에 대한 NET 형성 및 지단백질의 시너지 효과는 아직 불분명합니다.

여기서, 이 원고는 HL-60 유래 호중구 유사 세포와 인간 혈장에서 분획된 저밀도 지단백질(LDL)으로부터 제조된 NET으로 처리하여 유도된 인간 혈관 내피 세포의 세포 반응을 조사하는 방법을 제공합니다. 대표적인 결과는 초원심분리에 의한 인간 혈장에서 LDL의 분획과 LDL과 공동 배양 후 NET로 자극된 인간 대동맥 내피 세포(HAEC)의 세포 반응을 보여줍니다. 이 방법은 다른 지단백질과 관련된 혈관 세포 연구에 광범위하게 적용할 수 있습니다.

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프로토콜

LDL 제조를 위한 프로토콜은 쇼와 의과대학 약학부 윤리위원회(제231호)의 승인을 받았습니다. 헬싱키 선언에 따라 서면 동의서를 얻었으며 모든 참가자는 본 연구 참여를 위해 자발적으로 서명을 제공했습니다. 세포는 층류 후드를 사용하여 무균적으로 조작되었습니다. 포함 기준은 22-65세의 연령 범위였습니다. 제외 기준에는 흡연 습관, 기존 심혈관 질환(예: 관상 동맥 심장 질환, 뇌졸중 및 말초 동맥 질환), 심각한 간 기능 장애 및 당뇨병, 고혈압, 이상지질혈증, 중증 염증성 질환 및 암을 포함한 조절되지 않는 만성 질환이 포함되었습니다. 사용된 시약과 장비는 재료표에 나와 있습니다.

1. 인간 혈장에서 LDL 분리

  1. 항응고제 헤파린(10단위/mL)이 있는 상태에서 건강한 인간 지원자로부터 전혈을 채취합니다.
  2. 헤파린 튜브에서 얻은 인간 전혈 45-50mL를 원심분리합니다(4°C에서 15 분 동안 700×g). 원심분리기의 속도를 천천히 줄이십시오. 혈장 분획을 포함하는 상층을 수집합니다.
  3. 혈액 세포를 제거하기 위해 1.2단계와 동일한 감속 설정에서 2회(700× g, 4°C에서 15분)를 수행합니다. 1:1,000 부피의 250 mM EDTA(pH 7.4)를 첨가하여 지단백질의 2가 금속 이온 매개 산화를 방지합니다.
  4. 4mL-폴리카보네이트(4PC) 튜브에 2.7mL의 혈장을 넣고 250μM EDTA(PBS/EDTA)를 함유한 900μL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 오버레이하고 초원심분리기(600,000× g, 4°C에서 7분)합니다.
  5. 킬로미크론을 제거하기 위해 최상층 900μL를 버립니다. 900μL의 PBS/EDTA를 혈장 및 초원심분리기에 적층합니다(600,000 × g, 4°C에서 2.5시간).
  6. 초저밀도 지단백질(VLDL)을 제거하기 위해 최상층 900μL를 버립니다. 이 단계는 다른 지단백질 분획에 의한 LDL의 오염을 방지하는 데 중요합니다.
  7. 540μL의 0.5 mg/mL KBr 용액을 첨가하여 밀도를 d = 1.063으로 조정한 다음 피펫으로 부드럽게 혼합한 다음 초원심분리(600,000 x g, 4°C에서 2.5시간)합니다.
  8. LDL을 함유한 최상층 540μL를 수집합니다. 노란색-주황색 층은 성공적인 LDL 분리를 나타냅니다9. 투석막으로 옮깁니다.
  9. KBr을 제거하기 위해 4°C에서 2L의 PBS/EDTA에 대해 LDL 분획을 3회 투석합니다.
  10. 사용하기 전에 LDL을 4°C에서 어두운 곳에 보관하십시오.

