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방법 논문

Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4를 검출하기 위한 복합 재조합효소 중합효소 증폭 CRISPR/Cas12a 분석

678 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68841

⸱

2025년 11월 14일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, Faculty of Agrisciences, Stellenbosch University, 2CIRAD, UMR PVBMT, 3Department of Genetics, Faculty of Agrisciences, Stellenbosch University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜에서, 결합된 재조합효소 중합효소 증폭 CRISPR/Cas12a 분석은 침입성 식물 병원체인 Fusarium oxysporum f. sp. cubense 열대 인종 4의 검출을 위해 설명된다.

초록

정기적이고 정확한 감시는 식물 질병의 효율적인 관리의 핵심입니다. 어떤 조치가 가장 적절한지, 예방, 근절 또는 조치가 필요하지 않은지 여부를 나타낼 수 있습니다. 숙주 식물의 증상만을 기반으로 한 감시는 생물적 및 비생물적 스트레스로 인한 증상의 유사성으로 인해 신뢰할 수 없는 경우가 많습니다. 중합효소연쇄반응(PCR) 및 정량적(q)PCR과 같은 실험실 기반 분자 방법은 식물 병원체 검출에 가장 일반적이고 안정적으로 사용되지만 값비싼 장비와 숙련된 작업자가 필요합니다. 여기에서는 침입성 병원체인 Fusarium oxysporum f. sp . cubense 열대 인종 4(Foc TR4)의 검출을 위해 단순화된 DNA 추출, 재조합효소 중합효소 증폭(RPA) 및 클러스터링된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복(CRISPR)/Cas12a(RPA-Cas12a)를 결합한 프로토콜을 설명합니다. 이 기술은 사용 가능한 분자 검출 분석에 비해 향상된 특이성으로 분석적으로 견고하고 비싸고 정교한 실험실 장비가 필요하지 않은 간단한 단일 튜브 검출 대안을 제공합니다.

서론

토양 매개 곰팡이 병원균인 Fusarium oxysporum f. sp. cubense(Foc)에 의해 발생하는 푸사리움 시들음병은 전 세계적으로 역사상 가장 파괴적인 국경을 초월한 식물 병원체 중 하나로 간주됩니다1. 새로운 지역에 도입되면 감염된 식물이 증상을 나타낼 때까지 Foc은 보이지 않습니다. 이 과정은 몇 달이 걸릴 수 있으며, 이로 인해 곰팡이가 자신도 모르게 정착하고 퍼질 수 있습니다. 일단 확립되면 탄력적인 클라미도스포자의 생산과 바나나 생산의 다년생 특성으로 인해 경제적으로 박멸하는 것이 거의 불가능합니다. 따라서 예방과 조기 발견의 중요성은 취약한 재배자를 보호하는 데 가장 중요합니다1. 현재 FOC 열대 인종 4(TR4)로 인한 이 질병의 전염병은 고위험 지역에서 증상이 있는 바나나 식물을 식별하기 위해 정기적인 감시를 통한 감지가 필요합니다. 물 스트레스 및 특정 영양 결핍과 같은 비생물적 제약은 Foc TR4 감염으로 인한 증상과 유사한 외부 황변을 유발합니다. 또한 다른 Foc 종족에 의한 감염으로 인한 증상은 구별할 수 없습니다. 따라서 신뢰할 수 있는 Foc TR4 검출을 위해서는 실험실 기반 정제와 후속 표현형 및 분자 기반 검출이 필요합니다2. Foc TR4 검출에는 PCR, 정량적(q) PCR 및 루프 매개 등온 증폭(LAMP) 분석 3,4,5,6,7을 포함한 다양한 분자 분석이 있습니다. 그러나 이러한 프로토콜의 대부분은 여전히 비싸고 전문적인 기술과 장비가 필요하며 이는 실험실 환경에서 수행되어야 합니다. 재조합효소 중합효소 증폭(RPA)은 등온으로 수행될 수 있으므로 이러한 장비의 필요성이 없으며 현장 검출 프로토콜8에 대해 고려될 수 있습니다.

