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방법 논문

인간 콜로노이드 단층에 걸쳐 형광 추적자의 플럭스를 감지하여 장 장벽 투과성 측정

1K 조회수

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DOI:

10.3791/68857

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2025년 10월 17일

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, Children's Hospital Colorado, 2Department of Medicine, Mucosal Inflammation Program, Division of Gastroenterology and Hepatology, University of Colorado, 3Rocky Mountain Veterans Hospital

이 논문에서

요약

우리는 알려진 크기의 형광 태그가 있는 당의 전좌 속도가 조직 유래 인간 장 콜로노이드의 투과성을 반영하는 장 장벽 무결성을 측정하는 기술을 설명합니다.

초록

장 장벽은 내강 항원과 숙주 면역 체계 사이의 중요한 조절 부위이며, 그 조절 장애는 여러 위장 질환과 관련이 있습니다. 장 오가노이드는 장 장벽 무결성의 차이를 이해하고 모델링하는 데 유용한 도구가 될 수 있습니다. 여기에서는 인간 콜로노이드를 사용하여 오가노이드 단층에 걸쳐 형광 추적자의 플럭스를 측정하여 기능적 장 장벽 차이를 정량화하는 프로토콜을 설명합니다. 단층을 합류하도록 성장시킨 후, FITC-덱스트란과 같은 형광 추적자를 정점 챔버에 추가하고 시간이 지남에 따라 기저외측 챔버로의 전좌를 감지합니다. 형광 추적자의 증가된 전좌는 더 투과성 또는 약한 상피 장벽을 반영합니다. 이 프로토콜은 여러 조건에 걸쳐 기능적 장 장벽 차이를 병렬로 평가할 수 있는 적응형 플랫폼입니다. 이 프로토콜의 변형을 사용하여 다양한 크기, 모양 및 화학 구조의 분자에 대한 경상피 투과성뿐만 아니라 상피 세포의 정점 또는 기저외측 측면의 고립된 처리 또는 미세 환경 변화의 맥락에서 투과성 차이를 평가할 수 있습니다. 이를 통해 질병 상태에서 장벽 파괴의 메커니즘과 치료에 대한 더 깊은 이해가 가능합니다.

서론

장 점막은 장 내강의 대사산물, 항원, 미생물과 면역체계 및 장 순환 사이의 접촉을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 복잡한 구조입니다. 장 상피 세포는 이 시스템의 핵심 구성 요소이며 건강한 상태에서는 매우 선택적인 장벽을 형성합니다. 상피를 가로지르는 수송은 여러 메커니즘을 통해 발생할 수 있습니다: 세포 간 능동 또는 수동 수송, 밀착 접합 및 부착 접합에 의해 조절되는 세포주위 기공 또는 누출 경로. 이러한 경로 중 하나라도 분자가 상피를 가로질러 이동하는 데 사용할 수 있는지 여부는 소수성, 크기 및 화학 구조에 의해 결정됩니다. 일단 상피를 통과하면 이러한 분자는 점막 면역 세포와 더 쉽게 상호 작용하여 장의 혈액 또는 림프 순환으로 들어갈 수 있습니다 1,2 장 장벽의 파괴는 염증성 장 질환 및 체강 질병과 같은 여러 염증성 위장 질환의 특징입니다 1,3,4,5,6,7. 이 약화된 장 장벽은 병원성 항원의 조절 장애 전좌를 통해 이러한 질병 과정의 병태생리학에서 역할을 하는 것으로 생각되며, 이는 국소 또는 전신 염증 반응을 일으킬 수 있습니다.