2. 폴리-L-라이신 또는 젤라틴 코팅 웰의 제조

  1. 멸균수로 0.1% 폴리-L-라이신 용액을 희석하여 0.01% 폴리-L-라이신 용액10 을 준비한 후 0.2μm 멸균 필터로 여과합니다. 사용하기 전에 4°C에서 보관하십시오.
  2. 12웰 플레이트의 각 웰에 152μL/웰의 0.01% 폴리-L-라이신 용액을 첨가하고 최소 5분 동안 배양합니다.
  3. 용액을 제거한 다음 200μL/웰의 멸균수로 한 번 세척하고 최소 2시간 동안 건조시킵니다.
  4. NET 제조에 사용하기 전에 실온에서 보관하십시오.

3. 젤라틴 코팅 우물의 준비

  1. 사용하기 전에 0.1% 젤라틴 용액을 멸균수로 희석하여 2% 젤라틴 용액을 준비하십시오.
  2. 12웰 플레이트의 각 웰에 0.1% 젤라틴 용액 152μL/웰을 첨가하고 최소 5분 동안 배양합니다11.
  3. 용액을 제거한 다음 200μL/웰의 멸균수로 한 번 세척하고 최소 2시간 동안 건조시킵니다.
  4. 사용하기 전에 실온에서 보관하십시오.

4. 인간 대동맥 내피 세포(HAEC)의 유지 및 준비

  1. 2% 송아지 태아 혈청(FCS), 5ng/mL 표피 성장 인자, 10 ng/mL 염기성 섬유아세포 성장 인자, 20 ng/mL 인슐린 유사 성장 인자, 0.5 ng/mL 혈관 내피 성장 인자, 1 μg/mL 아스코르브산, 22.5 μg/mL 헤파린 및 0.2 μg/mL 하이드로코르티손, 제조업체의 지침에 표시된 대로. 세포가 70%-80% 합류할 때까지 격일로 배지를 교체합니다.
  2. 자극을 위해 젤라틴 코팅된 12웰 플레이트에 HAEC를 시드합니다. 합류점에 도달할 때까지 격일로 배지를 교체합니다. 4단계와 7단계 사이에 실험을 수행합니다.

5. HL-60 유래 호중구 유사 세포 및 NET 준비

  1. 처리되지 않은 접시를 사용하여 5% 소 태아 혈청과 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지로 HL-60 세포를 유지합니다.
  2. HL-60 유래 호중구 유사 세포의 제조를 위해, 2μM all-trans retinoic acid(AtRA)를 함유하는 RPMI-1640 배지에서 HL-60 세포 10mL당 2 ×10 6개 세포를 4일 동안 배양합니다.

6. LDL을 이용한 NET 제조

  1. 2μM AtRA로 처리한 후 4일 후에 HL-60 세포를 수집합니다. HL-60 세포가 호중구 유사 세포로 분화된 후 세포는 작아집니다.
  2. 세포를 원심분리합니다(220× g, 18-22°C에서 4분). 상청액을 흡인하고 동일한 부피의 무혈청 RPMI-1640으로 세포를 세척합니다.
  3. 세포를 원심분리(220× g, 18-22°C에서 4분)한 다음 무혈청 RPMI-1640으로 세포를 재현탁합니다.
  4. 세포를 계수한 다음 무혈청 RPMI-1640에서 세포를 2 × 106 cells/mL로 재현탁하고 폴리-L-라이신으로 사전 코팅된 12웰 플레이트의 웰에 0.5mL의 세포 현탁액을 시드합니다. 최소 30분 동안 배양합니다.
  5. 300 nM 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)를 포함하거나 포함하지 않는 100 μL의 무혈청 RPMI-1640을 0 또는 50 nM PMA의 최종 농도에 첨가합니다. 30분 동안 배양합니다.
  6. 배지를 제거하고 무혈청 RPMI-1640으로 세포를 한 번 세척합니다. 배지를 20μg/mL의 LDL이 있거나 없는 무혈청 RPMI-1640으로 교체한 다음 2시간 동안 배양합니다.
  7. 배양 배지를 수집하고 원심분리(700× g, 18-22°C에서 3분)하여 세포 파편을 제거합니다.

