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방법 논문

키메라 항원 수용체 T 세포 치료 조사를 위한 순환 신경아교종 모델

410 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68881

⸱

2025년 10월 17일

 ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Chemical Engineering, Southeast University, 2Department of Immunology, Key Laboratory of Human Functional Genomics of Jiangsu Province, Gusu School, Nanjing Medical University, 3Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, 4Department of Neurosurgery, The Affiliated Brain Hospital of Nanjing Medical University, 5Department of Clinical Laboratory Medicine, Children's Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 생체 내 키메라 항원 수용체 T 세포 요법의 치료 효과를 조사하기 위해 측심실 주사에 의한 순환 신경아교종 모델을 확립합니다.

초록

뇌척수액(CSF)의 순환 종양 세포는 신경아교종의 종양 재발 및 두개내 전이의 중요한 요인입니다. 많은 연구에서 CSF에서 순환하는 종양을 표적으로 삼고 제거하기 위한 효과적인 전략을 식별하려고 시도하고 있습니다. 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법은 다양한 순환 종양에 자주 사용되었습니다. 그러나 적절한 순환 신경아교종 모델이 없기 때문에 연구가 제한적입니다. 여기에서 순환 신경아교종 모델을 개발하여 CAR T 세포 요법 조사에 적용했습니다. 이 모델은 두개내 질환의 국소 치료에 널리 사용되는 측심실 주사를 사용하여 구성되었습니다. 신경아교종 세포를 측뇌실에 주입하여 두개내 원발성 종양을 형성했습니다. 측심실에서 흘러나온 종양은 CSF에서 순환하는 종양을 나타내는 데 사용되었습니다. 이 모델은 구축하기 쉽고 순환 신경아교종의 CAR T 세포 치료에 대한 다양한 연구에 적용할 수 있습니다. 결과적으로 순환 신경아교종 모델은 순환 종양의 효과적인 CAR T 세포 치료 연구를 위한 고유한 신경아교종 전이 모델을 제공합니다.

서론

신경아교종은 성인에서 가장 흔한 원발성 악성 뇌종양입니다 1,2. 수술, 방사선 요법 및 화학 요법을 포함한 현재 치료법은 제한된 효능을 보여 평균 생존 기간이 14-15개월에 불과합니다 3,4,5. CSF의 순환 신경아교종 세포는 종양 재발 및 두개내 전이에 중요한 역할을 합니다 6,7. 따라서 순환 신경아교종 세포를 제거하기 위한 보다 효과적인 치료 전략을 개발하는 것이 시급합니다.

신경아교종에 대한 최근 연구는 주로 두개내 원발성 종양에 초점을 맞추고 있습니다 8,9. 그러나 임상에서 해결해야 할 가장 중요한 문제는 순환하는 신경아교종 세포를 표적으로 삼아 제거하는 방법입니다. 따라서 수술 전후의 순환신경아교종에 대한 연구는 더 많은 관심이 필요합니다. 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법은 순환 종양 세포에 대한 연구에 사용되는 가장 일반적인 전략입니다10,11. 그러나 두개내 종양의 특수한 해부학적 구조로 인해 순환 신경아교종 연구에 중요한 적절한 순환 신경아교종 모델을 개발하기가 어렵습니다 12,13,14,15,16.

이 연구는 측심실 주사를 기반으로 독특한 순환 신경아교종 모델을 생성했습니다. 이 모델에서는 신경아교종 세포를 측뇌실에 주입하고, 뇌척수총의 두개내 원발성 종양과 순환 종양을 10일째에 생체 내 생물발광 이미징 및 유세포 분석 분석으로 검출합니다. CAR-T 요법은 순환 신경아교종 모델 마우스의 종양 부담이 약 6.5 × 105p/s에 도달했을 때 시작되었습니다. CAR-T 세포의 치료 효과를 평가하기 위해 5일마다 종양 부하를 모니터링했습니다. 이 모델은 신경아교종 환자의 종양 세포 박리 상태를 모방하며 순환 신경아교종에 대한 다양한 연구에 사용될 수 있습니다.

