전층 골연골 결함의 양 모델 구축 및 평가

요약

여기서는 양 무릎에서 통제된 골연골 병변을 생성하는 통합 프로토콜을 제시하여 뼈 및 연골 조직 재생 연구에 적합한 실험 모델을 구축합니다. 프로토콜은 동물 복지에 미치는 영향과 결과 변동을 최소화하는 기법을 사용하여 대퇴골 과과에 전층 골연골 결손을 유도하는 방법을 제시합니다.

초록

노화, 외상, 유전적 소인, 생활 습관이 인체의 연골 손상에 영향을 미칩니다. 부상을 입으면 일상 활동에서 발생하는 지속적인 모욕은 골관절염과 같은 병리적 상태를 유발할 수 있으며, 이는 전 세계적으로 장애와 사회경제적 손실의 주요 원인입니다. 관절 연골 손상을 치료하는 모든 정형외과 의사의 주요 목표는 병변의 해부학적 범위를 줄이고, 연골 표면을 복구하며, 관절 안정성을 회복하는 것이었습니다. 동물 모델은 치료제 개발에 필수적이지만, 연골 결손에 대한 현재의 모델은 만족스럽지 못합니다. 양의 골연골 병변은 인간 관절 환경에서 연골과 뼈 회복을 돕는 새로운 치료법과 생체재료를 시험하는 데 유용한 모델입니다. 이 연구는 대형 동물에서 급성 골연골 결손을 유도하는 효율적인 프로토콜을 확립하였습니다. 양쪽 내측 대퇴과에 표준화된 병변이 형성되었습니다. 한쪽 무릎은 무작위로 젤라틴-메타크릴로일 치료를 받고, 반대쪽 무릎은 대조군으로 지정되었다. 수술 6개월 후, 대퇴 과두 부위를 제거하고, 해리된 무릎 관절을 석회화하여 파라핀에 박힌 뒤 절단하여 헤마톡실린과 에오신으로 염색했습니다. 병변 평가에 점수를 사용하였다. 이 방법론은 부상 유도 후 즉각적인 거시적 관찰을 가능하게 합니다. 또한 이 모델은 임상 연골 결함을 효과적으로 복제하여 병리학 연구와 혁신적인 치료 접근법 개발에 유용한 모델을 제공합니다.

서론

연골은 설사 관절에서 뼈 사이에 마찰이 없는 표면을 제공함으로써 골격계의 기계적 능력을 유지하는 데 필수적이며, 이를 통해 관절 표면 침식을 방지합니다^. 연골이 이러한 까다로운 기계적 기능을 수행하는 능력은 특히 매우 높은 수분 함량을 가진 세포외 기질의 독특한 구성과 조직에 크게 의존합니다. 물은 관절 연골의 구조와 기능에 중요한 역할을 하며, 약 70-80%의 구성 요소를 차지합니다. 물은 압축 시 하중을 지탱하는 주요 원소입니다. 조직이 압축력에 저항하는 능력은 매트릭스 내에서 물의 구조와 제한에 달려 있습니다. 이 조직은 콜라겐과 프로테오글리칸 같은 연골의 주요 고분자, 특히 히알루론산 결합 응집체와 물이 상호작용함으로써 가능하다^. 이들은 물 흐름을 조절하고 제한하는 격리 구조물 역할을 합니다. 이 상호작용은 조직에 단지 강성뿐만 아니라 변형 후 회복 능력과 탄력을 부여합니다. 자유수, 결합된 물, 그리고 고분자 기질 간의 상호작용이 연골 생체역학적 거동의 핵심을 이룹니다^.

