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방법 논문

시험관 내 쥐 대식세포에 의한 동종 및 이종 적혈구의 식균작용에 대한 정량적 평가

775 조회수

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DOI:

10.3791/68904

⸱

2025년 8월 22일

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1Institute of Regenerative Medicine, and Department of Dermatology, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Jiangsu University, 2Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences, 3Guangdong Provincial Key Laboratory of Large Animal Models for Biomedicine, and South China Institute of Large Animal Models for Biomedicine, School of Pharmacy and Food Engineering, Wuyi University, 4State Key Laboratory of Cell Biology, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, 5Innovation and Transformation Center, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, 6Prometheus RegMed Tech Ltd, 7Department of Medicinal and Life Sciences, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Tokyo University of Science

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 연구는 분리된 쥐 대식세포에 의한 이종(인간) 및 동종(쥐) 적혈구의 식균 작용 속도를 정량화하고 비교하기 위한 표준화된 시험관 내 프로토콜을 설명합니다.

초록

이종 세포 이식은 면역결핍 동물 모델에서도 심각한 면역 거부반응에 직면하는 경우가 많습니다. 잔류 면역 성분 중 대식세포는 이식된 인간 세포를 능동적으로 식균할 수 있어 장기 생착에 어려움을 초래합니다. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 인간 대 쥐 적혈구(RBC)의 대식세포 매개 식균 작용을 정량화하기 위한 표준화된 시험관 내 분석을 개발했습니다. 쥐 복막 대식세포를 분리, 배양 및 인간 또는 쥐 적혈구에 노출시켰습니다. 인간 적혈구는 CD235a를 사용하여 확인되었고, 쥐 적혈구는 DeepRed로 사전 표지되었습니다. 유세포 분석 CD163을 사용하여 대식세포와 게이트 살아있는 세포에 대한 프로피듐 요오드(PI) 배제를 확인했습니다. 결과는 식세포 활성에 상당한 차이가 있음을 보여주었습니다: 대식세포의 5.08%가 인간 적혈구를 삼킨 반면, 쥐 적혈구는 1.59%만이 식균을 처리하여 상대 식균 지수가 3.21이었습니다. 이 프로토콜은 면역 적합성의 정량적 평가를 허용하고 이종 이식에서 선천성 면역 반응을 평가하는 재현 가능한 방법을 제공합니다. 이는 기증자-수혜자 선택을 개선하고 중개 연구에서 면역억제 전략을 안내할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

서론

이종 세포 이식의 사용, 특히 인간 세포를 동물 모델에 생착시키는 것은 생물 의학 연구에서 필수적인 전략입니다1. 이를 통해 통제된 생체 내 환경에서 세포 생존, 생착 및 면역 반응을 평가할 수 있습니다. 마우스 모델은 잘 특성화된 유전학과 조작 용이성으로 인해 역사적으로 이 분야를 지배해 왔지만, 크기가 작기 때문에 많은 혈액량이나 높은 세포 수율이 필요한 연구에서는 상당한 한계가 있습니다. 대조적으로, 쥐는 더 큰 체질량, 인간 시스템에 대한 생리학적 관련성 향상, 혈액 또는 복막 대식세포와 같은 생물학적 샘플의 더 높은 수율 등 여러 가지 이점을 제공합니다2. 결과적으로, 쥐 모델은 조혈 및 면역 체계 연구와 관련된 연구에서 점점 더 많이 사용되고 있습니다3.

이종 이식의 주요 과제 중 하나는 면역 거부입니다. T 세포, B 세포 또는 NK 세포가 유전적으로 절제된 면역결핍 모델에서도 잔류 선천성 면역 세포, 특히 대식세포는 기능적으로 활성을 유지합니다4. 대식세포는 숙주 면역 체계의 1차 수호자 역할을 하며 식균 작용을 통해 외부 세포를 인식하고 제거합니다5. 이 과정은 대식세포의 신호 조절 단백질 알파(SIRPα)와 대부분의 세포 유형에서 발현되는 "나를 먹지 마세요" 신호인 CD47 사이의 상호 작용에 의해 부분적으로 조절됩니다. 인간 세포의 CD47이 설치류 SIRPα에 의해 인식되지 않으면 이러한 불일치가 식균 작용이 향상될 수 있습니다. 이러한 허용 면역결핍 동물에게도 이러한 현상이 존재합니다 6,7.