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프로토콜

본 연구의 동물 실험은 모두 난징 의과대학 임상시험심사위원회와 동물윤리위원회(IACUC-1905048)의 승인 및 감독을 받았습니다. 본 연구에는 생후 6-8주인 C57BL/6J 암컷 마우스를 사용하였다. 사용된 시약과 장비는 재료표에 나와 있습니다.

1. 동물 준비

  1. 장벽, 12시간/12시간 빛/암 주기, 주변 온도 24°C, 상대 습도 50% 케이지에 마우스를 수용합니다.
  2. 마우스의 무게를 측정하고 50mg/kg 펜토바르비탈 나트륨 및 10mg/kg 자일라진을 복강내 주사하여 마취합니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따라)17.
    참고: 펜토바르비탈 나트륨과 자일라진의 조합은 마우스 정위 주사 절차에 널리 사용됩니다. 적절한 마취는 발가락 꼬집기에 대한 반응이 없음으로 확인되어 수술 전에 동물이 완전히 의식을 잃었는지 확인했습니다. 각막 건조 및 손상을 방지하기 위해 마취 중 수의학 안과 연고를 눈에 도포했습니다.
  3. 실험용 면도기로 쥐 머리의 털을 제거하고 쥐의 머리와 팔다리를 정위 고정 장치에 고정합니다.
  4. 면봉으로 요오도포를 사용하여 마우스의 머리를 소독하고 멸균 수술용 수건으로 마우스의 나머지 몸체를 덮습니다.
  5. 메스로 오른쪽 이마 상단의 정중선을 따라 두피를 1cm 정도 자릅니다.
    알림: 모든 수술 기구는 감염을 예방하기 위해 사용하기 전에 적절하게 멸균해야 합니다. 부상을 방지하기 위해 기구를 주의해서 취급해야 하며 모든 절차는 멸균 환경에서 수행해야 합니다.
  6. 비강 클립과 이어 로드를 조정하고 람다 봉합사와 브레그마 사이의 Z축 높이 차이가 0.05mm 이하인지 확인합니다.