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-Cas 시스템은 개선된 분자 진단을 위해 점점 더 많이 활용되고 있습니다9. 이러한 시스템은 저렴하고 간단하며 특수 장비를 사용할 필요가 없기 때문에 현장 감지를 고려할 수 있기 때문에 사용됩니다. CRISPR 기반 진단은 일반적으로 표적 서열의 등온 증폭에 이어 CRISPR-Cas 단백질을 통한 표적 인식 및 표적10,11의 존재를 나타내기 위한 DNA 또는 RNA 형광 리포터 염료의 측부 절단을 포함합니다. 특히 CRISPR-Cas12a 시스템에서 CRISPR RNA(crRNA)는 Cas12a가 핵산 표적을 인식하고 절단하도록 유도합니다. 이 crRNA는 상보적 서열에 대한 혼성화를 통해 관심 있는 특정 DNA 또는 RNA 영역을 표적으로 삼도록 설계할 수 있습니다. 일단 결합하면 Cas12a가 단일 뉴클레오티드 특이성으로 표적을 절단한 후 리포터 분자의 측부 절단이 뒤따른다12. 최근에는 CRISPR-Cas12a 시스템을 사용하여 경제적으로 중요한 다양한 곰팡이 식물 병원체 13,14,15,16,17,18,19,20을 검출했습니다.

이 프로토콜에서는 휴대용 형광계 및 저렴한 발광 다이오드(LED) 청색광 투과광기21 아래에서 육안으로 시각화된 Foc TR4의 검출을 위한 단순화된 DNA 추출, 재조합효소 중합효소 증폭(RPA) 및 CRISPR/Cas12a 기술(RPA-Cas12a)을 결합한 단일 튜브 검출 기술의 개발이 설명됩니다. 이 방법은 예방 및 봉쇄 전략을 개선하기 위해 현장 감지에 더욱 최적화될 수 있습니다. 유사한 접근 방식을 활용하여 다른 식물 병원체에 대한 Cas12a 기반 검출 분석을 설계할 수도 있습니다.

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프로토콜

1. 식물 재료에서 단순화된 DNA 추출

참고: 개요는 그림 1 을 참조하십시오.

  1. DNA 추출을 수행합니다.
    1. 증상이 있는 가성줄기의 각 조각 250mg을 별도의 추출 백으로 옮깁니다( 재료 표 참조).
    2. 식물 재료가 담긴 백에 0.5M NaOH-PVP(Table of Materials) 2mL를 추가합니다. 유봉과 같은 수동 분쇄기를 사용하여 추출 백에서 감염된 혈관을 분쇄합니다.
      참고: 백에서 충분한 액체 추출물을 얻기 위해 필요한 경우 1-2mL 보충 0.5M NaOH-PVP를 추가합니다.
    3. 100mM Tris-HCL(pH 8.0)(재료 표) 195μL를 1.5mL 튜브에 첨가합니다.
    4. 백에서 추출물 5μL를 100mM Tris-HCL(pH 8.0) 195μL와 함께 1.5mL 튜브에 피펫팅하고 추출물을 40배 희석합니다.
    5. 튜브를 15-30초 동안 소용돌이치고 사용할 때까지 -20°C에서 보관합니다.

2. crRNA 합성 및 품질 관리

  1. 전사를 수행합니다.
    1. RNA 전사 키트(재료 표)를 사용하여 0.2mL PCR 튜브에 다음을 추가합니다: 1.5 μL의 10x T7 반응 완충액, 1.5 μL의 각 dNTP, 1.5 μL의 T7 DNA 중합효소 혼합물, 1 μL의 뉴클레아제가 없는 물 및 100 μM T7 주형 DNA 10 μL의 총 부피 20 μL.
    2. 튜브를 수조 또는 PCR 기계에서 37°C에서 최소 4시간 동안 배양합니다.
    3. 분광 광도계(재료 표)를 사용하여 전사된 RNA의 양을 결정합니다. 뉴클레아제가 없는 물 또는 TE 완충액을 사용하여 RNA를 40μL의 부피에서 250ng/μL(10μg)로 희석합니다(보충 파일 1).
      참고: 전사된 RNA는 DNase 처리 및 세척 단계를 계속할 때까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
  2. DNase 처리 및 crRNA 정화를 수행합니다.
    알림: 모든 단계를 실온에서 수행하십시오. RNA와 DNase I 효소를 얼음 위에 보관하십시오.
    1. 제조업체 지침22에 따라 RNA 세척 키트(재료 표)에 포함된 DNase I로 RNA 샘플을 처리합니다.
    2. 프로토콜 II22에 따라 제조업체 지침에 따라 RNA 세척 키트를 사용하여 RNA 샘플을 세척합니다.
    3. 세척된 crRNA를 나노드롭하여 존재하는 양과 품질을 결정합니다. 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 RNA를 100ng/μL로 희석하고 사용할 때까지 -80°C에서 보관합니다.
    4. RNA 로딩 염료(재료 표)로 crRNA를 수조에서 10분 동안 70°C로 가열하고 crRNA를 1.5% 아가로스 겔에 전기영동하여 합성된 crRNA를 시각화합니다(그림 2).