장 장벽을 측정하기 위한 몇 가지 확립된 프로토콜이 있습니다. 시험관 내 연구는 전통적으로 T84 또는 Caco-2 세포와 같은 암세포주를 사용하여 경상피 전기 저항(TEER)을 측정하고 밀착 접합 및 접착 접합 구성 요소를 정량화합니다8. 생체 외에서, 생검 또는 절제된 장 샘플9에서 Ussing 챔버를 사용하여 경상피 전류를 측정할 수 있습니다. 생체 내 연구는 일반적으로 불활성 추적자를 경구로 투여한 다음 이러한 추적자의 혈액 또는 소변 흡수를 측정하는 것을 포함합니다10,11. 이러한 기술은 장 장벽 연구에 유용한 것으로 입증되었지만 몇 가지 한계가 있습니다: 형질전환된 불멸 세포주는 본질적으로 잘 정의되지 않은 방식으로 장 장벽에 영향을 미치는 대사 및 세포골격 변화를 가지고 있습니다. 환자, 환자 샘플 또는 모델 유기체에 대한 접근이 제한될 수 있습니다. 생체 내 연구는 교란 요인을 제어하거나 분자 수준에서 결론을 내리기가 어렵습니다. 따라서 이러한 장벽 파괴에 대한 증거가 여러 질병 모델에서 보고되었지만 이러한 장 장벽 결함의 메커니즘에 대한 이해는 여전히 제한적이며 위장 질환의 이러한 측면을 표적으로 삼고 치료하는 능력은 여전히 파악하기 어렵습니다.

인간 장 오가노이드는 장 장벽 결함의 원인과 치료를 밝힐 수 있는 독특하고 흥미로운 기능을 제공합니다. 조직 유래 인간 장 오가노이드는 장 선도의 기저부에 위치한 성체 줄기 세포로부터 유래된 1차 세포 배양물입니다12. 이러한 세포는 생검 또는 수술 표본에서 분리될 수 있으며 배양되어 유래한 환자에서 볼 수 있는 유전적 및 후생유전학적 변화를 유지할 수 있습니다13,14,15. 이들은 암세포주의 대사 변화가 없고 성숙한 장 상피에 존재하는 다양한 세포 유형으로 분화될 수 있기 때문에 전통적인 불멸 세포주보다 생리학적으로 더 관련성이 높은 모델 역할을 합니다 16,17,18. 또한, 시험관 내에서 확장할 수 있기 때문에 다양한 치료 및 성장 조건의 세포 효과에 대한 통제된 연구에 더 쉽게 접근하고 유용합니다. 장 오가노이드 모델에도 내재된 한계가 있지만, 특히 다른 비상피 세포 유형의 부재와 전신 시스템의 맥락이 존재하지만, 인간 장 오가노이드는 위장 질환의 여러 측면에 대한 신뢰할 수 있는 모델을 제공하는 것으로 나타났습니다13.

이 중 장 오가노이드는 장 장벽 결함을 밀접하게 모델링하는 것으로 나타났으며, 장벽 손상 설정에서 긴밀한 접합 조직 및 TEER의 예상되는 변화를 보여줍니다 19,20,21. 여기서, 우리는 오가노이드 단층을 가로지르는 형광 태그 분자의 플럭스가 검출되는 인간 콜로노이드에서 장벽 무결성을 평가하는 한 가지 기술을 채택합니다22. 이 프로토콜에서 오가노이드는 반투막에서 편광된 2차원 단층으로 성장 및 성숙됩니다. 이 분석은 상피 단층의 정점 표면에 형광 추적자를 추가하는 것을 수반하며, 반대쪽에서의 존재는 시간이 지남에 따라 정량화됩니다. 추적자의 증가된 플럭스는 더 누출되거나 더 투과성이 높은 상피를 반영합니다. 이 분석은 단단하고 접착된 접합부의 구조 평가에 추가될 수 있는 기능적 장벽 판독값을 제공합니다. 또한 TEER 측정은 장벽 무결성에 대한 기본 평가를 제공하는 데 자주 사용되지만 여기에 설명된 플럭스 분석은 다양한 클래스, 전하 및 크기의 분자의 투과성을 검출하도록 조정되어 장벽을 훨씬 더 자세히 특성화할 수 있습니다. 이러한 목적을 위해 여러 상업적으로 이용 가능한 형광 추적자를 사용할 수 있습니다. 또한, 겹치지 않는 형광 스펙트럼을 사용하여 여러 추적자에 대한 투과성을 동시에 평가할 수 있습니다. 또한, 이 분석의 단층 구성은 세포의 정점 또는 기저외측 표면에만 구체적으로 적용되는 성장 조건에 대한 장벽 반응을 평가할 수 있습니다. 이를 통해 치료제의 효과, 미세 환경 변화 및 공동 배양 조건에 대한 통제된 평가가 가능합니다.