관절에 도달하는 물리적 및 기계적 하중을 지지하고 분산시키는 놀라운 능력에도 불구하고, 손상 후 관절 연골(AC)은 낮은 연골 유사분열 활동과 조직 혈관 형성 불완전으로 인해 자발적 수리 가능성이 제한적입니다^. 관절 손상은 보통 조직의 95%를 차지하는 세포외기질(ECM) 분자와 단백질의 점진적 손실과 관련이 있으며, 이들은 AC³에 생체역학적 특성을 부여합니다. ECM 구성 요소의 합성과 분해 사이의 불균형이 이화화 과정으로 이동하면 전 세계적으로 가장 흔한 퇴행성 관절 질환인 골관절염(OA)이 발생할 수 있습니다. 골관절염은 성인 인구의 약 10-12%에 영향을 미치며, 통증을 유발하고 이동성을 제한하며 환자의 자율성을 현저히 감소시킵니다⁴. 골관절염은 평생 관절에 누적된 손상으로 인해 노령 인구에서 더 흔합니다; 그러나 성별, 유전적 소인, 비만, 일상 습관 등 다양한 위험 요인이 임상 질환 발병과 연관되어^{있습니다.} 지금까지 골관절염 치료법은 임상 증상 관리와 가장 심각한 경우에 대한 전관절 치환술로 구성되어 왔습니다⁵. OA를 효과적으로 치료할 견고하고 재현 가능하며 신뢰할 수 있는 치료 전략이 없기 때문에, 관절 연골 손상과 관련된 문제를 이해하고 해결하기 위한 혁신적인 접근법이 연구되고 있습니다.

관절염 관절에서 관절 움직임을 복구, 재생, 향상시키기 위해 재생의학의 발전이 손상된 AC ^6,7 회복의 새로운 희망으로 떠올랐습니다. 자가연골세포의 사용과 ECM 이식 및 관절 내 줄기세포 주입을 결합한 것은 이 분야의 최신 기술을 나타냅니다 ^8,9,10. 이러한 접근법의 주요 과제는 이식 세포에 의한 적절한 분화와 기능적 ECM 합성을 보장하는 것입니다. 자가연골 연골은 섬유연골을 형성하거나 비대 상태로 진행하여 AC의 생리적 특징을 재현하지 못하는 새로운 기능 장애 조직을 만들어 회복이 불완전하고 종종 후기 악화를 초래합니다¹¹. 생체재료는 조직 재생 중 세포 행동을 안내하는 데 사용될 수 있으며, 세포가 새롭고 자연적이며 기능적인 세포외기질을 부착하고 합성할 수 있도록 임시적인 비계를 제공합니다 12,13,14. 연골 공학에 이상적인 생체재료는 주변 조직, 특히 연골하 뼈와의 강한 통합을 보장해야 하며, 이 경계면의 실패는 장기적인 수리를 방해합니다. 그러나 골연골 비계의 연골과 뼈층 간의 약한 결합과 숙주 조직과의 부적절한 통합은 여전히 주요 도전 과제로 남아 있습니다¹⁵. 비계는 원래 골연골 구조를 모방하려 하지만, 복잡한 경계 미세구조를 재현하는 것은 여전히 어렵습니다. 이는 연골과 뼈 재생을 동시에 지원하면서 경계면의 안정성을 유지할 수 있는 생물학적 특성을 가진 스캐폴드 연구개발의 중요성을 강화합니다¹⁶. 콜라겐에서 유래한 젤라틴은 연골 조직의 핵심 성분으로, 세포 결합 모티프와 생분해성 같은 특성을 지니고 있어, 골연골 병변 치료를 위한 재생 인자와 결합할 때 지지 생체재료로서의 잠재력을 시사합니다. 메타크릴 무수물로 화학적으로 변형하여 젤라틴 메타크릴로일(GelMA)를 형성하면 광가교결합이 가능해져 주입 및 현장 광중합이 가능해지며, 재생의학 응용에 기계적 안정성을 향상시킵니다¹⁷.

골연골 병변은 재생 능력이 제한적이어서 임상적으로 큰 도전이 됩니다. 무릎 관절 손상의 대형 동물 모델을 활용한 전임상 연구는 질병 기전과 치료 결과에 영향을 미치는 변수를 체계적으로 평가할 수 있어 중개 연구에 필수적입니다. 일반적으로 사용되는 종으로는 돼지, 염소, 개, 말, 양이 있으며, 각각은 실험 설계에서 고려해야 할 특정한 장단점을 가지고 있습니다. 더욱이, 이들 종 모두 인간에서 관찰된 것처럼 연골 및 골연골 결손의 내인성 수리가 제한^{적입니다.} 이 모델들이 인간 결과를 예측할 수 있도록 하기 위해서는 해부학, 생리학, 생체역학적 특성과 같은 관련 매개변수를 재현해야 합니다¹⁸. 비교를 위해, 대퇴골 과두 내 인간 관절 연골 두께는 1.8에서 2 mm¹⁹ 사이이며, 치료가 필요한 연골 병변의 직경은 일반적으로 10 mm 이상^입니다.