이러한 맥락에서 대식세포 매개 식균작용을 정량화하는 것은 세포 생존 가능성을 평가하고 이식 전략을 최적화하는 데 중요합니다8. 면역 거부반응을 평가하기 위해 다양한 생체 내 및 생체 외 방법이 개발되었지만 대식세포 식균 작용에 대한 표준화된 시험관 내 분석은 여전히 제한적입니다. 기존의 현미경 기반 방법은 노동 집약적이며 정량적 엄격함이 부족한 경우가 많습니다. 대조적으로, 유세포 분석법은 세포 유형을 정확하게 구별하고 표면 마커 검출을 통해 식세포 흡수를 측정할 수 있는 단일 세포 기반 분석 및 정량적 플랫폼을 제공합니다.

이 기사에서는 쥐 복막 대식세포에 의한 인간 및 쥐 적혈구의 차등 식균작용을 평가하기 위해 표준화된 시험관 내 분석을 개발했습니다. 적혈구는 대식세포 매개 클리어런스를 억제하는 "자기" 신호 역할을 하는 CD47의 단순한 구조 및 발현으로 인해 식균작용 분석을 위한 이상적인 모델 역할을 합니다9. 이 프로토콜에서, 쥐 복막 대식세포는 복막 세척을 통해 수확되고, 시험관 내에서 배양되고, 인간 적혈구 또는 DeepRed로 표지된 동종 쥐 적혈구에 노출됩니다. 공동 배양 후, 유세포 분석을 사용하여 대식세포에 의한 적혈구의 내재화를 평가합니다. 대식세포는 CD163 발현에 의해, 인간 적혈구는 CD235a에 의해, 쥐 적혈구는 DeepRed 형광에 의해 식별됩니다. 죽은 세포는 PI 염색 을 통해 제외되어 생존 가능한 대식세포만 분석됩니다.

이 접근법은 시험관 내에서 동종 및 이종 적혈구의 식세포 활성을 정확하고 정량적으로 평가할 수 있게 하여 대식세포 매개 면역 제거 정도에 대한 통찰력을 제공합니다. 우리의 실험에서 쥐 대식세포는 쥐 적혈구(1.59%)에 비해 인간 적혈구의 식균작용(5.08%)이 유의하게 더 높았으며 상대적 식균작용 지수는 3.21이었습니다. 이러한 결과는 이종 환경에서 선천성 면역 메커니즘의 중요성을 강조하고 전임상 모델 검증에서 이 분석의 가치를 강조합니다.

결론적으로, 여기에 제시된 프로토콜은 시험관 내에서 대식세포 식균 작용을 측정하기 위한 재현 가능하고 효율적인 방법을 제공합니다. 이종이식, 조혈모세포 연구, 면역학적 적합성 검사 분야에서 일하는 연구자들에게 특히 유용합니다. 식균작용 정량화를 위한 표준화된 프레임워크를 제공함으로써 이 분석은 종 간 이식 모델에서 실험적 재현성을 향상시키고 선천성 면역 반응에 대한 이해를 높이는 데 기여할 수 있습니다.

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프로토콜

동물을 대상으로 한 모든 실험은 장쑤성 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(UJS-IACUC)에서 승인한 윤리 정책 및 절차에 따라 수행되었습니다(승인 번호. UJS-IACUC-2021090102)에 따라 이 연구는 장쑤성 대학 부속 병원의 임상시험심사위원회의 승인을 받았습니다. 모든 샘플은 정보에 입각한 동의를 제공한 환자로부터 수집되었습니다. 제거된 상청액은 전용 폐액 탱크에 넣고 병원의 감염병과에 인도해야 합니다.