2. 순환 신경아교종 모델 구축

  1. 용담 보라색을 적신 면봉을 사용하여 정중선 오른쪽에 1.5mm, 브레그마 후쪽에 1.1mm의 지점을 표시합니다(좌표: AP -1.1mm, 브레그마에서 ML -1.5mm).
  2. 직경 0.5mm의 소형 두개골 드릴을 사용하여 목표 좌표에 구멍을 뚫어 경막을 노출시킵니다.
  3. 식염수로 헹구어 뼈 파편을 제거하십시오.
  4. 깊이 제한 마개가 있는 마이크로 주사기(GL261-Luc-Gfp, 0.1% BSA를 함유한 PBS에서 1×105 세포/μL)를 사용하여 5μL의 종양 세포 현탁액을 추출합니다.
  5. 바늘을 0.2mm/s의 속도로 3.0mm 깊이까지 삽입하고 바늘을 0.5mm 되돌리고 10초 동안 일시 중지하여 조직 압력을 안정시킵니다.
  6. 보정된 마이크로 주입 펌프를 사용하여 1 μL/min으로 세포를 주입하고 주입 후 10분의 체류 시간을 유지하여 역류를 최소화합니다.
  7. 마이크로 주사기를 천천히 빼내고 멸균 면봉으로 주사 부위에 30-60초 동안 압력을 가합니다.
  8. 흡수성 수술용 봉합사(6-0)로 두피를 봉합하고 절개 부위를 요오도포어로 재소독합니다.
  9. 재예열을 위해 정밀하게 제어되는 37°C 가열 패드에 마우스를 놓고 상태 모니터링합니다.
  10. 지속적인 교정 반사와 자발적인 이동을 시연한 후 마우스를 깨끗한 케이지로 되돌립니다.
  11. 생 체 내 생물발광 이미징 시스템(IVIS Spectrum)으로 마우스를 이미지화하여 종양 형성 후 10일째에 이식된 종양을 검출합니다.
  12. 마우스에게 D-루시페린 칼륨염(150mg/kg)을 복강내 주사합니다.
    참고: 멸균 D-PBS를 사용하여 D-루시페린 칼륨염을 희석합니다.
  13. 10분의 대기 기간 동안 1L/minO2에 2% 이소플루란을 사용하여 마취를 유도합니다.
    알림: 이소플루란은 마취 증기에 대한 노출을 최소화하기 위해 환기가 잘되는 화학 후드에 사용해야 합니다. 이는 시술 중 동물과 연구원 모두의 안전을 보장하기 위한 것입니다.
  14. 노즈콘 을 통해 1.5% 이소플루란으로 마취를 유지합니다.
  15. IVIS Spectrum을 사용하여 생물 발광 이미징을 수행합니다.
  16. 마우스의 소뇌수질 수조에 구멍을 뚫어 CSF 수집을 수행합니다.
    참고: CSF는 이소플루란 마취 하에 마우스의 소뇌수질 수조에 구멍을 뚫어 수집했습니다. 마취, 외과적 노출, 검체 채취 등 모든 시술은 오염 및 감염 위험을 최소화하기 위해 SPF 조건에서 수행되었습니다. 쥐를 정위 고정 프레임에 엎드린 자세로 놓고 해부 현미경으로 수조 마그나를 조심스럽게 노출시켰습니다. 27G 해밀턴 주사기 바늘을 사용하여 수조에 구멍을 뚫고 프리핸드 기술을 사용하여 CSF를 수집했습니다. 각 마우스로부터 약 5-10μL의 투명한 CSF를 얻었습니다. 감염 위험을 더욱 줄이기 위해 천자 전에 수술 부위를 요오도포로 멸균하고 모든 수술 기구를 고압멸균했습니다. CSF 수집 후 천자 부위를 멸균 면으로 부드럽게 압축하여 체액 누출을 막았습니다. 그런 다음 마우스를 온열 패드 위에 놓고 마취에서 완전히 회복될 때까지 지속적으로 모니터링했습니다. 불편함을 완화하기 위해 수술 후 진통제를 투여했습니다. 동물은 신경학적 증상이나 감염 징후가 없는지 확인하기 위해 최소 연속 3일 동안 매일 관찰되었습니다.
  17. CSF에서 종양 세포를 검출하기 위해 유세포 분석을 수행합니다. GFP+ 집단은 종양 세포를 나타냅니다.
    참고: 쥐 신경아교종 세포주 GL261은 루시페라아제(Luc)를 운반하도록 조작되었습니다. 형광 값이 ~5 × 10에 도달하면 CSF에서5p/sand 종양 세포가 검출되면 절차가 성공한 것입니다. 사용된 이미징 소프트웨어는 Living Image 4.5.2였으며 이미징 매개변수는 Luminescent로 설정되었습니다.
  18. CAR-T 세포 치료 효능을 평가하기 위해 성공적인 종양 보유 마우스를 선택합니다.

