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방법 논문

스캐폴드 프리 마우스 난소 난포 배양을 위한 맞춤형 아가로스 몰드의 생산 및 사용

1.2K 조회수

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DOI:

10.3791/68871

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2025년 10월 24일

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1Department of Obstetrics and Gynecology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 3Roy J. Carver Department of Biomedical Engineering, Pappajohn Biomedical Institute, University of Iowa

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

우리는 시험관 내 배우자 형성을 보완하는 새로운 스캐폴드가 없는 아가로스 곰팡이에서 난소 난포를 배양하는 방법을 설명합니다.

초록

난포는 여성의 생식 기능과 건강을 유지하는 데 필요한 호르몬과 배우자를 생성하는 난소의 기능 단위입니다. 시험관 내에서 난포 형성, 배란 및 황체 형성을 요약하는 능력은 광범위한 기본적, 번역적 및 임상적 유용성을 가지고 있습니다. 가장 진보된 시험관 내 난포 성장 시스템은 난포의 3차원(3D) 구조를 유지하며, 이는 인간의 감수분열 능력이 있는 중기 II 난모세포의 발달에 중요합니다. 최근에는 마우스 다층 2차 난포의 시험관 내 난포 성장을 위한 스캐폴드 없는 방법이 개발되어 검증되었습니다. 이를 위해 맞춤형 3D 프린팅 금형을 사용하여 난포의 체적 팽창을 수용하는 마이크로웰로 아가로스를 마이크로패턴화했습니다. 이 스캐폴드가 없는 환경에서 성장한 난포는 잘 확립된 알지네이트 기반 캡슐화 체 외 난포 성장(eIVFG) 시스템에 비해 비슷한 호르몬 생산 및 생존력을 보여주었습니다. 중요한 것은 아가로스 마이크로웰이 확장 가능한 방법이고 기술적으로 덜 까다롭고 eIVFG에 비해 향상된 난포 성장 및 배란율을 보인다는 것입니다. 이 방법론은 재료별 침출수 및 기타 환경 오염 물질에 매우 민감한 세포인 난모세포와 생체 적합성이 있는 맞춤형 금형을 생산합니다. 또한, 이 시스템의 난포는 동일한 초점면에서 배양되어 실시간 타임랩스 이미징 및 분석이 가능합니다. 이 새로운 접근 방식의 접근성을 높이기 위해 이 기사에서는 마스터 몰드를 설계 및 3D 프린팅하고, 24웰 또는 96웰 플레이트용 실리콘 몰드를 만들고, 아가로스 몰드에서 분리된 다층 2차 난포를 배양하는 데 필요한 방법을 자세히 설명합니다. 이 설정은 비용 효율적인 타임랩스 이미징 시스템과 통합되어 형태 운동 분석을 가능하게합니다. 또한 다운스트림 조직학적 분석을 위해 금형에 파라핀을 포매할 수 있습니다. 전반적으로, 이 사용자 친화적인 방법은 난포 배양을 위한 다목적 도구이며 완전한 시험관 내 배우자 형성을 유지하기 위해 난포의 맥락 내에서 생식 세포의 분화 및 성숙을 촉진하기 위해 추가로 맞춤화할 수 있습니다.

서론

난모세포 또는 암컷 배우자는 수정 시 세포질의 대부분과 유전 물질의 절반을 배아에 기여하며, 이는 다음 세대의 발달에 필수적입니다. 난자 형성은 원시 생식 세포가 감수 분열에 들어가 전단계 I에서 정지할 때 배아 발달 중에 시작됩니다. 이 난모세포는 원시 난포 내에 존재하며 점진적으로 모집되는 유한하고 재생 불가능한 풀인 난소 예비군을 구성합니다. 난포는 난포 형성으로 알려진 과정에서 발달하며, 궁극적으로 수정이 가능한 성숙한 배우자를 생산하는 것을 목표로 합니다 1,2,3,4,5. 난포 발달은 측분비 신호 전달이 난포의 생존과 성장에 필수적인 초기 성선 자극 호르몬 독립적 단계로 시작됩니다. 난포가 2차 단계로 성숙함에 따라 성선 자극 호르몬에 의존하게 되어 내분비 신호 전달로의 전환을 나타냅니다. 2차 난포의 주요 특징은 새로 발달된 테카층과 함께 최소 2개의 완전한 직육면체 과립막 세포 층으로 둘러싸인 난모세포입니다. 테카 세포는 난포의 가장 바깥층을 형성하여 안드로겐과 구조적 지지를 제공합니다 6,7. 마지막으로, 배란 중 황체 형성 호르몬(LH) 급증에 반응하여 체액으로 채워진 전정부가 형성되고 파열되어 감수분열 II 2,8,9에서 정지된 수정 가능 배우자를 방출합니다.

난모세포는 난자 형성 및 난포 형성 동안 수정에 대한 발달 능력과 핵 및 세포질 성숙이라고 하는 초기 착상 전 배아 발달을 지원하는 능력을 달성합니다 10,11,12. 세포질 성숙은 난모세포가 난포 형성 전반에 걸쳐 확장됨에 따라 형태학적으로 명백합니다. 테카, 과립막 및 난구 세포를 포함한 체세포 증식의 결과로 난포 자체는 상당한 체적 확장을 경험합니다. 생쥐의 경우 난포의 직경은 초기 이차 난포에서 배란 전 난포로 5배 증가합니다. 난모세포와 주변 체세포 사이의 양방향 통신은 난자 형성에 필수적입니다. 일차 난포에서 투명대는 난모세포에서 분비되는 단백질에서 형성되며, 이러한 난포 구획 사이의 통신은 부분적으로 이 두 난포 구획 사이에 물리적 접촉을 제공하는 초대 돌출에 의해 매개됩니다13,14. 따라서 난포 미세 환경은 난모세포의 성장과 핵 및 세포질 성숙을 올바르게 조율하는 데 필수적입니다 2,5. 이러한 과정을 지원하는 개별 메커니즘을 더 잘 이해하려면 생리학적으로 관련된 고급 시험관 내 배양 기술이 필요합니다. 시험관 내에서 난포를 배양하는 능력은 보조 생식 기술 및 생식력 보존 15,16,17,18, 종 보존19,20, 약물 개발21 및 독성학 스크리닝22,23을 포함하여 광범위한 응용 분야를 가지고 있습니다.