3. 시험관 내 Foc TR4 검출을 위한 재조합효소 중합효소 증폭(RPA)-Cas12a 단일 튜브 반응

참고: 개요는 그림 3 을 참조하십시오.

  1. RPA 및 Cas12a 반응 혼합물을 준비합니다.
    참고: 이 단계는 시약과 재료가 사전 냉각된 상태에서 얼음 위의 DNA가 없는 공간에서 수행되는지 확인하십시오. 실험 전에 표백제와 70% 에탄올로 작업 표면과 피펫을 닦으십시오. 이 연구에 사용된 모든 올리고뉴클레오티드에 대한 정보는 표 1 을 참조하십시오.
    1. 별도의 0.5mL 튜브(재료표)에 20μL Cas12a 반응 혼합물을 다음 시약 부피로 준비합니다: 2μL의 10x NEBuffer r2.1(50mM NaCl, 10mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 100μg/mL 재조합 알부민, pH 7.9), 0.4μL의 10μM LbCas12a 단백질, 0.6μL의 100ng/μL crRNA, 10μM 리포터 0.4μL, 탈이온수 16.6μL.
      참고: LbCas12a 단백질, crRNA 및 리포터의 최종 농도는 각각 200nM입니다.
    2. 시약 부피가 있는 별도의 0.5mL 튜브에 9.5μL RPA 반응 혼합물을 준비합니다: 5μL의 2x 반응 완충액(제조업체 지침에 따른 최종 농도 1x), 1.6μL의 dNTP Mix(최종 농도 1.6mM), 10x Basic E-Mix 1μL(제조업체 지침에 따른 최종 농도 1x), 10μM에서 각 RPA 프라이머 0.5μL(최종 농도 각각 0.5μM), 0.5 μL의 20x 코어 반응 혼합물(제조업체 지침에 따른 최종 농도 1배) 및 0.4 μL의 탈이온수.
    3. 8-튜브 스트립을 얼음 위의 튜브 랙(재료 표)에 놓습니다.
    4. 20μL Cas12a 반응 혼합물을 튜브 베이스로 옮깁니다.
    5. 9.5μL RPA 반응 혼합물을 튜브 스트립 뚜껑으로 옮깁니다. 0.5μL의 280nM MgOAc(최종 농도 14nM)를 튜브 스트립 뚜껑의 RPA 반응 혼합물에 넣고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
    6. 0.5μL의 탈이온수를 비주형 대조군(NTC) 튜브 뚜껑에 넣고 RPA와 Cas12a 반응 혼합물이 결합되지 않도록 조심스럽게 닫습니다.
      참고: 결과의 신뢰성을 보장하기 위해 NTC(Non-Template Control)가 포함되어 있습니다.
  2. 템플릿 DNA를 추가하고 반응을 시작합니다.
    1. NTC를 제외한 튜브 스트립 뚜껑에 있는 MgOAc를 함유한 10μL RPA 반응 혼합물에 0.5μL의 주형 DNA를 DNA 대신 탈이온수로 첨가합니다. 분석이 의도한 대로 작동하는지 확인하기 위해 항상 알려진 양성 대조군 Foc TR4 DNA를 하나의 웰에 추가하십시오. 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
    2. RPA와 Cas12a 반응이 섞이지 않도록 튜브 스트립 뚜껑을 조심스럽게 닫습니다.
    3. 휴대용 형광계(재료 표)를 켜고 RPA-Cas12a 분석(보충 파일 2)에 대한 실행 프로파일을 생성합니다. 저장된 실행 프로파일을 열고 튜브 스트립을 휴대용 형광계에 넣어 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
      알림: 튜브 스트립을 다룰 때 튜브 바닥을 만지지 않도록 주의하십시오. 대신 왼쪽 상단과 오른쪽 끝의 바깥쪽 가장자리를 잡습니다.
    4. 30분 후 휴대용 형광계에서 튜브 스트립을 제거합니다. 튜브를 6번 뒤집어 RPA와 Cas12a 반응을 혼합하고 미니 원심분리기( 재료 표 참조)에서 5초 동안 회전시킵니다.
    5. 튜브 스트립을 휴대용 형광계에 다시 넣고 저장된 실행 프로파일을 사용하여 37°C에서 30분 동안 더 배양합니다.
  3. 결과를 시각화합니다.
    1. 휴대용 형광계에서 측정된 평균 상대 형광 단위(RFU)를 해석합니다(보충 파일 2 및 사용 설명서23).
    2. 청색광 투과광기를 사용하여 465nm 여기 파장에서 LED 청색광 아래에서 튜브를 시각화합니다(보충 파일 3). 휴대폰 카메라로 이미지를 캡처합니다.