3. 측심실에 CAR-T 세포 주사에 의한 순환 신경아교종의 치료

  1. 순환 신경아교종 모델 마우스의 종양 크기가 ~6.5 × 105 p/s가 되면 CAR-T 치료를 위해 이러한 마우스를 선택합니다.
  2. 순환 신경아교종 모델 마우스의 무게를 측정하고 50mg/kg 펜토바르비탈 나트륨 및 50mg/kg 자일라진의 복강내 주사로 마우스를 마취합니다.
  3. 1.3-1.5단계의 과정을 반복합니다.
  4. 두피와 두개골을 분리하고 순환 신경아교종 모델 구성 중에 만들어진 드릴링 구멍을 정확하게 찾아내고 2.2-2.3단계에서 언급한 절차를 따릅니다.
  5. 마이크로 주사기로 CAR-T 세포 현탁액 10μL를 흡인하고, 마우스의 측심실에 바늘을 조심스럽게 삽입하고, 정위 장치를 이용하여 주입 깊이를 조절하고, CAR-T 세포 용액을 천천히 투여한다.
    참고: GL261 세포의 주사와 일치하게, CAR-T 세포를 2.5mm의 주입 깊이로 우측 심실(좌표: AP -1.1 mm, bregma에서 ML -1.5 mm)에 주입하였다. 대조군은 CAR-T 세포 대신 PBS로 처리하였다.
  6. 바늘을 10분 동안 유지한 후 천천히 바늘을 제거하고 멸균 거즈로 주입 지점을 가볍게 눌러 주사 완료 후 출혈을 방지합니다. 흡수성 수술용 봉합사(6-0)로 두피를 봉합하고 절개 부위를 소독합니다.
  7. 재예열을 위해 정밀하게 제어되는 37°C 가열 패드에 마우스를 놓고 상태 모니터링합니다.
  8. 지속적인 교정 반사와 자발적인 이동을 시연한 후 마우스를 깨끗한 케이지로 되돌립니다.
  9. 생쥐의 종양 성장을 모니터링하기 위해 생체 내 생물발광 이미징을 수행합니다. 광학 이미징을 통해 CAR-T 세포 치료 효능을 평가할 수 있습니다.
  10. 이틀에 한 번씩 마우스의 무게를 측정하고 5일마다 BLI 이미징을 수행하여 말단 종점에 도달할 때까지 종양 성장을 보다 정확하게 추적합니다.
  11. 마우스를 안락사시키고 뇌 조직을 4% 파라포름알데히드에 24-48시간 동안 고정시킵니다.
  12. 조직을 파라핀에 매립하고 5μm 두께의 조각으로 절편합니다.
  13. 절편을 탈파라핀하고, 등급이 매겨진 알코올을 통해 재수화하고, 헤마트실린으로 염색하고, 에오신으로 대조염색하고, 커버슬립으로 절편을 장착합니다.
    참고: 본 연구의 경우 최종 종점은 30일이었고 마우스는 복강내 주사와 함께 펜토바르비탈 나트륨의 과다 투여에 의해 안락사되었습니다. 쥐 사체는 폐기를 위해 난징 의과대학 의학 실험 동물 센터로 인계되었습니다. 버려진 바늘은 날카로운 용기에 담아 난징 의과대학 실험실 및 장비 관리부에 인계하여 중앙 폐기했습니다.

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결과

CAR-T 치료를 위한 순환 신경아교종 모델의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다. CAR-T 세포는 치료 효과를 입증하기 위해 마이크로 주사기를 사용하여 측심실에 주입되었습니다. 이 방법을 사용하면 순환하는 신경아교종 세포를 표적으로 하는 CAR-T 세포를 뇌로 직접 전달할 수 있습니다. 주사 절차는 GL261 세포를 마우스 측뇌실에 이식한 후 11일째에 수행되었습니다. 다양한 시점(15일, 20일, 25일, 30일)에서 생 체 내 생물발광 이미징 및 유세포 분석을 사용하여 종양 반응을 모니터링하여 CSF에서 GFP+ 종양 세포를 검출함으로써 CAR-T 세포의 성공적인 투여를 확인했습니다.

실험 타임라인은 그림 2A...

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토론

측심실 주사를 사용하여 본 연구에서 확립된 순환 신경아교종 모델은 상당한 발전을 제공하여 기존 모델에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 측심실 주사 기술은 재현성이 높아 비교적 짧은 시간 내에 일관된 종양 모델링이 가능합니다. 이는 CSF로의 종양 세포 전파를 조사하고 CAR-T 세포와 같은 치료법의 효과를 평가하려는 연구자에게 귀중한 도구입니다. 혈액-뇌 장벽을 통과하는 데 어려움을 겪는 기존의 정맥 CAR-T 주입과 달리 뇌실내 주사는 CAR-T 세포를 종양 주변에 정확하게 전달할 수 있습니다10,18. 뉴잉글랜드 의학 저널(The New England Journal of Medicine)에 발표된 2024년 연구에 따르면 재발성 GBM 환자 3명이 새로운 CAR-T 요법 후 1-5일 이내에 상당한 종양 퇴행을 경험했으며 한 환자의 종양은 거의 ...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국가자연과학재단(82230059), 중국 장쑤성 핵심 연구 개발 프로그램(BE2022770)의 자금 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
흡수성 수술용 봉합사상하이 푸동 Jinhuan 의료 제품 Co., 주식 회사R611
카-T크리에이티브 바이오랩스
D-루시페린 칼륨염MCE하이-12591B
GL261-뤽-GFP상하이 Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co., Ltd.ZQ0932
생체 내 생물발광 이미징 시스템타논타논 ABL X6
실험용 동물 면도기비요타임 바이오테크놀로지FS600 시리즈
마우스난징 의과대학 동물 핵심 시설
미세 주입 펌프RWDR462
마이크로 주사기해밀턴87943
미니 두개골 드릴RWD78001
펜토바르비탈 나트륨 화학Src57-33-0
정위 장치RWD68043
자일라진화학Src7361-61-7