장 장벽 결함은 여러 위장 질환의 발병에 중요한 병원성 역할을 하는 것으로 알려져 있지만, "장 누수"라는 용어는 정밀하지 않은 대중 매체에서 점점 더 많이 사용되고 있으며23 결함이 있는 장 장벽을 표적으로 삼으려는 노력은 성공에 한계가 있습니다. 이는 장 장벽을 평가하고 특성화하기 위한 개선된 모델의 필요성을 강조합니다. 설명된 시스템은 생리학적 인간 조직 유래 장 오가노이드 단층을 사용하여 통제된 조건에서 기능적 장벽 무결성을 평가합니다.

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프로토콜

모든 샘플은 콜로라도 대학교 IRB(Institutional Review Board)에서 승인한 프로토콜, 프로토콜 번호 14-2012에 따라 획득 및 사용되었습니다.

알림: 1-3단계의 모든 절차는 멸균 기술을 사용하여 멸균 생물 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다. 프로토콜의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 냉동 배양에서 인간 콜로노이드의 확립

참고: 해동된 오가노이드가 동결 배지에 노출되는 것을 최소화하기 위해 세포를 해동하기 전에 모든 재료가 생물안전 캐비닛에 준비되었는지 확인하십시오. 프로토콜은 냉동 보존된 조직 유래 인간 콜로노이드로 시작됩니다. 인간 콜로노이드를 유도하고 냉동 보존하기 위한 프로토콜은 이전에 기술되었습니다24.

  1. 인간 장 오가노이드 줄기 배지의 제조
    1. 이전에 설명한 프로토콜25,26에 따라 Wnt-3A/Noggin/R-Spondin 3 컨디셔닝 배지(L-WRN)를 준비합니다.
    2. L-WRN 배지에 다음과 같은 성장 인자를 보충합니다: 표피 성장 인자 [50 ng/mL], 니코틴아미드 [10 mM], A83-01 [500 nM], SB202190 [10 μM], CHIR99021 [3 μM], 티아조비빈 [4 μM], SB431542 [4 μM], 가스트린 I [10 nM].
    3. 보충된 L-WRN 배지를 상업용 장 오가노이드 배지와 1:1로 혼합합니다.
    4. 사용하기 직전에 Y-27632[10μM]를 보충하십시오.
      참고: 최적의 장 오가노이드 줄기 배지 구성은 실험실 및 콜로노이드 라인에 따라 다를 수 있습니다. 보충된 L-WRN 배지 단독 사용 또는 상업용 장 오가노이드 배지 단독 사용도 가능할 수 있습니다. 이 프로토콜은 L-WRN 컨디셔닝 배지와 상업용 배지를 동일한 부분으로 사용하여 컨디셔닝 배지를 단독으로 사용하는 것에 비해 배치 간 변동성에 더 탄력적이며 상업용 배지 단독으로 사용하는 것에 비해 더 비용 효율적입니다.
  2. 미분화 배지의 제조
    1. DMEM/F12에 소 태아 혈청(FBS) 10%, 페니실린-스트렙토마이신 1%, L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드 2mM
    2. 보충된 DMEM/F12를 1.1단계의 장 오가노이드 줄기 배지와 1:1로 혼합합니다.
  3. 세포외 기질(ECM)의 제조
    1. ECM을 얼음 위에서 밤새 해동한 다음 100μL 분취량을 준비합니다.
      참고: 분취량은 -20°C에서 재냉동할 수 있습니다. 자세한 내용은 제조업체 지침을 참조하십시오.
    2. 세포를 도금 할 때까지 얼음 위에서 분취량을 배양합니다.
  4. 오가노이드 해동 및 도금
    1. 37°C 수조에서 cryovial의 내용물을 해동하여 바이알이 물에 잠긴 상태로 유지되지만 캡이 방금 해동될 때까지 물 위에 있도록 합니다.
    2. 바이알의 내용물을 13mL의 얼음처럼 차갑게 보충된 DMEM/F12 배지가 들어 있는 15mL 원추형 튜브로 옮깁니다(1.2.1단계에서).
    3. 200 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
    4. 상청액을 흡인하여 세포 펠릿 위에 약 1mL의 잔류 부피를 남깁니다.
    5. 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 얼음처럼 차갑게 보충된 DMEM/F12 1mL(1.2.1단계에서)를 추가하고 현탁액을 10-15회 피펫팅하여 펠릿을 재현탁합니다.
    6. 200 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
    7. 피펫을 사용하여 상청액을 제거하고 세포 펠릿 위에 잔류 세척 배지를 최대한 적게 남깁니다.
    8. 해동된 ECM 100μL를 펠릿에 추가합니다. 오가노이드가 덩어리 없이 고르게 분산되도록 완전히 재현탁합니다. 기포가 생기지 않도록 천천히 피펫팅하십시오.
    9. 약 10개의 돔 또는 ECM의 3차원 물방울(각각 약 10μL)을 6웰 플레이트의 1웰에 피펫팅하여 ECM을 플레이트합니다.
    10. 플레이트를 빠르게 뒤집고 37°C에서 5-10분 동안 또는 돔이 응고될 때까지 배양합니다.
    11. 돔이 설정되면 2mL의 장 오가노이드 줄기 배지(1.1단계에서)를 웰에 추가합니다.
    12. 5% CO2가 포함된 가습 인큐베이터에서 37°C에서 배양합니다. 2일마다 미디어를 교체하십시오.
    13. 오가노이드가 ECM 돔 면적의 약 75% 이상을 차지하거나 중앙 파편을 축적하면 2단계를 진행합니다.

