Method Article

일차 쥐 부고환 지방세포에서 지방분해의 정확한 정량화를 위한 글리세롤 방출의 MTT 기반 정상화

DOI:

10.3791/68853

⸱

September 9th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1College of Bee Science and Biomedicine, Fujian Agriculture and Forestry University, 2School of Pharmacy and Medical Technology, Putian University, 3School of Medicine, Huaqiao University, 4Department of Pharmacy, Taining County General Hospital, 5School of Pharmacy, Fujian Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포 생존력의 변동 및 분석 간섭을 포함한 실험적 인공물은 지질이 풍부한 일차 지방세포에서 글리세롤 방출의 정확한 정량화를 방해합니다. 이러한 문제를 완화하기 위해 MTT 기반 정규화 전략을 사용하여 세포 대사 활동에 대한 글리세롤 측정을 조정하여 지방분해 정량화의 신뢰성을 향상시킵니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

중요한 대사 경로인 지방분해는 저장된 트리글리세리드를 유리 지방산과 글리세롤로 가수분해하는 과정을 포함합니다. 그러나 지질이 풍부한 일차 지방세포에서 글리세롤 출력의 정확한 정량화는 세포 생존력의 가변성 및 분석 간섭과 같은 실험적 인공물에 의해 종종 혼란스럽습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 기반 세포 생존율 분석을 사용하여 글리세롤 방출 측정을 정규화하는 간단한 방법이 확립되었습니다. 이 프로토콜은 지방세포와 수용액 사이의 비중 차이를 활용하여 지방분해 출력과 세포 생존력을 동시에 정량화할 수 있습니다. 약물 스크리닝 실험에서 프라바스타틴과 심바스타틴은 복부 지방세포에서 글리세롤 방출을 유의하게 증가시킨 반면, 아토르바스타틴과 로바스타틴은 글리세롤 출력을 유의하게 변화시키지 않았습니다. 이러한 발견은 MTT 기반 정규화가 지방분해를 정확하게 정량화하기 위한 강력하고 편리한 접근 방식을 제공하며 비만 및 대사 증후군을 표적으로 하는 약물 발견에 잠재적인 응용 분야를 제공한다는 것을 시사합니다. 이 연구는 진정한 대사 반응과 비특이적 막 누출을 구별하기 위해 기존의 지방분해 분석을 재평가할 필요성을 강조합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

지방 조직은 백색 지방 조직(WAT)과 갈색 지방 조직(BAT)1로 나눌 수 있습니다. WAT는 중성지방으로 과잉 에너지 저장 기능을 수행하는 반면, BAT는 체온을 유지하기 위한 열 발생 기능을 가지고 있으며, 이는 추위의 자극 하에서 화학 에너지를 열 에너지로 변환합니다1. 지방 조직에는 내분비 기능도 있습니다2. 다양한 호르몬, 사이토카인, 대사산물(총칭하여 아디포카인)을 분비할 수 있으며, 중추신경계의 먹이를 찾는 행동과 주변 조직의 대사 활동을 조절하여 신체의 에너지 균형을 조절할 수 있다2.

지방분해는 일련의 지방분해효소3,4의 작용 하에 세포내 지질의 단계별 가수분해 과정입니다. 지방세포에서 지질은 주로 트리글리세리드 형태로 지질 방울에 저장됩니다5. 지질 방울은 지방 용해 효소에 의한 트리글리세리드의 가수분해를 방지하는 지질 방울 관련 단백질 페리리핀 계열로 덮여 있습니다 6,7. 그러나 지방분해 신호가 강화되면 지방세포에서 페리리핀 계열의 발현 수준이 감소하고 지방분해 효소가 지질 방울로 들어갑니다 3,4. 결과적으로, 트리글리세리드는 글리세롤과 유리 지방산으로 분해됩니다 3,4,5.

저장된 트리글리세리드를 글리세롤과 유리 지방산으로 분해하는 지방분해는 지방세포 대사의 기본 과정입니다8. 글리세롤과 같은 지방분해 산물의 직접 측정은 귀중한 통찰력을 제공하지만, 특히 실험군 간의 세포 수 차이로 인해 발생하는 작동 오류로 인해 부유된 일차 지방세포에서 정확한 정량화가 어려웠습니다. 이 연구는 일차 쥐 복부 지방세포에서 글리세롤 방출의 정량화를 정상화하기 위해 세포 생존율 분석을 사용하여 이러한 문제를 해결하는 것을 목표로 했습니다. 측정 방법을 표준화함으로써 표준화된 글리세롤 방출 분석법은 지방세포의 비만 및 대사 증후군을 표적으로 하는 약물 발견을 위한 잠재적인 도구로 적용되었습니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 지방세포와 수용액 사이의 비중 차이를 활용하여 글리세롤 방출(지방분해의 지표로) 및 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 세포 생존력을 동시에 측정할 수 있도록 합니다.