시험관 내 난포 배양 시스템은 또한 시험관 내 배우자 형성(IVG)24으로도 알려진 만능 줄기 세포로부터 배우자를 생성하는 능력을 위한 필수적인 중간 단계입니다. 연구자들은 배아 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포 및 유도 만능 줄기 세포를 활용하여 다양한 종의 배우자를 개발했으며, 종종 체세포에 의존하여 천연 난포 미세 환경을 재현했습니다 25,26,27,28,29,30. 이러한 방법을 통해 주요 개념 증명 이정표가 달성되었지만, 마우스의 체외 수정 후 낮은 배아 발달 및 살아있는 자손 비율에 반영되는 낮은 품질의 난모세포에 대한 과제가 여전히 존재합니다31,32. 다른 종에서는 아직 정상 출산이 이루어지지 않았으며, 이는 난자 형성 및 난포 형성을 완전히 지원하기 위한 프로토콜의 지속적인 개선이 필요함을 강조합니다.

현재 난포 배양에는 여러 가지 전략이 활용되고 있습니다. 기술적으로 가장 까다롭지 않고 처리량이 가장 높은 접근법은 모낭을 플라스틱 접시 또는 멤브레인 인서트(33,34)에 배치하는 스캐폴드 없는 방법입니다. 여기서, 과립막 세포는 배양 표면에 부착되어 난모세포33,34와의 접촉을 잃습니다. 모낭 구조의 파괴는 이러한 기술의 유용성과 생물학적 관련성을 제한합니다. 그러나, 낮은 부착 플레이트 또는 거꾸로 된 방울에서 스캐폴드가 없는 배양은 난포가 여러 포유류 종에서 구조적 무결성을 유지할 수 있도록 합니다 35,36,37. 불행히도 이러한 기술을 사용하면 모낭 간의 상호 작용과 모낭이 받는 기계적 지지의 양을 제어하기가 어렵습니다. 따라서, 생체 내 생리학을 더 잘 요약하기 위해, 난포가 정의되고 조정 가능한 화학 조성 및/또는 기계적 성질을 갖는 하이드로겔에 캡슐화되는 배양 방법이 개발되었습니다 33,34,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53. 예를 들어, 알지네이트로 캡슐화된 시험관 내 난포 성장 시스템은 생체 내에서 관찰된 주요 전사체 시그니처를 요약할 수 있습니다 21.

캡슐화된 배양 프로토콜의 성공과 가치에도 불구하고 몇 가지 단점이 있습니다. 기술적으로 까다롭고 힘들며 처리량이 낮을 수 있으며 자동 이미징 방법과 호환되지 않습니다. 또한, 캡슐화된 배양 방법은 난포의 더 높은 체적 확장으로 인해 더 큰 포유류 종에 대한 다단계 접근법이 필요합니다37. 또한, 캡슐화된 기술은 모든 방향으로 균일한 지지력을 발휘하며, 배란 전에 하이드로겔에서 난포를 방출해야 합니다. 이것은 난포가 동적 생체역학적 지원을 제공하는 주변 난소 미세 환경과 상호 작용하는 생체 내에서 발생하지 않습니다54. 예를 들어, 뻣뻣한 난소 피질은 원시 난포의 정지를 유지하는 반면, 성장하는 큰 난포는 일반적으로 더 부드러운 수질 구획에서 발견됩니다55,56. 유능한 난모세포가 있는 난포가 말단 크기에 도달하면 난포벽과 난소 표면 상피 변형을 통해 배란이 가능합니다. 따라서 난포가 저항이 거의 없이 한 방향으로 성장하도록 허용하는 배양 기술은 생체 내 생리학을 더 잘 모방할 수 있습니다.

새로운 접근법으로, 마우스 다층 2차 난포에 대한 재현 가능하고 확장 가능하며 기술적으로 덜 까다롭고 비용 효율적인 배양 방법이 개발되었습니다57. 여기에서 정밀하게 제어 가능한 형상(모양, 치수) 및 공간 배열(수, 근접성)을 갖춘 초저접착 아가로스 마이크로웰은 저렴한 방법을 사용하여 제조됩니다. 아가로스 몰드의 난포는 한 방향을 제외한 모든 방향에서 기계적 지지를 경험하고 동일한 초점면에서 배양되어 고급 형태동태 분석을 위한 타임랩스 이미징을 가능하게 합니다. 광조형(SLA) 3D 프린팅은 마스터 몰드를 제조하는 접근 가능한 방법으로 활용되었으며, 이어서 침출수가 없는 실리콘 몰드를 만들어 아가로스를 주조하는 성형 단계를 거쳤습니다. 전체 난포 생존, 성숙 또는 황체화를 손상시키지 않으면서 기존 eIVFG와 비교하여 새로운 시스템을 사용하여 개선된 난포 성장 및 배란 결과를 달성했습니다57. 이 프로토콜 문서는 아가로스 몰드를 맞춤화하고 제조하는 데 필요한 단계, 다층 2차 난포를 파종 및 배양하는 방법, 처리 및 최종적으로 타임랩스 분석을 수행하는 방법에 대해 설명합니다(그림 1).

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프로토콜

이 프로토콜과 관련된 모든 동물 절차는 노스웨스턴 대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았으며 실험 동물 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 가이드에 따라 수행되었습니다.

1. 마스터 금형 설계 적용

이 섹션에서는 24웰 마스터 몰드 베이스 설계(보충 파일 1)라고 하는 24웰 배양 플레이트용 마스터 몰드의 CAD(Computer-Aided Design)에 맞춤형 마이크로웰이 도입되는 설계 단계(그림 1)에서 수행되는 첫 번째 단계에 대해 설명합니다. 마이크로웰의 치수는 지지의 양과 모낭의 최대 성장 크기를 결정하는 반면, 웰의 수는 아가로스 곰팡이당 최대 모낭 수를 결정합니다. 적응된 마스터 금형 설계는 다음 섹션에서 아가로스 주조용 생체 적합성 실리콘 금형을 만드는 데 사용됩니다.