1. 대식세포 분리

  1. 준비: 실험용 쥐, 마취용기, 비커, 마취제로 이소플루란 등 필요한 재료를 준비하고 원심분리기를 4°C로 예냉한다.
  2. 쥐 마취 및 희생: 기관 동물 관리 지침에 따라 과도한 이소플루란 마취를 흡입한 후 쥐를 안락사시킵니다.
  3. 알코올 소독: 희생된 쥐를 비커에 넣고 쥐를 완전히 덮을 수 있도록 충분한 양의 75% 에탄올을 첨가합니다. 10분 동안 담가둡니다.
  4. 복액 주입 및 혼합: 쥐의 복부를 소독하고 주사기를 사용하여 정중선을 따라 복강에 얼음처럼 차가운 멸균 PBS 50mL를 주입합니다.
    1. 쥐를 부드럽게 흔들고 손가락으로 복벽을 마사지하여 복강 내 체액이 완전히 혼합되도록 합니다. 2-3분 동안 마사지합니다.
  5. 복액 채취: 쥐의 복벽을 작게 절개하고 몸을 약간 기울인 후 주사기로 복액을 흡인합니다.
  6. 원심분리: 수집된 유체를 4°C에서 5분 동안 500 x g 으로 원심분리하고 상층액을 버립니다.
  7. 적혈구 용해: 적혈구 용해 완충액의 세포 펠릿 부피의 3-5배를 첨가하고 1-2분 동안 부드럽게 혼합합니다.
    참고: 예를 들어, 세포 펠릿 부피가 1mL인 경우 3-5mL의 용해 완충액을 추가합니다. 이 단계는 실온 또는 4°C에서 수행한 후 400-500 x g 에서 5분 동안 원심분리할 수 있습니다. 4°C에서 원심분리하는 것이 더 효과적입니다. 삼투압으로 인해 적혈구가 용해되고 용액이 빨간색으로 변합니다. 원심분리 후 빨간색 상청액을 제거합니다.
    1. 적혈구(RBC) 용해 완충액 제조법: NH4Cl 8.3g, KHCO3 1.0g, 5% EDTA 1.8mL를 증류된 H2O 800mL에 용해하고, 0.2 μm 필터를 통해 여과멸균하고, 증류된 H2O로 1000mL로 qs를 1000mL로 조절하고, pH 7.2~7.4를 조절한다. 빨간색 침전물이 여전히 보이면 용액이 투명하고 투명해질 때까지 이 단계를 반복합니다. 일반적으로 소량의 잔류 적혈구는 후속 분석에 영향을 미치지 않습니다(펠릿에 적혈구가 거의 없는 경우 이 단계를 생략할 수 있음).
  8. 세포 세척: 약 10mL의 예냉된 RPMI 1640 배지로 세포를 두 번 세척합니다. 매번 4°C에서 5분 동안 500 x g으로 원심분리하고 상층액을 버립니다.
  9. 세포 재현탁 및 계수: RPMI 1640 + 1% FBS + 1% PS로 구성된 예냉된 배지에 세포를 재현탁하고, 트리판 블루 염색을 사용하여 세포를 계수하고, 세포 생존력을 평가합니다.
  10. 세포 배양: 배양이 필요한 경우, 웰당 1mL의 RPMI 1640-10% FBS-1% PS 배지와 함께 24웰 배양 플레이트에 1 × 106/mL의 밀도로 세포를 시딩합니다. 배양 2시간 후, 배지를 교체하고 웰을 RPMI 1640 배지로 1-2회 세척하여 비부착 세포를 제거합니다.
    참고: 부착 세포는 대식세포의 단층을 형성합니다. RNA 추출이 필요한 경우 세포 펠릿에 Trizol 1mL를 첨가하고 세포를 파괴하기 위해 여러 번 피펫팅한 다음 혼합물을 즉시 RNA 추출을 위해 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮기거나 -80°C에서 보관합니다. FACS 분석의 경우 세포 수를 튜브당 1 × 106 으로 조정하고 20 μL의 FACS 완충액을 추가한 다음 FACS 염색을 진행합니다. FACS 완충액: DPBS + 2% FBS, 필터는 0.22μm 필터를 통해 멸균하고 4°C에서 보관합니다.

