우리는 알려진 크기의 형광 태그가 있는 당의 전좌 속도가 조직 유래 인간 장 콜로노이드의 투과성을 반영하는 장 장벽 무결성을 측정하는 기술을 설명합니다.
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우리는 알려진 크기의 형광 태그가 있는 당의 전좌 속도가 조직 유래 인간 장 콜로노이드의 투과성을 반영하는 장 장벽 무결성을 측정하는 기술을 설명합니다.
장 장벽은 내강 항원과 숙주 면역 체계 사이의 중요한 조절 부위이며, 그 조절 장애는 여러 위장 질환과 관련이 있습니다. 장 오가노이드는 장 장벽 무결성의 차이를 이해하고 모델링하는 데 유용한 도구가 될 수 있습니다. 여기에서는 인간 콜로노이드를 사용하여 오가노이드 단층에 걸쳐 형광 추적자의 플럭스를 측정하여 기능적 장 장벽 차이를 정량화하는 프로토콜을 설명합니다. 단층을 합류하도록 성장시킨 후, FITC-덱스트란과 같은 형광 추적자를 정점 챔버에 추가하고 시간이 지남에 따라 기저외측 챔버로의 전좌를 감지합니다. 형광 추적자의 증가된 전좌는 더 투과성 또는 약한 상피 장벽을 반영합니다. 이 프로토콜은 여러 조건에 걸쳐 기능적 장 장벽 차이를 병렬로 평가할 수 있는 적응형 플랫폼입니다. 이 프로토콜의 변형을 사용하여 다양한 크기, 모양 및 화학 구조의 분자에 대한 경상피 투과성뿐만 아니라 상피 세포의 정점 또는 기저외측 측면의 고립된 처리 또는 미세 환경 변화의 맥락에서 투과성 차이를 평가할 수 있습니다. 이를 통해 질병 상태에서 장벽 파괴의 메커니즘과 치료에 대한 더 깊은 이해가 가능합니다.
장 점막은 장 내강의 대사산물, 항원, 미생물과 면역체계 및 장 순환 사이의 접촉을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 복잡한 구조입니다. 장 상피 세포는 이 시스템의 핵심 구성 요소이며 건강한 상태에서는 매우 선택적인 장벽을 형성합니다. 상피를 가로지르는 수송은 여러 메커니즘을 통해 발생할 수 있습니다: 세포 간 능동 또는 수동 수송, 밀착 접합 및 부착 접합에 의해 조절되는 세포주위 기공 또는 누출 경로. 이러한 경로 중 하나라도 분자가 상피를 가로질러 이동하는 데 사용할 수 있는지 여부는 소수성, 크기 및 화학 구조에 의해 결정됩니다. 일단 상피를 통과하면 이러한 분자는 점막 면역 세포와 더 쉽게 상호 작용하여 장의 혈액 또는 림프 순환으로 들어갈 수 있습니다 1,2 장 장벽의 파괴는 염증성 장 질환 및 체강 질병과 같은 여러 염증성 위장 질환의 특징입니다 1,3,4,5,6,7
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모든 샘플은 콜로라도 대학교 IRB(Institutional Review Board)에서 승인한 프로토콜, 프로토콜 번호 14-2012에 따라 획득 및 사용되었습니다.
알림: 1-3단계의 모든 절차는 멸균 기술을 사용하여 멸균 생물 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다. 프로토콜의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다.
1. 냉동 배양에서 인간 콜로노이드의 확립
참고: 해동된 오가노이드가 동결 배지에 노출되는 것을 최소화하기 위해 세포를 해동하기 전에 모든 재료가 생물안전 캐비닛에 준비되었는지 확인하십시오. 프로토콜은 냉동 보존된 조직 유래 인간 콜로노이드로 시작됩니다. 인간 콜로노이드를 유도하고 냉동 보존하기 위한 프로토콜은 이전에 기술되었습니다24.
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이 프로토콜을 사용하여 염증 신호의 존재 및 부재 시 건강한 인간 콜로노이드의 투과성을 분석했습니다. IFNγ, TNFα 및 IL-1β(각각 10ng/ml)를 포함하는 사이토믹스라고 하는 염증성 사이토카인의 혼합물을 추가하면 이전에 장 상피 세포 모델에서 TEER에 의해 측정된 바와 같이 장 장벽 기능 장애를 유도하는 것으로 나타났습니다20,27. 우리는 이 장벽 기능 장애가 설명된 FITC-덱스트란 플럭스 분석을 사용하여 요약될 수 있는지 확인하는 것을 목표로 했습니다.
단일 기증자로부터 건강한 인간 콜로노이드를 확장하고(그림 2A) 설명된 대로 단층으로 도금했습니다(n=6). 고원에 도달한 후 분화 배지에서 TEER(단계 4; 도 2B), 사이토믹스(IFNγ, TNF.......
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이것은 인간 콜로노이드 단층의 생리학적으로 대표적인 모델에서 장 장벽을 평가하기 위한 프로토콜입니다. 여기에 설명된 형광 추적자 플럭스 분석은 TEER, Ussing 챔버 측정 또는 밀착 접합 단백질 발현 평가와 같은 다른 유형의 장벽 분석으로 수집되는 것 이상으로 장벽의 기능적 무결성에 대한 정보를 제공합니다. 또한, 환자 유래 장 오가노이드 모델의 사용은 형질전환되지 않은 세포 대사 및 콜로노이드가 얻어지는 장 영역에 특이적인 변화를 포함하여 불멸 세포주보다 더 나은 복잡한 인간 생리학13,19을 요약하는 이점을 제공하며 생체 내 연구보다 더 많은 제어, 접근성 및 용이성을 제공합니다.
특정 목적에 맞게 원리를 조정하는 데 사용할 수 있는 프로토콜에는 여러 가지 적응이 있습니다. 다양한 전하, 크.......
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공개나 이해 상충이 없습니다.
Sean Colgan 박사는 NIH 보조금 DK1047893, DK50189, DK095491, DK103639 및 VA Merit BX002182의 지원을 받습니다.
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