2. 인간 콜로노이드의 계대 및 확장

  1. 각 웰에 대해 ECM 돔을 방해하지 않고 웰에서 성장 배지를 흡인합니다.
  2. 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS) 1mL로 돔을 부드럽게 세척한 다음 PBS를 제거합니다.
  3. 각 웰에 얼음처럼 차가운 트립신 1mL를 첨가합니다. 피펫을 사용하여 위아래로 피펫팅하여 ECM 돔을 분해합니다. 혼합물을 10-15회 피펫팅하여 ECM을 완전히 해리시킵니다.
  4. 플레이트를 37°C에서 3-5분 동안 배양합니다.
  5. 얼음처럼 차갑게 보충된 DMEM/F12 1mL(단계 1.2.1에서)를 웰에 첨가하여 트립신을 중화시킵니다. 세포가 각각 2-3개의 세포 클러스터로 해리될 때까지 혼합물을 20-30회 세게 피펫팅합니다.
  6. 세포 현탁액을 15mL 원뿔형으로 옮깁니다.
  7. 추가로 1mL의 보충된 DMEM/F12(1.2.1단계에서)를 사용하여 웰을 세척하고 세척액을 15mL 원뿔형에 추가합니다.
  8. 보충된 DMEM/F12(단계 1.2.1)를 첨가하여 15mL 원뿔형에서 총 부피 13mL에 도달합니다.
  9. 적절한 양의 ECM을 사용하여 1단계의 1.4.3-1.4.12단계를 진행하여 추가 웰로 확장합니다.
    참고: 100μL ECM에 있는 오가노이드의 합류 웰은 일반적으로 2-3개의 웰(200-300μL의 ECM)으로 계대될 수 있습니다. 오가노이드의 융합 웰 1개는 3단계에서 약 3-6개의 단층에 충분합니다.