  1. CAD 소프트웨어를 사용하여 24웰 마스터 몰드 베이스 설계 .step 파일을 엽니다(그림 2A).
  2. 객체의 내부 표면적을 선택한 다음 설계 작업공간에서 솔리드 탭으로 이동하고 스케치 작성을 선택하여 원하는 마이크로몰드 설계를 삽입합니다(그림 2Bi).
  3. 원하는 xy 치수와 마이크로웰 수를 소개하고 도구 모음에서 마무리 스케치 를 선택합니다(그림 2Bii).
    참고: 다층 2차 난포의 경우 이전에 500 x 700μm 경기장 기하학적 모양이 사용되었습니다57. 인쇄 해상도는 사용되는 레진 및 SLA 프린터에 따라 달라질 수 있습니다. 마이크로웰 사이에 최소 400μm의 간격을 허용합니다.
  4. 압출 기능을 사용하여 800μm 깊이의 마이크로웰을 생성합니다(솔리드 | 만들기 | 돌출)을 사용합니다. 절단 작업을 선택하여 마이크로웰 캐비티를 생성해야 합니다(그림 2Biii).
  5. 반 경 0.100mm 필렛 선택( 디자인 | 솔리드 | 수정 | 필렛) 마이크로웰 상단
    참고: 둥근 바닥 마이크로웰을 생성하려면 배양 웰의 바닥에 대해 필렛 작업을 다시 사용하고 반지름 값을 마이크로웰 설계의 반지름과 동일하게 합니다. 예를 들어, 500 μm x 700 μm 웰을 설계할 때 0.250 mm 반경 값을 선택합니다(그림 2Biv).
  6. 새 마스터 금형 설계의 복사본을 .step 형식으로 내보냅니다(파일 | 내보내기 클릭).

2. 실리콘 몰드 용기 만들기

참고: 3D 프린팅 부품에서 세포독성 화합물이 침출되는 것을 방지하기 위해 두 개의 생체 적합성 실리콘 몰드가 만들어집니다. 이 섹션에서는 설계 단계의 마지막 단계(그림 1)에 대해 설명하고 실리콘 성형에 사용되는 두 개의 용기를 생성합니다. 여기에서는 세 가지 다른 CAD 파일, 즉 섹션 1에서 생성된 새로운 마스터 금형 설계와 24웰 실리콘 주조 용기 1 및 2가 사용됩니다(각각 그림 2Ci-ii 및 보충 파일 2, 보충 파일 3).

  1. 24웰 실리콘 주조 용기 1.step 파일을 열고 새 마스터 금형 설계를 외부 구성 요소로 삽입합니다(솔리드 | 삽입 | Insert Component)를 사용합니다.
    1. 구성요소를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 링크 끊 기를 선택하여 새 마스터 금형 설계에 대한 링크된 참조를 제거합니다.
  2. 새로운 마스터 금형 디자인을 24웰 실리콘 주조 용기 1 표면으로 중앙에 배치하여 안쪽을 향하도록 합니다.
    1. 검색기에서 새 마스터 금형 설계 객체를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 이동/복사 옵션을 선택합니다.
    2. 이동 유형(Move Type) 섹션에서 자유 이동(Free Move) 작업을 선택하고 필요한 경우 객체를 x축에서 180° 회전합니다.
    3. 유형 이동 섹션에서 새 마스터 금형 설계 객체의 중간을 원점으로 하고 24웰 실리콘 주조 컨테이너 1 표면의 중심을 목표점으로 사용하여 점 간 작업을 선택합니다.
    4. 확인을 선택하여 개체를 정렬합니다.
  3. 컨테이너를 대상 본체로 사용하고 마스터 금형을 공구 본체 설계로 사용하여 절단 작업을 선택합니다(그림 2Ciii). 이렇게 하면 실리콘 성형의 첫 번째 단계를 위한 용기가 생성됩니다(그림 2Civ).
    참고: 첫 번째 섹션에서 설계된 마이크로웰은 이제 섹션 3에 설명된 대로 3D 프린팅될 마이크로필러입니다. SLA 인쇄는 적층 제조 방법입니다. 따라서 마이크로필라 인쇄는 마이크로웰 인쇄에 비해 인쇄 해상도를 향상시킵니다.
  4. 결과 새 24웰 실리콘 몰드 1 을 .stl 및 .step 파일로 저장하고 내보냅니다.

실리콘 용기의 3. 3D 인쇄

참고: 이 섹션에서는 원하는 마이크로웰 설계 기능을 갖춘 새로운 CAD 설계가 3D 프린팅되는 제조 단계(그림 1)에서 수행되는 첫 번째 단계에 대해 설명합니다.

  1. 3D 프린트 준비 소프트웨어를 사용하여 새로운 24웰 실리콘 몰드 1 및 24웰 실리콘 캐스트 용기 2 의 .stl 파일을 엽니다.
  2. 마이크로필러가 위쪽을 향하도록 인쇄물의 방향을 잡고 드릴 구멍 기능을 사용하여 1mm 너비의 개구부를 만듭니다(그림 2D). 이 채널이 인쇄물 측면으로 열려 있는지 확인합니다.
    참고: 인쇄 중 부항 효과를 방지하고 인쇄 후 채울 수 있는 보어 구멍 또는 첫 번째 실리콘 성형 후 과도한 실리콘 재료를 제거할 수 있습니다.
  3. 25μm 층 두께로 두 용기 디자인을 인쇄합니다(그림 3A).
    알림: 처리 중 인쇄 결함이나 손상을 고려하여 각 모델을 세 번 인쇄하십시오.
  4. 인쇄 플랫폼에서 금형을 제거하고 제조업체의 지침에 따라 95% 이소프로판올로 세척합니다. 마이크로필러 섹션에 95% 이소프로판올을 광범위하게 분사합니다(그림 3B). 압축 공기로 남아 있는 에탄올을 제거합니다.
  5. 남은 에탄올을 최소 30분 동안 증발시킵니다.
    알림: 이 단계에서 1mm 너비의 드릴 채널을 밀봉할 수 있습니다. 이는 인쇄물 외부에 p200 피펫 팁을 사용하여 중합되지 않은 수지를 소량 떨어뜨려 수행할 수 있습니다. 모세관 힘이 채널을 채울 것입니다.
  6. 3D 프린트를 60°C에서 자외선으로 15분 동안 경화시킵니다.
  7. 실체현미경을 사용하여 각 인쇄물을 검사하고 결함이 있는 3D 인쇄물은 폐기합니다(그림 3C-F). 모든 인쇄물을 육안으로 철저히 검사하여 모든 마이크로필러가 분리되고 크기와 모양이 균일한지 확인합니다(그림 3D). 병합된 미세 기둥이 있는 결함 마스터 금형을 폐기하십시오(그림 3E).
    참고: 일반적인 문제는 세척되지 않은 수지로 인해 손상된 마이크로필러 또는 브리지입니다(그림 3Fi,ii).
  8. 드릴 채널이 채워지지 않은 경우 인쇄물 외부를 파라필름으로 덮고 나중에 사용할 때까지 보관하십시오.