돼지 모델은 관절 크기, 연골 두께, 체중 부하 요구가 인간과 매우 유사하기 때문에 연골 및 골연골 재생 연구에 유리합니다¹⁸. 괴팅겐 미니피그와 같은 일부 미니어처 돼지 품종은 다루기 쉽고²¹개월 18개월에서 22개월 사이에 골격 성숙에 도달합니다. 연골 두께는 1에서 2 mm 사이이며, 6에서 8 mm 사이의 결손은¹⁸개까지 생길 수 있습니다. 뼈의 특성, 예를 들어 트라베선 두께, 골 부착 속도, 콜라겐 섬유 조직 등이 인간과 유사하다²². 하지만 돼지 모델에도 한계가 있습니다: 미니어처 품종에서도 무릎(스티플) 관절이 인간보다 작아 큰 실험적 결함이 발생하기 어렵습니다. 더불어, 대부분의 연구는 유지보수 비용 때문에 골격이 미성숙한 동물을 사용하며, 이는^{수리 잠재}력을 과대평가할 수 있습니다.

염소는 관절 해부학, 생체역학, 연골 두께를 인간과 비슷하게 보인다²⁴. 전문 시설이 필요 없고, 다루기 쉽고, 비교적 저렴한²⁵. 염소 연골 두께는 0.8에서 2.0 mm 사이이며, 가장 많이 보고된 치명적 결함 크기는 6 mm²⁶입니다. 하지만 품종, 크기, 성별에 따라 연골 두께에 큰 차이가 있어 결과가 일관되지 않을 수 있습니다²⁷. 연골과 연골하 골 비율과 트라백 골 구조도 인간과 유사하다²⁸. 골격 성숙은 비교적 늦게,²⁹세 24개월에서 36개월 사이에 발생합니다. 생체역학적 관점에서 염소 무릎은 인간과 유사한 관절 압력과 주기적 하중을 경험^{하지만, 보}행 시 무릎 굴곡은 더 크다(염소는 50°-70°, 인간은 <30°)하여 뚜렷한 접촉 부위가³⁰. 이 차이와 높은 피크 압력이 결합되어 연^{골 수리 효율}이 떨어질 수 있습니다.

대형 동물 모델 중에서 개는 재활 요법, 관절 고정, 러닝머신 걷기, 수영, 통제된 하중 부하 지지 운동 훈련을 견딜 수 있는 능력으로 두드러집니다¹⁸. 관절 연골 두께는 0.9에서 1.3 mm 사이이며, 임계 결손 크기는 약 4 mm로^{인간 모델과의} 직접적인 비교가 제한적입니다. 골격 성숙은³¹세의 8.5개월에서 13.7개월 사이에 발생합니다. 해부학적으로 개 무릎은 인간 무릎과 다르며, 품종별 생체역학, 하중 패턴, 성숙도의 차이가 결과 외삽을 복잡하게 만듭니다³². 이러한 해부학적 차이와 작은 결손 크기에도 불구하고, 개 모델은 재활 프로토콜이나 인간과 유사한 자발적 연골 병리학 연구에서 여전히 가치가 있습니다. 그러나 실험적 사용은 윤리적 고려에 의해 제한된다²⁹.