   

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결과

Genie III 휴대용 형광계에서 수행했을 때 단순화된 DNA 추출과 결합된 RPA-Cas12a 분석을 사용하여 감염된 식물 재료에서 Foc TR4를 성공적으로 검출한 것이 그림 4A에 나와 있습니다. 양성 샘플은 가시광선(레인 6-8)을 나타내고 음성 샘플은 낮은 종점 형광(레인 1-5)을 나타냅니다. 샘플 튜브를 LED 청색광 아래에서 보았을 때 Foc TR4에 감염된 샘플도 가시광선을 보였습니다(그림 4B). 대조적으로, Foc TR4에 감염되지 않은 식물 조직의 DNA는 눈에 보이는 형광을 나타내지 않았습니다.

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토론

정기적인 감시는 Foc TR4 및 기타 중요한 침입성 해충의 효과적인 예방 및 봉쇄 노력을 위한 중요한 전략입니다. 현장에 적용할 수 있고 병원체를 빠르고 정확하게 식별할 수 있는 검출 프로토콜은 의사 결정을 신속하게 추적하고 감시 노력과 관련된 비용을 제한할 수 있습니다. 이를 위해 여기에 제시된 프로토콜은 Foc TR421의 빠르고 민감한 검출을 위해 RPA 및 Cas12a 반응을 결합한 단일 튜브 분석에 포함된 샘플링된 식물 재료에 대해 직접 수행된 단순화된 DNA 추출을 결합했습니다.

제시된 결합된 RPA-Cas12a 프로토콜의 가장 중요한 장점 중 하나는 제공하는 이중 특이성입니다. 증폭 단계에서 특정 RPA 프라이머에 의존하고 Cas12a crRNA에 의한 표적 서열의 인식 후 단일 뉴클레오티드 특이성을 갖는 것으로 나타났습니다12

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공개 사항

저자는 경쟁하는 재정적 또는 지적 이해관계를 선언하지 않습니다.

감사의 글

우리는 평가되지 않은 연구자 프로그램에 대한 경쟁적 지원에 따라 남아프리카 국립 연구 재단(보조금 번호: 138109)의 자금 지원을 인정합니다. 또한 유럽 연합 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램 Marie Sklodowska-Curie Fellowship 자금 지원은 INDICANTS 프로젝트 보조금 번호: 890856에 따라 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
EnGen lba Cas12a (Cfp1) 단백질뉴잉글랜드 바이오랩스M0653T
EnGen lba Cas12a 희석제뉴잉글랜드 바이오랩스B0653A
에펜도르프 PCR 튜브머크EP0030124332
에펜도르프 세이프락 마이크로 시험관머크EP0030121708
추출 백 유니버설비오레바430100
GeneRuler 100 bp DNA 사다리써모 피셔 사이언티브SM0241 / SM0242
지니 원심분리기 미니-6KO옵티진옵-퓨지
지니 III옵티진https://www.optigene.co.uk/instruments/genie-iii/ 
지니 스트립 홀더옵티진GBLOCK-01 / GBLOCK-02 / GBLOCK-03
지니 스트립옵티진OP-0008-50 / OP-0008-500
HiScribe T7 고수율 RNA 합성 키트뉴잉글랜드 바이오랩스E2040S
NanoDrop ND-1000 자외/비스 분광광도계써모 피셔 사이언티브https://caeonline.com/buy/spectrometers/nanodrop-nd-1000/293669253
NEBuffer 3뉴잉글랜드 바이오랩스B7003S
NEBuffer r2.1뉴잉글랜드 바이오랩스B6002S
폴리비닐피롤리돈(PVP) 분말시그마-올드리치9003-39-8
RNA 클린 및 농축기-5 키트자이모 리서치R1013
RNA 로딩 염료써모 피셔 사이언티브R0641
스마트블루 블루라이트 트랜스빌리미네이터아큐리스 인스트루먼트E4000-E
수산화나트륨(NaOH) 펠릿머크, 엠파르타K277
트리스(하이드록실메틸) 아미노메탄머크77-86-1
트위스탬프 리퀴드 기본 키트트위스트 닥스TALQBAS01

참고문헌

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