모든 동물 절차는 ARRIVE 지침을 준수했으며 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 지침(NIH 간행물 번호 8023, 1978년 개정)에 따라 수행되었습니다. 연구 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용 위원회(승인 번호 202112, 2021년 5월 5일 승인)의 승인을 받았습니다. 이 연구에 사용된 수컷 Wistar 쥐는 표준 사육 조건에서 체중이 ≥200g인 최소 8주령이었습니다. 부고환 백색 지방 조직은 쥐당 0.6-0.8g의 일반적인 수율로 수집되었습니다. 특히, 나이가 많은 쥐 또는 고지방 식이를 먹인 쥐는 백색 지방 조직 질량(종종 1.5-3g)이 크게 증가하여 일관된 조직 해리 효율을 유지하기 위해 소화 효소(예: 콜라게나제) 농도의 비례 조정이 필요했습니다. 수컷 쥐를 독점적으로 사용하면 암컷 발정 주기 호르몬 변동으로 인한 잠재적인 교란 효과를 피할 수 있었습니다. 균주 선택(예: Sprague-Dawley, Wistar 또는 Long-Evans)은 지방 조직 반응의 유전적 균일성을 보장하기 위해 실험 내에서 일관되게 유지되었습니다. 사용된 시약과 장비는 재료표에 나와 있습니다.

1. 일차 쥐 복부 지방세포의 분리

  1. 수컷 성인 Wistar 쥐에게 7% 클로랄 수화물(증류된 H2O에 용해됨)을 복강내 주사하여 마취시킵니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따름).
  2. 반사 반응이 없는지 확인하여 완전 마취를 확인한 후 멸균 수술용 가위를 사용하여 정중선 복부 절개를 합니다.
  3. 부고환 지방 패드의 왼쪽과 오른쪽에서 내장 지방 조직을 조심스럽게 제거합니다.
    참고: 부고환 지방세포는 상대적으로 크고 부력이 있어 분리 및 분석이 용이합니다.
  4. 수집된 조직을 인산염 완충 식염수(PBS; 그림 1A).
  5. PBS로 조직을 두 번 세척하여 부착된 혈관과 혈전을 포함한 불순물을 제거합니다.
  6. 씻은 티슈를 작은 조각으로 자릅니다.

2. 일차 쥐 복부 지방세포의 정제

  1. 해부된 지방 조직을 트립신 및 II형 콜라게나제(10mL 트립신 용액에 10mg)와 함께 37°C에서 2시간 동안 쉐이킹합니다.
  2. 세포 스트레이너를 통해 소화된 지방 조직을 여과합니다(그림 1A).
  3. 여과액을 실온에서 3 분 동안 120×g으로 원심분리하여 잔류 효소 활성을 제거합니다.
  4. 부유 지방세포(상부 흰색층)를 깨끗한 튜브로 옮기고 PBS로 세척합니다.
  5. 여과액을 실온에서 3분 동안 120× g 에서 원심분리하여 PBS를 제거합니다.
  6. 여과된 지방세포(상부 백색층)를 10% 소태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액으로 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM)에서 30분 이상 배양합니다.

3. 글리세롤 방출 분석

  1. 여과된 지방세포(웰당 104-10 5 개 세포, 200μL)를 96웰 세포 배양 플레이트에 시드합니다.
    참고: 지방세포는 표준 혈구측정기를 사용하여 정량화되었습니다. 지방세포 크기의 큰 변화로 인해 일부 더 큰 세포는 정확하게 계산할 수 없었습니다. 따라서 세포 수는 지방세포의 실제 수를 정확하게 반영하지 않을 수 있습니다. 주요 목표는 정확한 정량화보다는 웰 전체에 세포를 고르게 분포하는 것이었습니다.
  2. 지방세포를 0.05% 디메틸 설폭사이드(DMSO; 대조군) 및 50μM 아토르바스타틴, 프라바스타틴, 로바스타틴 및 심바스타틴으로 37°C에서 4시간 동안 부드럽게 흔들면서 처리합니다.
    참고: 이러한 치료 조건은 참고용으로 제공되며 실험의 특정 목표 및 설계에 따라 필요에 따라 조정될 수 있습니다.
  3. 세포 배양 배지(하단 빨간색 층)를 수집하여 지방 분해의 시작을 나타내는 글리세롤 방출을 분석합니다(그림 1B).
  4. 상업용 글리세롤 방출 분석 키트를 사용하여 다양한 치료에 대한 반응으로 지방세포 지방분해를 평가합니다.
  5. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 570nm에서 흡광도를 측정합니다.

4. 세포 생존력 분석

  1. MTT 분말을 증류된 H₂O에 5mg/mL의 농도로 용해하고 0.22μm 필터를 통해 멸균한 후 사용하십시오.
  2. 글리세롤 방출 분석 후, MTT 용액(최종 0.5mg/mL까지)을 세포에 첨가하고 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
  3. 세포 생존율 분석을 위해 부유 지방세포(상부 보라색 층)를 DMSO가 들어 있는 깨끗한 튜브로 옮깁니다(그림 1B).
  4. 형성된 보라색 포르마잔 결정을 용해하기 위해 잠시 소용돌이가 있습니다.
  5. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 570nm에서 흡광도를 측정합니다.