말 모델은 연골 복원 연구를 위한 가장 큰 동물 모델로, 자연스럽게 연령 또는 외상 관련 연골 병변과 인간과 유사한 골관절염을 발생시킵니다³³. 말은 인간과 유사한 해부학적·생체역학적 특징을 보인다. 예를 들어, 무릎이 곧게 서 있고, 큰 관절 크기, 연골 두께가 2mm에서 3mm 사이로 인간 연골에 더 가까워 보행 시 무릎이 완전히 전신하며, 뼈 밀도도³⁴에 이르렀다. 골격 성숙은 24개월에서 48개월 사이에 발생하며, 일반적으로 연구되는 결손 크기는 6에서 20^{mm 사이}입니다. 제한 사항은 이동 시 말 관절에 가해지는 높은 수직 하중이 인공물에 인간보다 더 큰 힘에 노출되고 장기적인 치유를 방해한다는 점입니다³⁵. 게다가 획득 및 유지보수 비용이 높으며, 전문 시설^{이 필요합니다.}

양은 구하기 쉽고, 온순하며, 관절 수술에 대한 내성이 높고^{, 다루}기 쉬워 연골 수리 연구의 모델로 널리 사용됩니다. 양의 골격 성숙은 보통²⁵세 정도 2-3세에 도달합니다. 또한 난 무릎은 인간 무릎 관절과 해부학적, 생체역학적 유사성을 보인다³⁸. 내측 대퇴과의 연골 두께는 0.7에서 1.7 mm 사이이며, 골밀도와 접촉 압력도 유사하지만,³⁹번 양에서 골 부피 비율이 더 높습니다. 연골 두께가 줄어들면서 유발된 결손은 종종 연골하 뼈까지 확장되어, 이 모델은 골연골 결함 연구에 더 적합하다³². 직경 6에서 8mm의 병변은 일반적으로 대퇴골 과자와³²번 트로클레아 같은 부위에 형성됩니다. 더 나아가, 난소 모델은 양측 연구에도 장점이 있는데, 동일한 동물 내에서 처리된 부위와 대조군 부위를 비교할 수 있어 숙주 관련 변이성을 줄이고 일관성과 재현성을 개선하며, 필요한 동물 수를⁴⁰마리로 최소화합니다. 각 모델은 인간 생리학과 생체역학과의 유사성 정도가 다릅니다. 따라서 모델 선택은 생물학적 관련성, 실용적 타당성, 윤리적 고려사항 사이에서 균형을 이루어야 합니다. 본 연구에서는 계절성 무분기 동안 평가된 12개월 된 초산암컷 양을 포함하였다.

이 연구는 대형 동물에서 급성 골연골 결손을 유발할 효과적인 프로토콜을 설계하고자 했습니다. 프로토콜은 재생의학 연구에 적합한 모델을 구축하기 위해 전층 골연골 병변을 만드는 것을 포함합니다. 또한, GelMA 하이드로겔의 적용은 조직 치유 가이드이자 재생 분자 및 세포 전달의 미래적 방법으로 탐구되고 있습니다. 이 프로토콜은 양의 무릎 관절 연골에 골연골 병변을 만드는 수술 절차를 설명합니다. 이 기술은 재생의학을 위한 다른 대형 동물 모델에서 유사한 손상을 유도하는 등 다양한 조직공학 응용 분야에 적응할 수 있습니다.

프로토콜

이 연구는 연구 윤리 위원회의 승인을 받았으며, 2023년 6092250823 번호가 붙은 윤리적 발표 증명서로 인증받았습니다. 본 연구에서는 12개월 된 화이트 서퍽 암컷 양 9마리가 선정되었습니다. 결손은 각 동물의 양쪽 내측 대퇴과에 생겼습니다. 빈 결함이 대조군으로 사용되었습니다. 각 동물은 한쪽 무릎을 GelMA 치료에 무작위로, 다른 한 쪽은 대조군으로 배정되었습니다. 이 전략을 통해 자연스러운 재생 능력을 평가하고 유전적 요인과 골격 성숙도와 같은 개별 변이의 영향을 줄일 수 있었습니다. 동물들은 6개월간 관찰하여 유리 연골 형성을 평가하였습니다.