3. 인간 콜로노이드 단층의 생성

  1. 콜라겐 코팅 세포 배양 인서트
    1. 폴리스티렌 세포 배양 인서트(0.4μm 기공 크기)를 24웰 플레이트에 넣고 각 인서트의 정점 챔버에 100μL의 콜라겐 코팅 용액을 추가합니다.
    2. 증발을 방지하기 위해 밀봉 필름으로 플레이트를 밀봉하십시오.
    3. 4°C에서 4-24시간 동안 배양합니다.
      참고: 이 배양 시간 내에서는 결과에 차이가 없지만 편리한 일시 중지 지점에 맞게 더 짧거나 더 긴 배양 시간을 선택할 수 있습니다.
  2. 도금 오가노이드 단층
    1. 2.1-2.5단계에 따라 오가노이드를 해리합니다.
    2. 세포 현탁액을 70μm 세포 스트레이너를 통해 50mL 원추형 튜브로 통과시킵니다.
    3. 보충된 DMEM/F12 각각 1mL로 웰을 헹굽니다(단계 1.2.1에서). 이 세척 배지를 수집하여 세포 여과기를 통과시킵니다.
    4. 50mL 원추형 튜브의 총 부피가 15mL에 도달할 때까지 보충된 DMEM/F12(단계 1.2.1부터)로 세포 스트레이너를 세척합니다.
    5. 여과액을 15mL 원뿔형으로 옮깁니다.
    6. 200 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
    7. 상청액을 흡인하고 펠릿 위에 1mL를 남깁니다.
    8. 보충된 DMEM/F12 배지 1mL를 추가로 추가하고(단계 1.2.1에서) 재현탁합니다.
    9. 현미경으로 현탁액을 검사하여 완전한 해리를 확인합니다. 필요한 경우 세포가 대부분 단일 세포가 될 때까지 세포를 세게 피펫팅합니다.
    10. 200 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 상청액을 제거하고 세포 펠릿 위에 잔류 세척 배지를 최대한 적게 남깁니다.
    11. 소량(200-1000μL)의 장 오가노이드 줄기 배지(단계 1.1에서)에 재현탁합니다. 얼음 위에 보관하십시오.
    12. 선호하는 방법을 사용하여 생존 가능한 세포를 계수하는 데 사용할 세포 현탁액의 분취량을 취합니다. 생존 세포 수를 사용하여 삽입물당 100,000개의 생존 세포를 도금하는 데 필요한 세포 현탁액의 부피를 결정합니다.
    13. 인서트 멤브레인을 건드리지 않고 각 인서트에서 콜라겐 코팅 용액을 흡인합니다.
    14. 적절한 부피의 장 오가노이드 줄기 배지(단계 1.1부터)를 각 인서트의 정점 챔버에 추가하여 세포 현탁액이 추가되면 최종 부피를 200μL로 만듭니다.
      참고: 원하는 경우, 3.2.12단계의 세포 현탁액을 100,000 세포/200 μL의 최종 농도로 조정할 수 있으며, 그 후 200 μL를 정점 챔버에 도금할 수 있습니다. 그러나 전체 세포 현탁액을 단층 도금에 사용하지 않으면 배지가 과도하게 낭비될 수 있습니다.
    15. 정점 챔버에 적절한 부피의 세포 현탁액을 추가합니다.
    16. 500-1000μL의 장 오가노이드 줄기 배지를 기저외측 챔버에 추가합니다.
      참고: 일반적인 콜로노이드에는 500μL로 충분합니다. 세포가 대사적으로 더 활발하거나 노폐물 축적에 민감한 경우 기저외측 챔버에 더 많은 부피를 사용하는 것이 성장을 유지하는 데 도움이 될 수 있습니다.
    17. 모든 인서트/웰에 대해 반복합니다.
    18. 5% CO2가 포함된 가습 인큐베이터에서 37°C에서 배양합니다.
    19. 일주일에 한 번 미디어를 교체하십시오.
      참고: 관심 있는 처리는 도금 전후에 언제든지 인서트의 정점 및/또는 기저외측 챔버에 적용할 수 있습니다.