4. 실리콘 금형 제조

참고: 이 섹션에서는 두 가지 실리콘 성형 단계가 진행되는 제조 단계(그림 1)의 마지막 단계에 대해 설명합니다. 이는 3D 프린팅 부품에 의한 독성 침출수 방출을 방지하는 데 필요합니다.

  1. 요약하면 제조업체의 지침에 따라 실리콘을 준비하십시오.
    1. 파트 A와 B 용기의 내용물을 완전히 섞고 비커를 저울에 올려 놓고 1A:1B 중량 비율로 용기에 붓습니다. 여분의 재료가 있는지 확인하십시오.
    2. 측면과 바닥을 긁어내면서 3분 동안 잘 섞습니다.
    3. 재료를 진공 데시케이터에 넣고 5분 동안 방치하여 갇힌 기포를 제거합니다. 기포가 남아 있으면 최대 2회 탈기를 반복합니다.
  2. 균일한 흐름으로 혼합물을 실리콘 몰드 용기 1에 붓습니다. 실리콘 몰드의 평탄도를 보장하기 위해 혼합물 수준이 3D 프린트와 동일하거나 약간 낮은지 확인하십시오(그림 4Ai,ii).
    1. p200 피펫 팁을 사용하여 갇힌 공기를 제거하고 필요한 경우 진공 탈기를 사용합니다.
  3. 실리콘을 실온에서 최소 5시간 동안 경화시키고 가급적이면 탈형하기 전에 밤새 경화하십시오.
  4. 3D 프린팅된 몰드에서 실리콘을 제거하고 실체 현미경을 사용하여 마이크로몰드의 무결성을 육안으로 확인합니다(그림 4Aiii,B). 필요한 경우 드릴 채널에서 여분의 재료를 제거합니다(그림 4Aiv). 브리징 또는 손상된 마이크로웰이 있는 금형을 폐기하십시오(그림 4C).
  5. 두 번째 실리콘 성형 단계를 위해 실리콘 몰드를 실리콘 몰드 용기 2에 넣습니다(그림 4Av). 실리콘 용기 2에는 실리콘 몰드를 배치하면 덮을 1mm의 측벽 구멍이 있습니다.
  6. 실리콘 몰드에 배아에 안전한 미네랄 오일을 가볍게 뿌리고 마이크로웰에서 과도한 오일을 제거합니다. 이것은 경화 후 두 실리콘 부품을 분리하는 이형제 역할을 합니다.
  7. 4.1단계에서 설명한 혼합 단계를 반복하고 혼합물을 실리콘 몰드 용기 2에 붓습니다. 실리콘 몰드의 평탄도를 보장하기 위해 혼합물 레벨이 3D 프린트보다 낮거나 같은 높이인지 확인하십시오(그림 4Avi).
  8. 실리콘을 실온에서 최소 5시간, 가급적이면 밤새 경화시킨 후 탈형하십시오.
  9. 3D 프린팅 몰드에서 실리콘을 제거하고 실리콘 몰드 1과 2를 서로 분리합니다(그림 4Avii). 실체 현미경을 사용하여 미세 기둥의 무결성을 육안으로 확인합니다(그림 4D). 마이크로웰에 기포나 과도한 오일이 있는 경우 금형을 폐기하십시오(그림 4E).
  10. 실리콘 몰드를 70% 에탄올로 세척하고 층류 후드에서 30분 동안 자연 건조시킵니다.
  11. 멸균 파우치에 넣고 건식 사이클을 사용하여 오토클레이브하여 멸균합니다(재킷 압력: 20psi, 챔버 온도: 250°F, 멸균 시간: 15분).

5. 배양 배지 준비

참고: 난포의 분리 및 배양, 난모세포의 시험관 내 성숙 및 황체화를 위한 난소 조직의 소화에는 6가지 유형의 배지가 필요합니다: 해부 배지(DM), 효소 배지(EM), 유지 배지(MM), 성장 배지(GM), 성숙 배지(IVM) 및 황체화 배지(LM). 이러한 매체의 준비는 Simon et al.33에 의해 분석된 다양한 매체 구성 요소의 중요성에 대한 설명과 함께 Converse et al.38에 의해 이전에 설명된 대로 찾을 수 있으며, 그 목적은 표 1에 간략하게 언급되어 있습니다.

  1. 배지를 최대 1주일 전에 준비하고 4°C에서 보관합니다.

6. 맞춤형 아가로스 곰팡이 및 난포 배양의 주조 및 보관

참고: 이 섹션에서는 섹션 4에서 생성된 실리콘 몰드에서 난포 배양을 위한 맞춤형 아가로스 몰드를 주조하는 방법을 설명합니다. 아가로스 몰드는 모낭 배양 최대 2주 전까지 4°C에서 만들어 보관할 수 있습니다.