참고문헌

  1. Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C., Weller, M. Current state of immunotherapy for glioblastoma. Nat Rev Clin Oncol. 15 (7), 422-442 (2018).
  2. Weller, M., et al. Glioma. Nat Rev Dis Primers. 10 (1), 33(2024).
  3. Van Den Bent, M. J., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 402 (10412), 1564-1579 (2023).
  4. Capper, D., et al. Eano guideline on rational molecular testing of gliomas, glioneuronal, and neuronal tumors in adults for targeted therapy selection. Neuro Oncol. 25 (5), 813-826 (2023).
  5. Nicholson, J. G., Fine, H. A. Diffuse glioma heterogeneity and its therapeutic implications. Cancer Discov. 11 (3), 575-590 (2021).
  6. Schaff, L. R., Mellinghoff, I. K. Glioblastoma and other primary brain malignancies in adults: A review. JAMA. 329 (7), 574-587 (2023).
  7. Wang, A. P. A review of glioblastoma and other primary brain malignancies. JAMA. 330 (2), 188-189 (2023).
  8. Steeg, P. S. The blood-tumour barrier in cancer biology and therapy. Nat Rev Clin Oncol. 18 (11), 696-714 (2021).
  9. Sun, S., et al. Targeting golph3l improves glioblastoma radiotherapy by regulating Sting-NLRP3-mediated tumor immune microenvironment reprogramming. Sci Transl Med. 17 (788), eado0020(2025).
  10. Bagley, S. J., et al. Intrathecal bivalent CAR-T cells targeting EGFR and IL-13Rα2 in recurrent glioblastoma: Phase 1 trial interim results. Nat Med. 30 (5), 1320-1329 (2024).
  11. Nikanjam, M., Kato, S., Kurzrock, R. Liquid biopsy: Current technology and clinical applications. J Hematol Oncol. 15 (1), 131(2022).
  12. Akhoundi, M., Mohammadi, M., Sahraei, S. S., Sheykhhasan, M., Fayazi, N. CAR T cell therapy as a promising approach in cancer immunotherapy: Challenges and opportunities. Cellular Oncol. 44 (3), 495-523 (2021).
  13. Das, A. K., et al. T-cell therapy: A potential treatment strategy for pediatric midline gliomas. Acta Neurol Belgica. 124 (4), 1251-1261 (2024).
  14. Lin, H. L., Cheng, J. L., Mu, W., Zhou, J. F., Zhu, L. Advances in universal CAR-T cell therapy. Front Immunol. 12, 744823(2021).
  15. Lin, Y. J., Mashouf, L. A., Lim, M. CAR-T cell therapy in primary brain tumors: Current investigations and the future. Front Immunol. 13, 817296(2022).
  16. Zhu, Y. X., Feng, J. G., Wan, R. X., Huang, W. H. CAR T cell therapy: Remedies of current challenges in design, injection, infiltration and working. Drug Design Develop Ther. 17, 1783-1792 (2023).
  17. Aswendt, M., Adamczak, J., Couillard-Despres, S., Hoehn, M. Boosting bioluminescence neuroimaging: An optimized protocol for brain studies. Plos One. 8 (2), e55662(2013).
  18. Vaughn-Beaucaire, P., Choi, M. J., Liang, O. L., Lawler, S. E. Intracranial CAR-T cell delivery in glioblastoma patients. Trends Cancer. 10 (6), 478-480 (2024).
  19. Choi, B. D., et al. Intraventricular carv3-team-e T cells in recurrent glioblastoma. New England J Med. 390 (14), 1290-1298 (2024).

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