4. 경상피 전기 저항(TEER) 및 단층 성숙 측정

  1. 저항 측정
    1. 옴 설정에서 상피 볼트/옴 미터를 사용하십시오. 70% 에탄올에 적신 작업 물티슈로 프로브를 닦아 청소합니다. 전극의 긴 팔을 기저외측 구획에 놓고 짧은 팔을 인서트의 정점 구획에 놓습니다. 측정을 기록합니다.
      참고: TEER 측정도 관심 종점인 경우 세포가 없는 콜라겐 코팅 인서트의 저항 측정도 배경으로 수행합니다. 그런 다음 TEER는 (저항 - 배경 인서트 저항) x 인서트의 표면적으로 계산됩니다. 이 프로토콜에서 인서트의 표면적은 0.33cm2입니다. 이 계산은 TEER을 옴·cm2로 제공합니다. 재료 표에 나열된 것과 다른 상피 볼트/옴 미터를 사용하는 경우 미터 사용에 대한 제조업체의 지침을 사용하여 저항을 측정하십시오.
    2. 측정값이 정체될 때까지 매일 반복합니다.
      참고: 정체는 일반적으로 TEER이 200ohm·cm2보다 큰 경우 2-3주 후에 발생하지만 콜로노이드 라인 및 성장 조건에 따라 다릅니다.
  2. 저항성이 정체되면 줄기 배지를 분화 배지로 교체하여 오가노이드 성숙을 시작합니다(1.2단계에서).
  3. 매일 TEER 측정을 계속합니다. TEER의 증가와 두 번째 정체기를 예상하십시오.
    참고: 두 번째 정체는 일반적으로 1500-2500ohm·cm2의 TEER로 약 7일에 발생하지만 이는 콜로노이드 라인 및 성장 조건에 따라 다릅니다.
  4. TEER 측정이 두 번째로 정체되면 5단계를 진행합니다.

5. FITC-덱스트란 플럭스 분석

참고: 이 프로토콜은 FITC-덱스트란 4kDa(스톡스 반경 14Å)를 사용합니다. 그러나, 실험적 필요에 따라, 다른 크기, 전하 및 형광단의 형광 추적자를 사용할 수 있다22. 여러 추적자를 동시에 사용할 수도 있으며, 이 경우 겹치지 않는 여기 및 방출 형광 스펙트럼을 확인해야 합니다. 5.1-5.3단계는 37°C로 설정된 온열 캐비닛(비가습, 비 CO2 인큐베이터)에서 수행하는 것이 좋습니다. 이것이 가능하지 않은 경우 사용하기 전에 시약을 37°C로 예열해야 하며, 배양 시간 동안 세포, 완충액 및 수집된 샘플을 37°C로 유지해야 합니다.