  1. 4.11절에 설명된 대로 건식 사이클을 사용하여 금형을 멸균 파우치와 오토클레이브에 넣습니다. 사용하기 전에 금형을 식히십시오.
  2. 멸균 1.5% 아가로스(w/v) 용액을 전자레인지 또는 핫플레이트의 인산염 완충 식염수(PBS)에 녹여 아가로스 용액을 만듭니다. 아가로스를 보다 고르게 가열하고 액체 아가로스 용액의 응고 속도를 늦추기 위해 물이 담긴 비커에 넣은 멸균 원추형 튜브를 활용합니다.
  3. 멸균 아가로스 용액을 층류 후드에서 실리콘 캐스트로 피펫팅합니다. 기포 형성을 최소화하고 금형 상단이 볼록하거나 오목하지 않고 평평한지 확인하기 위해 천천히 부드럽게 피펫팅합니다. 주조할 때 상단은 배양할 때 금형의 바닥이 되며 평평하게 놓여야합니다. 24웰 플레이트 마이크로몰드에는 약 600μL의 아가로스를 사용하고 96웰 플레이트에 맞는 마이크로몰드에는 85μL를 사용합니다.
  4. 마이크로몰드가 굳을 때까지 ~3분 동안 식히십시오. 실리콘 주조를 뒤집어 마이크로몰드를 100mm 페트리 접시에 배출합니다.
  5. 균열, 마이크로웰 합쳐짐 또는 불완전한 경계를 포함한 변형이 있는지 현미경으로 마이크로몰드를 평가합니다. 마이크로몰드를 멸균 PBS + 1% 페니실린-스트렙토마이신에 넣고 사용하기 전에 최대 2주 동안 4°C에서 보관합니다.
    참고: 플레이트 사이를 옮길 때 시간이 지남에 따라 열화되거나 마이크로몰드가 손상되는 것을 고려하기 위해 필요한 것보다 더 많은 금형을 만드십시오.
  6. 난포 분리 당일 최소 1시간(총 2회 배양) 동안 750μL의 유지 배지 2배에서 마이크로몰드를 평형화합니다.
  7. 모든 유지 배지를 제거하고 750μL의 성장 배지를 추가한 다음 인큐베이터에 1시간 동안 넣습니다.
  8. 파종하기 전에 신선하고 균형 잡힌 성장 배지로 교체하십시오.

7. 후기 2차 난포의 분리 및 배양

참고: 이 섹션에서는 난포 배양을 위해 아가로스 마이크로몰드에서 난포를 분리하고 파종하는 방법을 설명합니다. 다층 2차 세포는 8일 동안 배양되며 생존율이 80% 이상이어야 하며 성숙한 난모세포를 생산해야 합니다. 2차 난포의 분리 및 배양은 다른 곳에서 상당히 자세히 설명되었습니다38. 확립된 알지네이트 캡슐화 및 아가로스 몰드에 파종하기 위한 모낭의 분리 및 선택은 일관됩니다.

  1. 생쥐의 난소를 해부하고 주변 지방 조직과 활액낭에서 제거합니다. 난소를 2.5mL의 효소 배지에 넣고 앞서 설명한 대로 37°C에서 20분 동안 안와 셰이커에서 배양합니다57.
  2. IVF 접시에 유지 배지 2mL를 피펫팅하고 난포 분리 전에 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에 넣습니다.
  3. 250μL의 FBS로 반응을 담금질합니다. 효소 분리 후 후기 2차 난포를 선택하고 DM과 함께 IVF 접시로 옮깁니다.
  4. 난포를 사전 평형화된 유지 배지가 있는 IVF 접시로 옮기고 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에 1시간 동안 넣습니다.
    참고: 후기 2차 난포의 시작 크기는 150-180μm이며 2층 이상의 과립막 세포가 존재합니다.
  5. 750μL의 신선한 GM을 아가로스 마이크로몰드에 넣고 인큐베이터에 보관하여 파종을 준비합니다. 아가로스 마이크로몰드 주변의 인접한 웰에 멸균 PBS를 추가하여 습도를 유지하고 배양 기간 동안 배지의 증발을 최소화합니다.
  6. 미리 평형화된 아가로스 몰드에 난포를 파종하고 GM에 잠깁니다. 200μm 스트리퍼 팁을 사용하여 현미경으로 고품질 다층 2차 모낭을 아가로스 마이크로몰드로 옮깁니다. 10개의 난포가 24웰 플레이트의 각 마이크로몰드로 옮겨지고 각 난포가 별개이지만 인접한 마이크로웰에 있는지 확인합니다.
    1. 스트리퍼 팁을 구부려 모낭을 보다 정확하게 조작하고 마이크로웰로 옮길 수 있습니다.
    2. MM과 GM이 CO2 완충되므로 온도와 pH 변화를 최소화하기 위해 난포를 빠르게 옮깁니다.
    3. 10개의 모낭이 모두 옮겨진 후 마이크로몰드 내의 모낭이 유사한 시작 크기인지 확인하십시오.
  7. 시딩된 마이크로몰드를 인큐베이터에 최소 1시간 동안 다시 넣어 이미징 전에 모낭이 회복될 수 있도록 합니다.
  8. 난포 생존 및 성장 결과를 정량화하기 위해 격일로 4배 및 10배 배율로 모낭을 이미지화합니다.
    참고: 타임랩스 이미징은 형태동학 측정을 수행하도록 설정할 수도 있으며 섹션 9에 더 자세히 설명되어 있습니다.
  9. 격일로 배양 배지의 50%를 교체합니다.
  10. 사용한 배지를 드라이아이스로 급속 냉동한 다음 -80°C에서 보관합니다. 이 컨디셔닝 배지를 사용하여 에스트라디올 ELISA를 통해 호르몬 생산을 평가합니다.
    참고: 파종 당일(배양 기간 시작)에 GM을 만드는 경우 배지를 4°C에서 보관하고 전체 배양 기간 동안 활용할 수 있습니다.
  11. 배양 8일째에 모든 성장 배지(750μL)를 제거하고 급속 냉동합니다.
  12. 체외 배란을 허용하기 위해 성장 배지를 IVM 배지로 교체하십시오.
    참고: 배란은 타이밍 및 파열 특징을 평가하기 위해 타임랩스 이미징에서도 발생할 수 있습니다.
  13. IVM 배지를 추가한 후 14-16시간 후에 난구-난모세포 복합체(COC)를 제거하고 성숙 상태를 점수화합니다.
    1. 성숙 상태를 정의하는 것은 다음과 같습니다: 첫 번째 극체의 압출에 의한 MII(건강한 난모세포에 대한 예상 결과), 극체 또는 배낭의 부족(성숙 지연)에 의한 GVBD/MI, 난모세포 중앙에서 보이는 구형 핵에 의한 GV(감수분열 진행 부족) 또는 퇴행-편평 및/또는 어두워진 난모세포.
  14. 선택 사항: 염색체 정렬, 모양 및 부피를 포함한 MII 난모세포의 방추 매개변수는 난모세포 품질 및 배아 결과58,59와 밀접한 상관관계가 있으므로 이를 사용하여 시험관 내 난자 형성의 성공을 평가합니다. 방추 형태를 평가하려면 전체 마운트 면역세포화학을 통해 MII 난자를 고정하고 염색합니다.
    1. 고정: 계란을 3.8°C에서 0.1% Triton X-100과 함께 37% PFA에 20분 동안 고정합니다. 계란을 차단 완충액(10% Tween-20 및 0.3% BSA가 포함된 칼슘 및 마그네슘(PBS +/+)이 포함된 PBS)에서 3회 세척합니다.
    2. 스핀들 염색:
      1. 실온에서 15분 동안 투과화 완충액(0.1% Triton X-100 및 0.3% BSA가 포함된 PBS +/+)에서 계란을 배양합니다.
      2. 블로킹 버퍼에 2번 헹구십시오.
      3. Alexa Fluor 488-접합 항-알파-튜불린에서 호일로 싸인 로커에서 1μg/mL의 농도로 계란을 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
      4. DAPI 함유 마운팅 매체로 현미경 슬라이드에 장착하기 전에 차단 완충액에서 계란을 3 x 20분 동안 세척합니다.
      5. 난자 세포골격을 관찰하기 위해 염색 중에 1:50 로다민 팔로이딘을 포함합니다.
    3. 전체 스핀들에 걸쳐 1.0μm 너비의 z-스택이 있는 63x 대물렌즈를 사용하여 컨포칼 현미경에서 샘플을 이미지화합니다.