1. 마취 절차

1. 수술 전 약 24시간 동안 동물에게 음식과 물을 주지 마세요.
2. 동물에게는 근육 주사용 메페리딘 4mg/kg과 미다졸람 0.3mg/kg을 함께 투여합니다.
3. 사용 하루 전, 방이 비어 있을 때 만약 마취용 증발기를 채우고, 직업적 노출 위험을 최소화하기 위해 보호 장갑을 착용하세요.
4. 각 시술 전에 마취 회로에서 누출 여부를 점검하고, 기관 생물안전 지침을 준수하여 환기가 잘 되는 곳에서 모든 조작을 수행하세요.
5. 15분 후, 18G 카테터로 동물을 캐뉼레로 고정하고 10 mL∙^kg-1∙^h-1 비율로 락테이트 링거의 용액을 투여합니다.
6. 정맥 마취를 1% 프로포폴 4 mg/kg 용량으로 투여합니다.
7. 7.5-8.0mm 수렴된 기관내기관관으로 기관삽관을 삽입하고, FiO₂ 1.0, 유량 50 mL/kg의 반폐쇄형 원형 호흡 시스템을 사용하여 자연 환기 상태로 유지합니다.
8. 부분정맥 마취(PIVA) 기법을 사용하고, 프로포폴은 0.1 mg∙^{kg-1 min-1} 연속 주입 상태로 유지하며, 적절한 수술적 마취 평면을 달성하기 위해 이소플루란 농도만 조절합니다. 시술 내내 마취 깊이를 모니터링하세요.
9. 신경 국소 검사에 의해 대퇴신경과 좌골신경의 신경주위 차단 시술을 시행합니다. 각 차단마다 2% 리도카인 0.2 mL/kg을 투여합니다.
   참고: 수술은 동물이 외과적 마취를 받았음이 확인된 후에만 시작해야 합니다(단단한 발굽 꼬집기에도 반응이 없고 턱 긴장이 없음).

2. 생체 내 외과 절차

1. 면도한 무릎을 국소 소독제인 클로르헥시딘 글루코네이트로 소독한 후 수술실에서 등쪽 디큐비투스 자세로 놓으세요.
2. 동물의 무릎을 만져 관절강을 찾아 정확한 절개 부위를 파악하세요. 이중 곡선 피부 절개를 하는데(외측 대퇴골 상과에서 시작해 경골결절 부근 내측에서 끝납니다).
3. 슬개건, 슬개골, 슬개골 인대, 그리고 관절낭의 내측 부분을 식별합니다. 캡슐을 절개하여 내측 대퇴골 과자를 노출하세요. 무릎을 과곡시켜 과관절 연골의 가장 먼 부위를 시각화하세요.
4. 동물의 과두 부위에 약 3-5cm 크기의 외과적 절개를 하세요. 과두에 접근하려면 피부 밑의 조직층을 제거하고, 절개 부위를 깨끗하게 유지하여 오염을 방지하세요.
5. 주사기와 바늘을 사용해 활액을 채취하세요. 샘플의 일부를 EDTA 튜브로 옮겨 분석하고, 남은 재료로 도말 슬라이드를 준비합니다.
6. 견인기를 위치시켜 요두를 완전히 노출시키세요. 과두가 노출될수록 다음 단계에서 손상을 유도하기가 더 쉬워집니다.
   참고: 이 시기에는 동물의 발을 주의하세요. 무릎을 굽히거나 전장하면 과두를 노출시키는 데 도움이 될 수 있습니다.
7. 정형외과용 드릴에 8mm 트레핀 비트가 장착되어 내측 대퇴과과(내측 대퇴과) 중앙에 직경 8mm, 깊이 5mm의 결절부를 드릴링하여 의도치 않은 크기나 모양을 방지하고, 관절 연골의 가장 먼 부위에 대해 0° 각도를 유지합니다.
   참고: 천공술은 가능한 가장 낮은 속도로 수행하고, 드릴 컨트롤을 부드럽게 조작하며, 연골과 연골하뼈를 절단할 만큼만 회전시키고, 저속에서도 0.9% NaCl을 사용해 실온에서 국소 냉각을 수행하세요.
8. 정형외과 망치와 골절기를 사용하여 골연골 플러그를 외과적으로 제거합니다.
9. 상처 확장부를 멸균 거즈로 청소하여 병변 내부에 혈액과 조직 이물질이 없도록 하세요.
10. 200μL 액체 20% GelMA 제형을 200 μL 액체 제형에 0.25% (w/v) 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(LAP)를 광시작제로 사용하여 손상 부위 내부에 표면에 도달할 때까지 발라줍니다.
11. GelMA 하이드로겔을 395-405nm LED(총 출력 9W)에서 시료에서 약 5cm 떨어진 곳에 180초 동안 포토크로스링크를 부착합니다. 이 조건에서 표면에서의 추정 복사량은 ~10 mW/cm²로, 총 노출 에너지는 약 1.8 J/cm²에 달합니다.
    참고: 자외선을 사용할 때는 보호 안경을 착용하세요.
12. 리트랙터를 조심스럽게 제거하세요.
13. 혈청 형성을 막기 위해 다양한 조직층에 독립적인 봉합사로 병변을 봉합하세요. 필요한 봉합 수는 수술 절개 범위에 따라 달라집니다.
14. 감염을 예방하기 위해 봉합선에 멸균 붕대를 감으세요.