  1. 시약 준비
    1. 10mM HEPES로 행크 완충 식염수(HBSS)를 준비하고 pH를 7.4로 조정합니다. 37°C까지 따뜻하게 합니다.
      참고: 필요한 경우 관심 있는 치료제와 함께 HBSS+HEPES를 준비하십시오. 정점 챔버에서 80 μL/웰, 기저외측 챔버에서 1 mL/웰에 대해 충분히 준비합니다.
    2. 인서트를 헹구기 위해 따뜻한 HBSS+HEPES 약 50mL를 작은 비커에 붓습니다. 액체 폐기물을 위해 근처에 더 큰 비커를 두십시오.
    3. FITC-덱스트란 4kDa를 완전히 해동합니다. HEPES와 함께 HBSS에서 1.25mg/mL 용액을 준비합니다. 웰당 80μL, 표준 곡선에 1μL를 할당하기 위해 적절한 부피의 FITC-덱스트란 용액을 준비합니다.
      참고: 시작 농도는 추적자의 크기와 예상 투과성에 따라 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 시약을 보존하기 위해 더 작거나 더 많은 투과성 추적자가 더 낮은 농도로 첨가될 수 있다. 정점 챔버에 치료를 적용해야 하는 경우 적절하게 처리된 HBSS+HEPES에 FITC-덱스트란 용액을 준비하십시오.
  2. FITC-덱스트란을 단층에 적용
    1. 1mL의 HBSS+HEPES(원하는 경우 처리 포함)를 적절한 웰에 추가하여 신선한 24웰 플레이트를 준비합니다.
    2. 집게로 인서트를 잡고 웰에서 들어 올린 다음 따뜻한 HBSS+HEPES(단계 5.1.2부터)가 들어 있는 비커에 담그고 정점 챔버를 채운 다음 폐기물 비커 위로 뒤집어 세척액을 비워 오가노이드 단층을 세척합니다.
    3. 이 세탁을 2회 더 반복합니다.
    4. 5.2.1단계에서 준비된 신선한 플레이트의 적절한 웰에 삽입물을 넣습니다.
    5. 80μL의 FITC-덱스트란 용액을 정점 챔버에 부드럽게 피펫팅합니다. 단층을 방해하지 않도록 인서트 측면에 피펫을 넣습니다.
    6. 모든 단층에 대해 5.2.5단계를 반복합니다.
    7. 습도를 유지하기 위해 빈 우물에 HBSS 또는 PBS를 추가합니다.
  3. 플럭스 샘플 수집
    1. 5.2.7단계 직후, 각 웰의 기저외측 챔버에서 70μL를 평평하고 바닥이 투명한 검은색 96웰 플레이트의 웰로 수집하고 37°C에서 빛으로부터 보호합니다. 이것은 시점 0이 될 것입니다.
    2. 빛으로부터 보호된 플레이트를 37°C에서 배양합니다.
    3. 2시간 동안 30분마다 기저외측 웰에서 완충액을 혼합한 다음 단계 5.3.1에서 바닥이 투명한 96웰 플레이트의 빈 웰에 추가로 70μL를 수집합니다.
  4. 표준 곡선 준비
    1. 예약된 FITC-덱스트란 용액 1μL(1.25mg/mL, 단계 5.1.3)를 999μL의 HBSS+HEPES에 첨가합니다. 이것은 표준 곡선에 대한 1:1000 또는 1.25 μg/mL 희석액이 될 것입니다.
    2. 150μL의 용액을 취하여 150μL의 HBSS+HEPES에 첨가한 다음 잘 혼합하여 이 용액을 1:1로 연속적으로 희석합니다. 총 12단계 희석에 대해 이것을 연속적으로 10회 더 반복합니다.
      참고: 이렇게 하면 1250, 625, 312.5, 156.25, 78.13, 39.06, 19.53, 9.77, 4.88, 2.44, 1.22 및 0.61ng/mL의 표준 곡선이 생성됩니다. 세포주의 투과성에 따라 표준 곡선은 다소 집중되어야 할 수 있습니다. 실험을 처음 실행할 때 표준 곡선을 다른 농도로 다시 만들어야 하는 경우를 대비하여 추가 FITC-덱스트란 1.25mg/mL 용액을 예약하십시오.
    3. 표준 곡선의 각 희석액 70μL를 5.3.1 및 5.3.3단계의 96웰 투명 바닥 플레이트의 빈 웰에 피펫팅합니다. 두 번째 반복실험에 대해 반복합니다.
  5. 여기 490nm, 520nm까지의 방출, 플레이트 바닥에서 판독, 이득 100, 판독 높이 7mm로 형광 판독기에서 형광을 측정합니다.
    알림: 선택한 형광단에 맞게 여기/방출 파장을 조정하십시오.
  6. 데이터 분석
    1. x축에 농도가 있고 y축에 형광이 있는 표준 곡선을 그립니다. 이를 사용하여 선형 회귀 방정식을 결정합니다.
    2. 이 선형 회귀 방정식과 샘플의 형광 판독값을 사용하여 각 샘플의 각 시점에서 FITC-덱스트란 농도를 계산합니다.
    3. 각 샘플에 대한 시간 경과에 따른 농도를 플로팅하고 마이크로그램/분(μg/min)을 나타내는 선형 회귀 방정식의 기울기를 계산합니다. 이를 세포 배양 삽입물의 표면적(0.33cm)으로 나누어 플럭스 속도를 제곱센티미터당 분당 마이크로그램(μg/min/cm2)으로 결정합니다.

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결과

이 프로토콜을 사용하여 염증 신호의 존재 및 부재 시 건강한 인간 콜로노이드의 투과성을 분석했습니다. IFNγ, TNFα 및 IL-1β(각각 10ng/ml)를 포함하는 사이토믹스라고 하는 염증성 사이토카인의 혼합물을 추가하면 이전에 장 상피 세포 모델에서 TEER에 의해 측정된 바와 같이 장 장벽 기능 장애를 유도하는 것으로 나타났습니다20,27. 우리는 이 장벽 기능 장애가 설명된 FITC-덱스트란 플럭스 분석을 사용하여 요약될 수 있는지 확인하는 것을 목표로 했습니다.

단일 기증자로부터 건강한 인간 콜로노이드를 확장하고(그림 2A) 설명된 대로 단층으로 도금했습니다(n=6). 고원에 도달한 후 분화 배지에서 TEER(단계 4; 도 2B), 사이토믹스(IFNγ, TNF...