8. 맞춤형 아가로스 몰드의 다운스트림 적용

참고: 아가로스 마이크로몰드는 조직학적 분석에 활용될 수 있으며, 이를 통해 관심 있는 다양한 유전자 또는 단백질의 정량화 및 국소화가 가능합니다. 마이크로몰드는 여러 모낭을 병렬로 염색할 수 있는 모낭 마이크로어레이를 생성합니다. 광간섭단층촬영(OCT)은 난포를 옮기지 않고도 수행할 수 있습니다(그림 1, 응용 프로그램). 광간섭단층촬영(Optical Coherence Tomography)은 시료의 3D 재구성이 가능하고 공초점 현미경에 비해 침투 깊이와 해상도가 높아 시험관 내에서 배양된 난포와 같은 3D 시료의 이미징을 개선할 수 있는 이미징 기술입니다.

  1. 조직학 응용 분야의 경우 6.2단계에서 설명한 대로 아가로스 용액(1.5% w/v)을 만듭니다.
    1. 웰에서 아가로스 마이크로몰드를 둘러싼 모든 배지를 제거하고 캐비티 모서리에 있는 p200 피펫을 사용하여 마이크로몰드 캐비티의 배지를 조심스럽게 제거합니다.
    2. 100μL의 액체 아가로스 용액을 조심스럽게 피펫팅하여 난포를 교반하지 않고 마이크로웰과 캐비티를 채우고 밀봉합니다. 상단이 평평한지 확인하십시오. 멸균 P10 피펫 팁으로 기포를 제거합니다.
    3. 아가로스를 실온에서 2분 동안 응고시킵니다. 현미경으로 마이크로몰드가 완전히 밀봉되었는지 확인하십시오.
    4. 마이크로몰드를 4°C에서 밤새 고정하여 750μL의 고정액(Modified Davidson's Solution 또는 3.8% 파라포름알데히드)에 부드럽게 흔듭니다.
    5. 고정액을 흡인하고 밀봉된 마이크로몰드를 50%에서 시작하여 마지막으로 70% EtOH로 시작하여 에탄올의 오름차순으로 세척합니다.
    6. 표준 처리 프로토콜(표 2)을 활용하는 자동화된 조직 처리기를 사용하여 처리하고 파라핀 왁스에 포장합니다. 임베딩할 때 마이크로몰드의 방향을 기록해 두십시오. 절편 중 조직 손실을 최소화하기 위해 매립 과정에서 샘플 전후에 왁스가 있는지 확인하십시오.
    7. 5μm 두께로 매립된 샘플을 연속적으로 절편하고 하전된 현미경 슬라이드에 놓습니다.
    8. 이미징 전에 자동 염색기로 H&E 염색을 수행하고 마운팅 매체로 밀봉합니다.
  2. OCT를 수행할 때 IVM 배지가 들어 있는 50mm 접시에 모낭이 있는 마이크로몰드를 넣습니다.
    1. 대표적인 OCT 이미지를 생성하는 데 사용되는 절차를 따르려면 축 해상도 1.3μm, 측면 해상도 9.4μm의 가시광선 스펙트럼 범위 내에서 작동하는 맞춤형 OCT 시스템을 사용하여 이미지화합니다61,62.
    2. 1.58개의 A-라인과 1,58개의 B-스캔으로 구성된 1.58 x 1,52mm512 시야에서 모낭을 스캔하고 B-스캔당 2회, 볼륨당 3회 반복합니다.
    3. ImageJ를 사용하여 OCT 이미지를 처리하여 모낭의 3D 구조를 시각화하고 부피를 정량화합니다.
      1. 파일을 열려 있는 응용 프로그램으로 드래그하여 이미지를 ImageJ에 Z-스택으로 업로드합니다.
      2. 플러그인 |3D|볼륨 뷰어. 3D 이미지를 회전하여 다른 시점에서 다른 각도를 볼 수 있습니다.
      3. 파일로 이동| 다른 이름으로 저장 |Tiff를 사용하여 이미지를 원하는 위치에 저장합니다.

9. 난포 배양의 타임랩스 분석

참고: 스캐폴드가 없는 배양 시스템에서 성장한 난포는 동일한 초점면에 상주하며 인큐베이터의 타임랩스 이미징과 호환됩니다. 타임랩스 이미징은 7.7단계(그림 1, 적용)에서 난포를 파종한 후 시작할 수 있습니다.

타임랩스 전체에서 모든 변경 사항이 정확한지 확인하십시오. 따라서 측정값에 불일치가 없는지 확인하기 위해 모든 단계 후에 전체 스택을 통과하십시오.