3. 수술 후 관리

1. 마취 회복 중에는 심박수(분당 70-90회), 호흡수(분당 12-20회), 체온(39 °C에서 40.5 °C), 모세혈관 재충전 시간이 1-2초인 정상 점막 등 활력 징후를 모니터링합니다. 맥박이 쉽게 감지되는지 확인하기 위해 얼굴 및 대퇴동맥을 정기적으로 촉진하세요.
   참고: 마취 회복은 조용하고 깨끗하며 따뜻하고 푹신한 환경에서 이루어져야 하며, 조명이 최소화되고 소음이 적은 환경이어야 합니다.
2. 국소 페니실린(벤자틴 페니실린 G: 1,250,000 IU; 프로카인 페니실린 G: 1,250,000 IU; 디하이드로스트렙토마이신 황산: 1.25g; 요소: 2.50 g)을 사용하여 수술 부위 드레싱을 하루 10일간 시행합니다.
3. 마취에서 깨어난 직후 동물이 네 발로 걷는 자세를 유지하고, 수술된 팔다리에 체중을 실으며, 불편함의 징후가 없도록 하세요.
4. 수술 후 진통은 멜록시캄(24시간마다 0.4 mg/kg)과 트라마돌(12시간마다 2 mg/kg)으로 5일간 투여되었습니다. 수술 후 양의 통증과 고통을 평가하기 위해 특정 안면 행동 단위(안와 조임, 피로 반응, 귀 위치, 머리 위치 등)를 기반으로 검증된 도구인 Sheep Grimace^{Scale 41}을 사용해 통증 관련 표정을 확인한 후 추가 구조용 트라마돌 투여가 이루어졌습니다.

4. 조직학 분석

1. 수술 후 6개월 후에 안락사를 시행하세요. 안락사 약물을 투여하기 전에 깊은 진정을 달성하기 위해, 동물에게 케타민(10 mg/kg)과 자일라진(1 mg/kg)을 정맥 주사로 투여하며, 임상 절차에서 일반적으로 권장되는 용량보다 의도적으로 더 높은 용량을 사용하여 심층 진정의 신속한 발현을 보장하도록 해야 하며, 이는 인정된 안락사 프로토콜에 의해 뒷받침됩니다. 그 후 프로포폴을 투여하여 마취 혼수상태를 유도합니다. 그 후 호흡 및 심혈관 정지가 일어나고 모든 보호 반사가 사라질 때까지 2 mEq/kg 정맥 주사로 염화칼륨을 투여합니다.
2. 원위 대퇴골 골단을 절개하여 과두 부위를 제거하세요. 해리된 무릎 관절을 10% 중성 완충 포르말린에 고정하고, 34°C에서 5% EDTA(에틸렌디아미네테트라아세트산)에 탈석시키며, EDTA 용액은 3일마다 교체합니다.
3. 재료를 파라핀에 박고 4μm 단위로 잘라내세요. 슬라이드에서 파라핀을 제거하려면 65°C에서 자일렌에 3분 x 5분간 담가두세요. 에탄올에 10-20회 담근 후 5분⁴²분간 탈이온수에 수분해하세요.
4. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색의 경우, 해리스 헤마톡실린으로 단면을 염색하고 에오신으로 역염색을 한 뒤, 자동 슬라이드 주사 현미경으로 20× 배율로 스캔한 후 링크된 소프트웨어를 사용해 분석하세요.
5. 골관절염 연구학회 국제(OARSI) 조직병리학 이니셔티브⁴³에 따라 병변을 평가하세요: 0점은 연골이 정상임을 의미합니다; 점수 1은 연골 손실 없이 표재성 세동을 반영합니다; 점수 2는 표면 영역 바로 아래 층에 도달하는 수직 틈새와 표면 층의 부분적 손실에 해당하며; 점수 3은 석회화된 연골까지 뻗어 관절면의 25% 미만에 영향을 미치는 수직 균열 또는 침식을 나타냅니다; 4, 5, 6 점수는 석회화된 연골에 도달하는 수직 틈 또는 침식을 나타내며, 각각 관절면의 25-50%, 50-75%, 75% 이상을 포함합니다.
   참고: 본 연구에서는 석회화된 연골로 뻗어나가는 수직 틈 또는 침식이 있으며 관절면의 25% 이상을 포함하는 병변에 4점을 부여하였습니다.