5. 정규화 계산

  1. 모든 실험을 세 번으로 수행하고 4회 반복합니다(n = 4).
    참고: 각 독립적인 실험(n = 4)에 대해 3마리의 쥐로부터 지방세포를 분리하고 각 치료 조건을 3중으로 수행했습니다.
  2. 각 치료 그룹에 대해 글리세롤 방출 흡광도 값을 해당 세포 생존율 흡광도 값으로 나눕니다.
  3. 데이터를 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시합니다.
    참고: 평균 및 SD는 함수 =AVERAGE(range) 및 =STDEV와 함께 Microsoft Excel을 사용하여 계산되었습니다. S(범위). 그룹 비교를 위해 GraphPad Prism 6을 사용하여 비교 평균의 함수 t-테스트와 함께 짝이 없는 양측 t-테스트를 수행했습니다.
  4. Student's t-test를 사용하여 그룹 간 차이의 통계적 유의성을 결정하며, P-값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주됩니다.

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Results

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예비 약물 스크리닝 후, 항고지혈증제인 스타틴을 사용하여 표준화된 글리세롤 방출 방법9에 의해 지방세포의 지방분해 효과를 조사하였다.

스타틴이 일차 쥐 복부 지방세포에서 글리세롤 방출에 미치는 영향
일차 쥐 복부 지방세포에서 지방분해에 대한 스타틴의 효과는 50μM의 프라바스타チン, 심바스타인, 아토르바스타틴, 로바스타틴 및 0.5% DMSO로 세포를 4시간 동안 처리하여 평가하였다. 글리세롤 방출 분석은 프라바스타틴과 심바스타틴을 사용한 치료가 대조군에 비해 지방분해 효과를 유도한 것으로 나타났습니다(그림 2). 그러나 지방분해의 유의한 유도는 프라바스타틴 치료에서만 관찰되었지만(P < 0.05), 심바스타틴에서는 관찰되지 않았습니다(그림 2).

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 지질이 함유된 일차 지방세포에서 지방분해를 측정하는 보다 정확한 방법을 제공합니다. 프라바스타틴과 심바스타틴은 쥐 부고환 지방세포에서 글리세롤 방출을 유도하고 생존력을 감소시키는 것으로 밝혀진 반면, 아토르바스타틴과 로바스타틴은 유의미한 효과를 나타내지 않았습니다. 심바스타틴의 투여는 지방세포에서 글리세롤 방출의 최소한의 증가를 초래했습니다. 이 문제를 해결하기 위해 MTT 분석을 사용하여 지방분해 측정을 표준화했습니다. 이 접근법은 프라바스타틴과 심바스타틴에 의해 유도된 지방 분해 효과를 평가하는 데 상당한 향상을 보였으며, 이는 세포 생존력에 미치는 영향에 기인할 가능성이 높습니다.

지방분해 평가의 방법론적 발전
이 연구는 지질이 함유된 일차 지방세포의 지방분해를 평가하기 위해 MTT 분석을 활용하는 것의 중요성과 이점을 강조합니다. 이 방법의 통합을 통해 지방분해 측정...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이 연구에서 보고된 작업에 영향을 미칠 수 있는 경쟁적인 재정적 또는 개인적 이익을 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 Fujian Agriculture and Forestry University와 Putian University(둘 다 Leo Tsui 출신)의 지원을 받았습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.22-&마이크로; M 필터산곤바이오텍(주)F513165-0001주사기 필터, AQUO 시스템, 멸균
3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드 산곤바이오텍(주)A600799-00011 그램
96웰 세포 배양 플레이트&NBSP;산곤바이오텍(주)F603204-0001메 마른
아토르바스타틴 칼슘염케이맨 케미칼10493-55 mg
셀 스트레이너 산곤바이오텍(주)F513450-000180 스크린 메쉬
클로랄 수화물산곤바이오텍(주)A500288-0250250 그램
디메틸 설폭사이드산곤바이오텍(주)A460700-0100100 밀리리터
Dulbecco의 변형 독수리 배지 산곤바이오텍(주)E600003500 mL, 고포도당, 멸균
태아 소 혈청산곤바이오텍(주)E600001100ml, 멸균
글리세롤 비색 분석 키트케이맨 케미칼10010755-9696 웰
로바스타틴케이맨 케미칼10010338-55 mg
수컷 성체 쥐 푸톈대학교위스타약 10-12주
페니실린-스트렙토마이신 용액 산곤바이오텍(주)B540732-001010 mL, 멸균
인산염 완충 식염수산곤바이오텍(주)E607009-0500500 mL, 멸균, 칼슘 또는 마그네슘 없음
프라바스타틴 나트륨염케이맨 케미칼10010343-55 mg
심바스타틴 케이맨 케미칼10010344-55 mg
트립신 용액 산곤바이오텍(주)E607003-0100100mL, EDTA 및 페놀 레드 없음, 멸균
유형 II 콜라게나제 산곤바이오텍(주)A004174-0100100 mg

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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