2. 쥐 또는 인간 적혈구 수집

  1. 준비: 15mL 원심분리기 튜브와 10mL 주사기를 헤파린으로 미리 헹굽니다.
  2. 쥐 심장 혈액 채취: 쥐를 마취하고 희생시킨 후 쥐 꼬리의 작은 부분을 가위로 조심스럽게 자르고 꼬리 정맥에서 혈액을 채취합니다.
  3. 인간 혈액 수집: 정맥 천자 기술을 사용하여 인간 혈액을 수집합니다.
  4. 혈액 샘플 혼합: PBS 1mL와 인간 정맥혈 또는 쥐 혈액 1mL를 혼합합니다.
  5. Ficoll 밀도 구배 분리: 인간 말초 혈액용 1.5mL 원심분리기 튜브에 밀도 1.077의 Ficoll 용액 1.5mL를 추가합니다. 쥐 혈액용 1.084mL 원심분리기 튜브에 밀도 1.084의 Ficoll 용액 1.5mL를 첨가합니다.
  6. 혈액 샘플의 레이어링: 희석된 혈액 샘플을 원심분리기 튜브의 벽을 따라 해당 밀도 구배 용액 위에 천천히 레이어링합니다.
  7. 원심분리: 18-20°C의 온도에서 30분 동안 400 x g 에서 원심분리합니다.
  8. 혈장 및 림프구층 제거: 상부 혈장층, 림프구층, Ficoll 용액층을 제거하고 하단 적혈구층만 남깁니다.
  9. 적혈구 세척: PBS 10mL로 적혈구를 한 번 세척합니다.
  10. 원심분리 및 상층액 제거: 400 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 버립니다.
  11. 세포 재현탁 및 계수: 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 RPMI 1640 배지 1mL를 넣고 적당량의 적혈구 펠릿과 혼합한 후 세포 계수를 수행합니다.

3. 시험관 내 식균작용 분석

  1. 대식세포 분리 및 배양: 대식세포를 분리하고 12웰 배양 플레이트에 1 × 106 세포/웰의 밀도로 시딩합니다. 세포가 부착되도록 5% CO2 와 함께 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
  2. 비부착 세포 제거: 배양 2시간 후, 비부착 세포를 조심스럽게 제거하고 RPMI 1640 배지로 부드럽게 세척합니다.
  3. 지속적인 배양: 배양 플레이트 바닥에 완전히 접착되도록 최대 2시간 동안 부착된 대식세포를 계속 배양합니다.
  4. 기아 치료: 2시간 후, 배지를 무혈청 RPMI 1640으로 교체하고 대식세포 식세포 활성을 향상시키기 위해 기아 조건에서 2시간 동안 배양합니다.
  5. 인간 세포 첨가: DeepRed로 사전 염색된 인간 세포를 배양 플레이트에 추가하고 대식세포가 인간 세포를 식균할 수 있도록 5% CO2 와 함께 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
  6. 결론 및 분석: 식균작용 분석 후 현미경으로 식세포 활성을 관찰하거나 유세포 분석법(FACS)을 사용하여 정량화합니다.

4. 유세포 분석

  1. 세포 준비: 0.05% 트립신-EDTA로 세포를 소화하고 10% FBS를 함유한 RPMI 1640 배지를 사용하여 소화를 중단합니다. 세포를 원심분리하고, 상청액을 버리고, 세포를 FACS 완충액에 재현탁하고, 계수합니다. 두 개의 튜브에 튜브당 1 × 106 세포를 준비합니다. 또한 인간 적혈구 튜브 1개와 쥐 적혈구 튜브 1개를 준비합니다.
  2. 단일 염색 튜브 준비: 하나의 샘플 튜브에 마우스-항-쥐 CD163 항체를, 인간 적혈구관에 마우스 항-인간 CD235a 항체를, 쥐 적혈구관에 DeepRed를 추가합니다.
    1. 이 튜브를 빛으로부터 보호된 얼음 위에서 30분 동안 배양하고 10분마다 혼합합니다. FACS 완충액 1mL를 첨가하여 결합되지 않은 항체를 씻어내고 원심분리한 후 상청액을 버립니다. 세포를 500μL의 FACS 완충액에 재현탁합니다.
  3. 샘플 준비: 마우스-항-쥐 CD163, 마우스-항-인간 CD235a 항체 및 DeepRed를 샘플 튜브에 추가합니다. 빛으로부터 보호된 얼음 위에서 30분 동안 배양하고 10분마다 혼합합니다. 각 샘플 튜브에 1mL의 FACS 완충액을 첨가하여 결합되지 않은 항체를 씻어내고 원심분리한 후 상청액을 제거합니다. 세포를 500μL의 FACS 완충액에 재현탁합니다.
  4. 분석: FSC-H 대 FSC-A에 대한 게이팅으로 세포 접착을 배제합니다. 샘플을 분석하기 전에 단일 염색 튜브를 사용하여 적절한 전압 및 보상 설정을 조정합니다(그림 1). FlowJo v10.8.1 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다.
    참고: CD163-FITC 및 PI 단일 염색 대조군을 사용하여 보상을 설정했습니다.