결과

골연골 결손 유도

이 연구는 대형 동물에서 급성 골연골 결손을 유도하는 효율적인 프로토콜을 개발하는 것을 목표로 했습니다. 이 상처들은 수술 중 기계적으로 발생하여 직경 약 8mm, 깊이 5mm의 병변을 형성했습니다(그림 1). 국제 연골재생 및 관절보존학회(International Colilage Regeneration and Joint Preservation Society)가 산정한 점수를 고려할 때, 이 유형의 손상은 연골이 연골하 뼈에 도달하는 4등급 병변에 해당합니다.

적절한 트레핀 정렬과 정확한 깊이 제어는 모델 재현성을 위한 중요한 단계입니다. 이 연구에서는 모든 천공이 0°(직각)로 이루어져 비대칭 연골과 연골하 골 제거 위험을 줄였습니다. 대퇴 과두의 가장 먼 부위를 해부...

토론

연골 치료에서 연골 분화 및 ECM 성숙의 불충분성 등 문제를 극복하기 위해 비임상 연구는 치료 전략 평가에 필수적입니다. 손상된 연골 조직의 비임상 모델에 대한 방법은 이전에^{다양한 기법}을 사용하여 보고된 바 있습니다. 그러나 문헌에는 여전히 대형 동물의 무릎에서 급성 골연골 손상을 유도하는 상세한 보고서와 표준화된 절차가 부족해 연구마다 상당한 차이가 발생한다. 여기서 제시된 프로토콜은 대형 동물의 골연골 조직에서 국소 손상을 유발하는 재현 가능하고 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다.