7. NET 및 LDL로 HAEC의 자극

  1. 배지를 0.5mL의 신선한 배양 배지로 교체합니다. 자극 전 최소 30분 동안 배양합니다.
  2. NETs 및 LDL(단계 6.7) 및 LDL을 함유하는 배양 배지 167 μL를 HAEC 접시에 첨가합니다. 12시간 이상 자극 후 유도된 HAEC의 형태학적 변화를 확인합니다.

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결과

킬로미크론을 제거한 후 순차적 초원심분리를 통해 인간 혈장에서 VLDL 분획을 제거한 후, 인간 혈장을 KBr 용액과 혼합하여 밀도를 d = 1.063으로 조정했습니다. 이 단계에서는 남은 침전제가 용액에 완전히 용해되지 않았고, 기포를 생성하는 심한 혼합을 피하여 LDL을 그대로 유지했습니다. 초원심분리 후, LDL은 황색-주황색9 (그림 1)으로 최상층에서 육안으로 평가되었으며, 이는 LDL을 바로 아래에 있는 무색 용액과 구별했습니다. 일반적으로, PBS/EDTA에 대해 수집된 LDL 분획의 투석 후, 45-50mL의 인간 혈액에서 약 23-25mL의 혈장을 수집하여 약 4mg/mL의 단백질과 함께 4.3mL의 LDL 분획을 산출할 수 있습니다.

2μM AtRA로 HL-60 세포를 처리하면 세포 크기가 감소한 호중구 유사 세포(dHL-60)로 세포가 분화되었습니다...

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토론

이 프로토콜은 LDL의 공존에 의해 유도된 dHL-60 세포로부터 NET의 제조를 설명하며, 이는 이후에 HAEC 반응을 분석하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜의 중요성은 다른 많은 연구에서 -20°C에서 동결된 NET 원액을 사용함에도 불구하고 세포 자극을 위해 NET 및 LDL을 포함하는 신선한 배지를 사용한다는 것입니다. 지단백질은 지질-단백질 복합체이기 때문에 동결-해동 과정에서 온전한 구조와 특성이 손실되어 LDL의 변성 및 응집을 유발합니다. 현재 방법의 장점은 호중구 유사 세포에서 방출되는 NET 형성 산물(예: 축축된 DNA, 히스톤, MPO 및 엘라스타제)과 지단백질이 손상되지 않은 상태로 남아 HAEC에 즉시 적용된다는 것입니다. 따라서 NET 형성 중에 호중구 유사 세포에서 방출되는 효소의 활성이 유지됩니다. 특히, 이 프로토콜의 결과는 LDL의 변경에 대한 NET과의 공동 배양의 효과를 반영할 수 있습니다. 이전 연구에서는 천연 LDL이 PMA 처...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 일본 학술 진흥회, KAKENHI(보조금 번호 23K10897 및 19K07069)의 일부 지원을 받았습니다. 영어를 편집해 주신 Editage(www.editage.jp)에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.1% 폴리-L-라이신시그마알드리치P8920-100ML
접시 10cm코 닝430591
12웰 조직 배양 플레이트송골매353043
젤라틴 2%시그마알드리치지1393-20ML
4PC 튜브히맥S404332A
올트랜스 레티노산와코188-01113모든 공급업체로 대체 가능
셀루로스 투석 튜브미스미 그룹 주식회사0327-23-37-07 (UC18-32-100)모든 공급업체로 대체 가능
EDTA도진도345-01865모든 공급업체로 대체 가능
내피 세포 성장 배지 2 키트프로모셀C-22111
태아 소 세럼깁코10270-106모든 공급업체로 대체 가능
헤파린 나트륨 (5,000 단위 / 5 mL)모치다 제약 주식회사모든 공급업체로 대체 가능
고속 냉장 원심분리기토미SRX-201 시리즈가속: 9, 감속: 7
인간 대동맥 내피 세포론자CC-2535
KBr와코168-03475모든 공급업체로 대체 가능
KEYENCE 현미경 소프트웨어키엔스BZ-II 분석기
마이크로 초원심분리기히맥CS150GX
현미경 검사 법올림푸스CK40
현미경 검사 법키엔스BZ-9000 시리즈타임랩스 이미징용(옵션)
현미경 카메라니콘DS-파이3
현미경 카메라 소프트웨어니콘DS-L4 시리즈
페니실린/스트렙토마이신깁코15140-122 100ML모든 공급업체로 대체 가능
인산염 완충 식염수(× 10)NaH2PO4middot 2.6 g을 용해; 2 H2O, Na2HPO4· 29 g; 증류수에 12H2O, NaCl 80g 및 KCl 2.0g을 1L의 부피로 조절합니다. (모든 공급업체로 대체 가능)
PMA(포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트)와코162-23591모든 공급업체로 대체 가능
시약팩론자CC-5034 시리즈(CC-5022: HEPES 완충 식염수, CC-5012: 트립신/EDTA, CC-5002: 트립신 중화 용액) 
회전자히맥S100AT6-0242
RPMI-1640 (페놀 레드 포함)와코189-02025모든 공급업체로 대체 가능
RPMI-1640 (페놀 레드 없음)와코186-02155모든 공급업체로 대체 가능
T-25 플라스크코 닝3275