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결과

유세포 분석을 통해 인간 적혈구 및 쥐 적혈구에 대한 쥐 대식세포의 식균 작용 속도를 추론할 수 있습니다. 죽은 세포는 먼저 PI를 사용하여 제외됩니다. CD235a 양성을 발현하는 CD163 양성 대식세포는 인간 적혈구의 식균작용을 나타냅니다. hRBC를 식균한 대식세포의 비율은 인간 적혈구에 대한 쥐 대식세포의 식균 비율로 정의됩니다. 쥐 적혈구의 식균작용 비율도 유사하게 계산되었습니다. CD235a 및 딥 레드 이중 양성 세포는 쥐와 인간 적혈구 모두를 식균하는 대식세포를 나타냅니다. 이 두 데이터 포인트를 비교함으로써 쥐 대식세포에 의한 인간 적혈구의 식균작용을 평가할 수 있습니다(그림 2).

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토론

이 연구는 이종 및 동종 적혈구 모두의 대식세포 매개 식균 작용을 평가하기 위해 강력하고 재현 가능한 시험관 내 분석을 확립했습니다. 이 연구에서 인간 적혈구는 CD235a-BV421로 표지되었고 쥐 적혈구는 DeepRed 염료로 염색되었습니다. 대식세포가 표지된 적혈구를 식균할 때 접합 항체(CD235a-BV421) 또는 염료(DeepRed)가 함께 내재화됩니다. 결과적으로 대식세포 자체는 해당 형광을 나타냅니다. 이러한 조건에서 식세포 대식세포는 FACS에 의해 이중 양성 집단(예: CD163+CD235a+ 또는 CD163+DeepRed+)으로 쉽게 검출될 수 있어 식세포 활성의 직접적이고 정량적인 평가가 가능합니다. 처음에 우리는 대식세포를 이종 적혈구와 공동 배양하여 식세포 속도를 직접 평가하려고 시도했습니다. 그러나 이 접근 방식은 상당한 배치 간 변동성을 초래하여 ...

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공개 사항

JYG는 Prometheus RegMed Tech Ltd.의 과학 고문입니다. 좌익 저자는 잠재적인 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

초기 기여에 대해 Ms Mei Fang, Ms Min Ma, Ms Yu-Tong Meng 및 Mr. Quan-Kai Lei에게 감사드립니다. 이 연구는 중국 국가자연과학재단(82270697), 중국 광동성 과학기술계획프로젝트(2021B1212040016), 광동성 기초 및 응용 기초 연구 재단(2023A1515012574), 장쑤성 의료 중점 학문 재배 단위(JSDW202229) 및 세포 생태계 혁신 기금 하이허 연구소(HH24KYZX0008), 중국 청년 기업가 정신 및 고용 재단 - Incaier 공공 복지 재단의 일부 자금 지원을 받았습니다 기금(HH25KYHX0003).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.05% 트립신-EDTA서모피셔25300062
딥 레드 셀 트래커서모피셔그리고 nbsp; C34565화약(15 & mu; g)는 DMSO(20 & mu; L)
디메틸 설폭사이드 (DMSO)시그마D2650
둘벡코의 인산염 완충 식염수 (DPBS)서모피셔C10010500BT
피콜-파크 플러스시티바17144002
Ficoll-Paque 프리미엄시티바17544602
마우스 항인간 CD235a BV421 항체BD 생명과학562938
마우스 항쥐 CD163 FITC 항체바이오-래드MCA342F
단백질 K시그마P2308
RPMI 1640서모피셔11875093

참고문헌

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