브라질 보건 규제청(ANVISA)에 따르면, 임상 실무에 혁신적인 치료를 도입하기 위해서는 첨단 치료 의약품 개발을 위한 비임상 연구가 필수적이다(번호 506/2021). 이 연구들은 GMP 기준에 따라 수행되어야 하며, 안전성, 생체 분포, 약물동역학, 약역학 및 중개 연구에 중요한 기타 매개...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
25 폴리글카프로네 봉합실, 번호 2-0	에티콘		일반적인 연부 조직 봉합을 위한 봉합 실은 관절낭과 피하 세포 조직을 봉합하는 데 사용되었습니다.
항체 항-베타 및 튜불린	인비트로젠	PA516863	세포골격의 미세소관을 구성하는 두 소단위인 &β;-튜불린에 대한 항체(α/β)
마취 장치	HB 병원		흡입 마취 장비
액시오 스캔 Z1	독일 뮌헨, 자이스		현미경
벤자틴 페니실린 G	우로피노		항생제
카테터 18 G	솔리도르		정맥 카테터
세팔렉신	버박		항균제 치료
클로르헥시딘 디글루코네이트 수용액	리오쿠와 이아쿠테; 미카		피부 소독에 사용되는 소독제
커프드 기관내관 7.5– 8.0 mm	솔리도르		커프드 기관내관
다피	시그마	D9542	형광 염료
둘벡코의 변형 독수리 미디엄	깁코	12100-046	세포 배양 배지
디하이드로스트렙토마이신 설페이트	우로피노		항생제
EDTA 튜브	벡턴 디킨슨	362788	수집관
이오신	네온	1795	세포 형태를 시각화하는 데 사용되는 염료, 염색 및 nbsp; 세포질.
에틸렌디아미네테트라아세트산	시그마	E5134	뼈 조직의 점진적인 탈석화를 촉진합니다
태아 소 혈청	깁코	12657-029	성장인자를 포함한 세포 배양 보조제
포르말린	시그마-올드리치	47608	조직 형태를 보존하세요
젤마 냉동(Lyophilized)	티슈랩스	GLMA-LYO-1	광가교결합 하이드로겔
해리스 헤마톡실린	라보클린	620503	세포 형태를 시각화하는 데 사용되는 염료로, 핵을 염색합니다.
이소플루라노	크리스토와 아케트; 리아		마취 유지
케타민 10%	베트닐		안락사 절차
락테이트 링저 용액	프레제니우스 카비		수액 치료
L-글루타민 200 mM	깁코	25030-081	세포 배양을 위한 필수 아미노산
리도카인 하이드로클로라이드	크리스토와 아케트; 리아		국소 마취
생전/사망 생존력/시토톡시티 키트	인비트로젠	L3224	세포 생존 가능성을 평가하는 형광 분석 키트
멜록시캄	Ouro fino		수술 후 기간 동안 항염증 및 진통제를 투여합니다
미다졸람 염산염	크리스토와 아케트; 리아		마취 전 약물
모노니론 봉합실, 번호 3-0	에티콘		피부 봉합에 사용되는 봉합사
NaCl 0.9%	크리스탈리아		식염수 용액
신경 국소화	뉴로로컬라이즈도어 DL 250 델타라이프		신경국소 마취와 말초 신경 전기자극기에 의해 유도되는 국소 마취.
정형외과 드릴	캔랰레이티드 미니 정형외과 드릴 (섬세함) - 크롬 도금 만드렐 - 마키타 브랜드		정형외과 수술에 사용됩니다.
정형외과 망치와 nbsp;	에들로	해머 뉴필드 (10-3155)	일반적인 특징: 길이 20cm, 무게 560gr; 재료: 고품질 스테인리스 스틸; 사용: 외상학 및 정형외과 시술에 적합하며, 통제된 충격이 필요합니다. 인증: 제품은 ISO(국제표준화기구): 13485:2016과 같은 품질 인증을 받았으며, 유럽 준수 및 우수 제조 기준(Good Manufacturing Practices) 기준을 충족합니다.
람보트 골절	에들로	람보트 오스테오톰 (10-0749)	람보트 오스테오톰(6 mm x 17 cm / 6 3/4")은 주로 정형외과 수술과 뼈 조작이 포함된 신경외과 시술에 사용되는 고정밀 수술 기구입니다. 폭 6mm의 끝을 가진 이 장치는 섬세한 절개, 재형성, 그리고 조밀한 연골과 연골하 뼈의 제거에 이상적입니다.
페니실린 스트렙토마이신	깁코	15140-122	세포 배양에서 널리 사용되는 광범위 항생제
페티딘 하이드로클로라이드	크리스토와 아케트; 리아		마취 전 약물
염화칼륨 19.1%	샘텍		안락사 절차
프로카인 페니실린 G	우로피노		항생제
프로포폴	크리스토와 아케트; 리아		마취 유도 및 유지
링거 락테이트	크리스토와 아케트; 리아		수액 치료
반폐쇄형 원형 호흡 시스템	HB 병원		마취용 호흡 회로
멸균 크레이프 붕대	크레머		멸균 크레이프 붕대로, 수술 중인 팔다리의 원위 끝을 덮는 데 사용된다.
Stimuplex D, 22 Ga. x 2 in. (50 mm) 절연 바늘과 연장 세트, 30° 베벨 (STIMD2250/30)	브라운		신경주부 국소 마취
트라마돌 염산염	크리스토와 아케트; 리아		수술 후 진통
트레핀 드릴	본 트레핀 드릴, mm 직경 및 대시; 모델: 콘트라앵글, 브랜드: 수술용 WF		골 수집용 트레핀 드릴 8.0 mm; 수술용 강철로 생산되었으며; 골이식 수술에 사용되었으며; 조직학적 분석이나 자가 이식을 위해 뼈 블록을 제거하는 역할을 합니다.
자일라진 10%	베트닐		안락사 절차