참고문헌

  1. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
  2. Wang, H., et al. Neutrophil extracellular traps in homeostasis and disease. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 235(2024).
  3. Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thromb Haemost. 107 (3), 597-598 (2012).
  4. Meher, A. K., et al. Novel role of IL (Interleukin)-1β in neutrophil extracellular trap formation and abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 38 (4), 843-853 (2018).
  5. Borissoff, J. I., et al. Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (8), 2032-2040 (2013).
  6. Liu, Y., et al. Myeloid-specific deletion of Peptidylarginine Deiminase 4 mitigates atherosclerosis. Front Immunol. 9, 1680(2018).
  7. Zhai, M., et al. Extracellular traps from activated vascular smooth muscle cells drive the progression of atherosclerosis. Nat Commun. 13 (1), 7500(2022).
  8. Abdo, A. I., Rayner, B. S., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. Low-density lipoprotein modified by myeloperoxidase oxidants induces endothelial dysfunction. Redox Biol. 13, 623-632 (2017).
  9. Mueller, P. A., et al. A method for lipoprotein (a) Isolation from a small volume of plasma with applications for clinical research. Sci Rep. 12 (1), 9138(2022).
  10. Hosseinzadeh, A., Messer, P. K., Urban, C. F. Stable redox-cycling nitroxide tempol inhibits NET formation. Front Immunol. 3, 391(2012).
  11. Gupta, A. K., et al. Activated endothelial cells induce neutrophil extracellular traps and are susceptible to NETosis-mediated cell death. FEBS Lett. 584 (14), 3193-3197 (2010).
  12. Obama, T., et al. Cooperative action of oxidized low-density lipoproteins and neutrophils on endothelial inflammatory responses through neutrophil extracellular trap formation. Front Immunol. 10, 1899(2019).
  13. Schröter, J., Schiller, J. Chlorinated phospholipids and fatty acids: Patho)physiological relevance, potential toxicity, and analysis of lipid chlorohydrins. Oxid Med Cell Longev. 2016, 8386362(2016).
  14. Nose, F., et al. Crucial role of perilipin-3 (TIP47) in formation of lipid droplets and PGE2 production in HL-60-derived neutrophils. PLoS One. 8 (8), e71542(2013).
  15. Manda-Handzlik, A., et al. The influence of agents differentiating HL-60 cells toward granulocyte-like cells on their ability to release neutrophil extracellular traps. Immunol Cell Biol. 96 (4), 413-425 (2018).
  16. Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
  17. Ohinata, H., Obama, T., Makiyama, T., Watanabe, Y., Itabe, H. High-density lipoprotein suppresses neutrophil extracellular traps enhanced by oxidized low-density lipoprotein or oxidized phospholipids. Int J Mol Sci. 23 (22), 13992(2022).
  18. Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils, and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. J Pathol. 247 (4), 505-512 (2019).
  19. Xu, J., et al. Differential roles of eosinophils in cardiovascular disease. Nat Rev Cardiol. 22 (3), 165-182 (2025).

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