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토론

이것은 인간 콜로노이드 단층의 생리학적으로 대표적인 모델에서 장 장벽을 평가하기 위한 프로토콜입니다. 여기에 설명된 형광 추적자 플럭스 분석은 TEER, Ussing 챔버 측정 또는 밀착 접합 단백질 발현 평가와 같은 다른 유형의 장벽 분석으로 수집되는 것 이상으로 장벽의 기능적 무결성에 대한 정보를 제공합니다. 또한, 환자 유래 장 오가노이드 모델의 사용은 형질전환되지 않은 세포 대사 및 콜로노이드가 얻어지는 장 영역에 특이적인 변화를 포함하여 불멸 세포주보다 더 나은 복잡한 인간 생리학13,19을 요약하는 이점을 제공하며 생체 내 연구보다 더 많은 제어, 접근성 및 용이성을 제공합니다.

특정 목적에 맞게 원리를 조정하는 데 사용할 수 있는 프로토콜에는 여러 가지 적응이 있습니다. 다양한 전하, 크...

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공개 사항

공개나 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

Sean Colgan 박사는 NIH 보조금 DK1047893, DK50189, DK095491, DK103639 및 VA Merit BX002182의 지원을 받습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
15 mL 원추형 원심분리기 튜브셀트리트229411
2 mL 내부 나사산 극저온 바이알 코 닝430488
50 mL 원추형 원심분리기 튜브셀트리트229421
6-웰 플레이트, 조직 배양 처리셀트리트229106
70 & 무; M 셀 스트레이너송골매352350
96웰 검정/투명 바닥판써모 사이언티픽165305
A83-01 R& D2939
BioTek Synergy 플레이트 리더애질런트시너지 H1
셀로미터 자동 T4 명시야 셀 카운터넥셀콤CMT-AT4P
셀로미터 세포 계수 챔버넥셀콤NC1531583
CHIR99021시그마-알드리치SML1046-5MG
콜라겐 코팅 용액 셀 응용125-50
DMEM/F-12깁코11330057
DMSO시그마-알드리치D2650-100ML
에탄올 100%피셔 사이언티픽A4094
EVOM2 볼트옴 미터(Stx2 전극 포함)세계 정밀 기기NC9792051
태아 소 혈청(FBS)사이티바SH30396.03 안녕하세요
필터 피펫 팁피셔 사이언티픽02-707-000, 02-707-002, 02-707-006, 02-707-008
플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-덱스트란, 4kDa시그마-알드리치46944
가스트린 I(인간)R& D3006
글루타맥스 피셔 사이언티픽35050061200 mM L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드
Hanks 완충 식염수 10x써모 사이언티픽14065056
헤페스 1M써모 사이언티픽15630080
인터페론 감마 재조합 인간바이오레전드575308
인터루킨 1 베타 재조합 인간Thermo scientific200-01B-500UG
IntestiCult 장 오가노이드 성장 배지 (인간)STEMCELL 기술06010 상업용 장 오가노이드 배지
라이브 도립 현미경올림푸스IX85 시리즈
마트리겔코 닝354234세포외 기질(ECM)
미생물 인큐베이터피셔 사이언티픽151030515
현탁 배양용 멀티웰 플레이트, 24웰그라이너 바이오 원662102
니코틴아미드R& D4106
파라필름밀리포어 시그마HS234526B밀봉 필름
파스퇴르 피펫(붕규산 유리)피셔 사이언티픽13-678-20B
PBS 깁코10010-023
페니실린 스트렙토마이신 (10,000 U/mL)깁코15140122
재조합 무스 표피 성장 인자R& D2028-EG
냉장 원심분리기베크만 쿨터BE-AX15R
SB202190 R& D1264
티아조비빈R& D3845
24웰 플레이트용 ThinCert 세포 배양 인서트, 0.4 & m그라이너 바이오 원662641
트립신-EDTA(0.25%)피셔 사이언티픽25200114
종양 괴사 인자 알파 재조합 인간R& D10291-TA-100
Y-27632 이염산염 토크리스TB1254-GMP

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