  1. 타임랩스 설정:
    1. 휴대용 현미경에 광 초점/집중 캡을 놓습니다.
    2. 마운트 홀더가 있는 휴대용 현미경을 인큐베이터에 넣고 소프트웨어가 설치된 노트북에 연결합니다.
    3. 배양액을 현미경 아래에 잘 놓고 정렬하고 현미경의 높이와 초점을 조정하여 모든 난포에 초점이 맞도록 합니다. 자동 화이트 밸런스 (AWB)를 사용하여 LED 제어 를 사용하여 최적의 조명 조건을 선택하고 자동 노출 (AE)을 끄고 최적의 노출 시간을 선택합니다.
      알림: 각 미디어 교체 전후에 금형의 정렬이 동일한지 확인하십시오. 그렇지 않으면 배양 2일마다 별도로 분석을 수행해야 합니다.
    4. 타임랩스 이미징을 시작하고 8일 의 지속 시간과 30분의 간격을 선택합니다. 사진을 선택하고 사진을 찍지 않을 때 LED를 끕니다.
  2. ImageJ 분석 전에 측정 설정 대화 상자( 분석 | 측정 설정 클릭)에서 기록할 측정값을 지정합니다.
    알림: ImageJ 소프트웨어에 통합된 가능한 측정에 대한 자세한 내용은 사용 설명서 하위 섹션 30.763을 참조하십시오.
  3. 모든 이미지를 별도의 분석 폴더에 배치하여 분석을 시작합니다.
  4. 분석 폴더를 ImageJ 소프트웨어로 끌어다 놓아 타임랩스를 스택으로 엽니다. 숫자 로 정렬 이름이 선택되어 있는지 확인하고 이미지 시퀀스가 컴퓨터의 RAM에 맞지 않는 경우 가상 스택을 선택합니다.
  5. 직사각형 선택 도구를 사용하여 타임랩스 전체의 모든 모낭이 있는 영역을 선택합니다. 이를 위해 먼저 마지막 이미지를 사용하고 스택을 스크롤하여 모낭이 잘리지 않는지 확인하십시오. 그런 다음 선택 항목을 자릅니다(이미지 | 자르기 또는 Ctrl+Shift+X, 그림 5Ai,ii).
  6. 타임랩스 스택의 배율 막대를 설정합니다(분석 | Set Scale)을 사용합니다. 이미저로 만든 0일차 이미지를 활용하고 난포 또는 마이크로웰과 같은 세 가지 식별 가능한 특징을 측정합니다. 타임랩스 스택에서 같은 날 0 이미지를 사용하고 측정 중 하나에 대한 축척을 정의합니다. 다른 두 측정값을 사용하여 정확한 눈금이 설정되었는지 확인합니다.
  7. SIFT 플러그인을 사용하여 모든 이미지를 정렬합니다(플러그인 | 등록 | SIFT를 사용한 선형 스택 정렬(그림 5Bi,ii). 사례별로 조정할 수 있는 다음 표준 설정을 사용합니다: SIFT를 사용한 선형 스택 정렬, initial_gaussian_blur = 1.60 steps_per_scale_octave = 3 minimum_image_size = 64 maximum_image_size = 1024 feature_descriptor_size = 4 feature_descriptor_orientation_bins = 8 가장 가까움/next_closest_ratio = 0.92 maximal_alignment_error = 25 inlier_ratio = 0.05 expected_transformation=강성 보간.
  8. 스택을 8비트 그레이스케일로 변환(이미지 | 유형 | 8비트).
  9. 롤링 볼 배경 빼기를 사용하여 배경을 제거합니다(프로세스 | Behind 빼기, 그림 5Ci,ii) 사례별로 조정할 수 있는 다음 설정을 사용합니다. 롤링 볼 반경=70.0픽셀; 스무딩 비활성화를 선택합니다.
  10. 이미지 임계값( 이미지 | 조정 | Threshold)를 사용하여 타임랩스 이미지를 두 가지 픽셀 클래스로 나눕니다: setThreshold(35, 255, "raw"); run("Apply LUT", "stack"); setOption("BlackBackground", true); run("Convert to Mask", "method=Intermodes background=Dark calculate black").
  11. 직사각형 선택을 사용하여 각 모낭을 개별적으로 측정한 다음 입자 분석 기능을 선택합니다(분석 | 입자 분석). 다음 설정을 사용합니다: 입자 분석...", "size= 8000-Infinity 디스플레이 제외 포함 요약 오버레이 추가 복합 스택(그림 5Di,ii).
    1. 결과를 저장하기 전에 각 이미지의 ROI가 정확한지 확인하십시오(그림 5Ei,ii). 요약 및 결과를 . CSV 형식.
    2. 다른 모든 모낭에 대해 이 작업을 반복합니다.

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결과

프로토콜 섹션 7에 설명된 바와 같이 이 새로운 기술을 사용하여 난포 생존 및 성장이 지원되는지 여부를 결정하기 위해, 동일한 마우스의 난포를 분리하여 아가로스 마이크로몰드에서 병렬로 배양하거나 0.5% 알지네이트에 캡슐화했습니다. 격일로 배양한 난포의 대표적인 이미지는 배양 기간 동안 전정부강의 정상적인 발달, 성장 및 형성을 보여주었습니다(그림 6A). 이전에 발표된 결과는 난포 생존이 배양 방법 간에 유의미한 차이가 없으며 아가로스에서 배양된 난포의 직경이 상당히 더 크다는 것을 보여주었습니다57. 이는 아가로스 마이크로몰드가 알지네이트 캡슐화에 비해 향상된 속도로 난포 형성을 지원한다는 것을 나타냅니다.

아가로스 마이크로몰드에서 배양된 난포의 난모세포의 감수 분열 진행 및 방추 정렬을 평가했습니다. 프로토콜 단계 7....

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토론

시험관 내 배우자 형성 및 성숙은 난모세포 생물학의 근본적인 이해를 위한 핵심 기술이며, 보조 생식 기술, 생식력 보존 및 종 보존에 잠재적으로 응용될 수 있습니다. IVG를 지원하는 방법은 종종 재건된 난소를 만들기 위해 체세포와의 공동 배양에 의존합니다30. 이러한 지지 세포의 중요성은 생체 내에서 잘 알려져 있으며, 난포 체세포 미세 환경은 건강한 난모세포 성장 및 발달에 중요합니다 2,3,8,9. 불행하게도, 현재의 시험관 내 난포 배양 방법은 활성화가 감소된 난모세포를 생성하여 생체 내 배우자에 비해 수정 및 배아 발달에 부정적...

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 국립 아동 건강 및 인간 발달 연구소(R01HD105752 FED 및 T32HD094699 EJ)와 NIH 공통 기금의 SenNet 프로그램(U54AG075932 및 UH3CA268105 FED) 및 빌 & 멜린다 게이츠 재단 보조금(INV-003385 FED)의 자금 지원을 받았습니다. 빌 & 멜린다 게이츠 재단의 보조금 조건에 따라 이 제출물에서 발생할 수 있는 저자 승인 원고 버전에 크리에이티브 커먼즈 저작자 표시 4.0 일반 라이선스가 이미 할당되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
<스트롱>재료 및 화학
그리고 nbsp; 50 mL 폴리스티렌 원심분리관글로브 사이언티픽941-11017-CS
1.5 mL 마이크로 원심분리관피셔 사이언티브MCT-150스냅, 냉동 및 저장
100mm 접시, 비처리피셔 사이언티브08-757-100D 아가로스 마이크로몰드를 만들고 저장하기
100% 에탄올메르세데스 사이언티픽1200조직 처리
1000 & 마이크로; L  피펫 팁, 저보존중산과학PR-1000BK문화 팁 
200 & 마이크로; L  피펫 팁, 저보존중산과학PR-200BK문화 팁 
24웰 플레이트코닝353047문화
35mm 접시팔콘351008난소를 분리하여 에니즈마틱 매체에서 배양하기 위해
95% 에탄올메르세데스 사이언티픽1210조직 처리
아가로스회퍼GR140마이크로몰드
바이오엑스트라 미네랄 오일, 라이트 오일, 마우스 배아 세포 배양에 적합시그마-올드리치M5310-500ML생체 적합성 탈몰형제로 사용
소 혈청 알부민 MP 생의학103700성장 미디어
청소용 먼지 10온스, 6개 팩오피스 디포  110284압축 공기
투명 V4 레진 1L포뮬랩스 주식회사RS-F2-GPCL-043D 프린팅 수지
코닝 재사용 플라스틱 저형 100 mL 비커, 폴리프로필렌, 눈금식코닝1000P-100실리콘 부품 혼합용 비이커  
DNAse I치아겐79254효소 매체
에코플렉스 00-45 거의 투명스무스-온 주식회사B09M8Y9PTV실리콘 재료
F-12 + 글루타맥스깁코31765-035성장 미디어
태아 소 태아시그마F-3385성장 미디어
태아 소 혈청 (FBS)피크 세럼PS-FB2해양 배지, 효소 배지 등; 유지보수 미디어 및 성숙 미디어
피셔브랜드  멸균 파우치피셔 사이언티브01-812-50  멸균 파우치
난포 자극 호르몬(FSH)EMD 세로노 주식회사고날-F 처방전만 투여하고;성장 미디어 & 성숙 미디어
깁코와 nbsp; DPBS, 칼슘, 마그네슘피셔 사이언티브14-040-182  둘벡코의 인산염 완충 식염수
인간 융모성 생식선자극세포(hCG)시그마 올드리치C1063-1VL성숙 미디어
인슐린-트랜스페린-셀레늄 (ITS)서모피셔41400045성장 미디어
인비트로겐 분자 프로브, 로다민 팔로이딘피셔 사이언티브R415난자 골격 염색
체외수정 요리써모 사이언티픽150260난포를 분리, 선택, 그리고 예비 평형 상태로 만들기
레이보비트츠 15 (L15)깁코11415-064디스해부 미디어 & 효소 매체
리베라세시그마 올드리치5401119001효소 매체
MEM? + 글루타맥스깁코32561-037유지보수 미디어 및 nbsp; 성장 미디어 & 성숙 미디어
마우스 표피 성장 인자(EGF)BD 생명과학354010성숙 미디어
Nalgene 투명 폴리카보네이트 클래식 디자인 건조기써모 사이언티픽5311-0250진공 건조기와 nbsp;
파라핀피셔 사이언티브83-30조직 처리 및 임베딩
페니실린-스트렙토마이신깁코15140-122해부 배지, 효소 배지 및 유지보수 미디어
스트리퍼 팁오리지오MXL3-200문화
벡타쉴드 플러스 안티페이드 마운팅 매체와 DAPI벡터 연구소H-2000난자 핵 염색
자일렌메르세데스 사이언티픽9840조직 처리
&알파;-튜불린 (11H10) 토끼 mAb (Alexa Fluor 488 접합체)세포 신호 전달 기술5063S에그 튜불린 착색
<스트롱>장비
플랫폼 2 건설포뮬랩스 주식회사BP-F3-02-01 3D 프린터 구성 요소
다이노-라이트 엣지 AF4915ZTL, USB 2.0다이노-라이트AF4915ZTL타임랩스 설정용 이미저
폼 3 레진 탱크 V2.1 & nbsp;포뮬랩스 주식회사RT-F3-02-013D 프린터 구성 요소
폼 3B+ 3D 프린터포뮬랩스 주식회사F3B-P-프린터Formlabs의 스테레오리소그래피(SLA) 3D 프린터
형태 치료법  포뮬랩스 주식회사FH-CU-01경화 플랫폼  
폼 워시포뮬랩스 주식회사FH-WA-01세척 플랫폼
펌프 증발기가 달린 스프레이 병VWR0309-3005탈몰제를 적용하기 위해
엣지 시리즈용 라이트 포커서/집광기 캡(T5, T8 모델 제외)다이노-라이트N3C-R타임랩스 설정을 위한 이미저 구성 요소
RK-10 랙과 RK-10-EX 암 익스텐션을 결합한 마운트 홀더 번들다이노-라이트RK-10A타임랩스 설정을 위한 이미저 구성 요소
조직 임베더라이카히스토코어 아카디아마이크로몰드 삽입
조직 프로세서라이카TP1020마이크로몰드 가공
211DS 흔들리는 인큐베이터 (궤도 흔들림)랩넷 인터내셔널I-5211-DS난소를 효소 배지에서 포획하여 난포를 방출하는 방법
Software 
오토데스크 퓨전오토데스크 주식회사컴퓨터 지원 설계(CAD) 소프트웨어. 오토데스크는 오토데스크 교육 프로그램을 통해 무료 교육 접근을 제공합니다.
DinoCapture 3.0 버전 1.1.1.3  다이노-라이트
이미지J국립보건원(NIH)OCT 이미지 분석 및 난포 측정
프리폼포뮬랩스 주식회사Formlabs의 스테레오리소그래피(SLA) 프린터와 호환되도록 설계된 무료 인쇄 준비 소프트웨어입니다. 

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