방법 논문

마우스 동맥 내 지혈을 위한 간단하고 효과적인 절차

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DOI:

10.3791/68907

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2025년 11월 28일

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1College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University, 2Key Laboratory of Livestock Infectious Diseases, Ministry of Education, and Key Laboratory of Ruminant Infectious Disease Prevention and Control (East), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University, 3Manzhouli International Travel Health Care Center, 4Shenyang Baihao Biotechnology Co., Ltd., 5The Affiliated Animal Hospital of Jinzhou Medical University, Collaborative Innovation Center Zoonosis Prevention and Treatment of Jinzhou Medical University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 연구는 쥐 동맥에서 효과적인 지혈 방법을 개발하는 것을 목표로 합니다.

초록

생쥐에서 동맥 천자 또는 캐뼳 시, 바늘 제거 후 지혈이 어려워 동맥의 영구 결찰이 자주 필요합니다. 이로 인해 공급되는 조직 부위에 영구적인 허혈성 손상이 발생합니다. 이러한 국소적 허혈은 종종 2차 합병증을 유발하여 동물 모델에서의 실험 결과를 저해합니다. 본 방법은 수술 후 천자 부위를 봉합하면서 정상적인 혈류를 유지하여 수술 후 허혈을 예방하는 것을 목표로 합니다. 이 방법은 실험 동물 자체에서 지방 조직 조각을 채취하고, 표준 기법으로 동맥 천자를 시행한 후, 지방 패드로 천자 부위를 감싸 혈류를 유지하면서 지혈을 달성하는 방식으로 진행됩니다. 본 연구에서는 쥐를 대상으로 양측 총경동맥 천자를 시행한 후 지방 감싼 기법을 이용한 지혈을 시행하였습니다. 레이저 스펙클 조영 영상(LSCI)에서는 가짜 그룹과 수술 그룹 간 뇌혈류 변화에 차이가 없었으며, 수술 전 및 수술 후 뇌혈류 측정에서도 유의미한 변화가 관찰되지 않았습니다. 수술 후 7일, 14일, 28일에 실시된 조직학적 평가 결과, (1) 뇌 구조 보존(H&E 염색), (2) 퇴행성 변화 없이 신경 형태가 온전함(Nissl 염색), (3) 뇌 절편에서 병리학적 변화가 없음을 확인했습니다. 이 동맥 지혈 기법은 지방 조직의 유연한 특성과 생리학적 응고 메커니즘을 활용합니다. 이 시술은 (1) 자가지방을 천자 부위에 감싸고, (2) 동맥 복귀와 최적의 접촉을 보장하기 위해 봉합사로 고정하며, (3) 배출된 혈액이 지방-동맥 경계부를 통해 응고되도록 하는 것입니다. 이 삼중 작용 기전은 신뢰할 수 있는 지혈을 달성하면서 동맥 내활성을 유지하고 수술 후 허혈성 합병증을 예방합니다. 이 방법은 시술적 간결함, 임상적 효능, 우수한 번역 가능성을 보여줍니다.

서론

동물 모델에서 동맥 손상 생성은 뇌 허혈-재관류 모델, 경동맥(CCA) 또는 대동맥(AO) 동맥경화증 모델, 척수 허혈 모델 등 다양한 병리학적 상태를 모델링하는 데 광범위하게 사용되는 실험적 접근법입니다.

마우스 대뇌 허혈-재관류(MCAO) 모델을 예로 들면, 현재 표준 모델링 접근법 1,2,3은 다음과 같습니다: 외경동맥(ECA)을 분리하고, 원위 말단을 결찰하며, 동맥 클립으로 근위 ECA를 집고 스테이 봉합을 삽입하고, 이 지점들 사이에 구멍을 만들고, CCA를 역행적으로 필라멘트를 삽입합니다. 스테이 봉합사로 혈관과 필라멘트를 고정하고, 천자 부위와 원위 결찰 사이의 ECA를 횡단하며, 동맥 클립을 해제하고, 필라멘트를 내경동맥(ICA)으로 재배치하여 중대뇌동맥을 막고, 필라멘트 제거 시 근위 ECA를 결찰합니다.

이 절차는 재관류를 달성하지만, 공통과 ICA 사이의 혈류만 회복시켜 ECA가 영구적으로 차단됩니다. 이 ECA 절단은 동쪽 안면 부위에 허혈성 손상을 일으켜 의도치 않은 손상을 입혀 수술 절차를 복잡하게 만들 뿐만 아니라 실험 동물에게 혼란스러운 외상을 유발하여 연구 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 더 우려스러운 점은, 일부 실험 프로토콜 4,5에서 연구자들이 직접 CCA 천자를 시행하고, MCAO를 확립하기 위해 봉합사를 삽입한 후 즉시 제거한 뒤, 천자 부위 양 끝에 영구 결찰을 하여 지혈을 한다는 것입니다. 하지만 이 방법은 혈관압을 직접적으로 증가시켜 심장 후부하를 증가시키고 심부전으로 이어질 수 있습니다.

고지방 식단을 이용한 마우스 CCA 또는 AO 내피 손상 모델을 사용해 죽상동맥경화를 확립하는 전통적인 방법론 7,8,9,10은 CCA, 복대동맥(AA), 또는 대퇴동맥(CFA)에 동맥 천자를 시행하고, 풍선 카테터를 삽입하여 내피 탈출을 유도하며, 천자 부위 양 끝을 영구적으로 결찰하여 지혈을 달성하는 방법을 포함합니다. 이 표준 접근법은 몇 가지 중요한 한계를 제시합니다: 필수 결찰은 폐쇄 부위에 국소적인 허혈을 만듭니다. 더 해로운 것은 결합 부위에서 지질 축적이 발생한다는 점입니다. 타협 모델의 타당성은 국소 혈역학에 영향을 미쳐 표적 병변에 대한 약물 전달을 방해하고 약리학적 평가 결과를 왜곡합니다.

마우스 척수 허혈 모델에서는 동맥 천자(CCA, AA, CFA 접근을 통해 )를 사용한 후 풍선 카테터를 삽입하여 목표 부위에 허혈을 유도하는 절차가진행됩니다. 풍선 제거 후에는 양쪽에서 천자 부위를 영구적으로 결찰하여 전통적인 지혈을 달성합니다.

앞서 언급한 세 가지 모델 모두에서 천자 후 혈전은 모두 양측 고정을 통해 이루어집니다. 출혈 조절에는 효과적이지만, 이 방법은 국소 허혈을 유발하여 2차 합병증을 유발하여 궁극적으로 모델 타당성을 저해합니다. 따라서 정혈 시술 중 혈관 개완 유지는 생리학적, 실험적으로 매우 중요합니다. 따라서 이 글은 쥐 실험을 위한 혁신적이고 간단하며 효과적인 동맥 지혈법을 소개합니다. 시술은 먼저 동맥 혈관 클립으로 천자 부위 양 끝을 고정한 후, 3mm× 3mm× 1mm 지방 패드로 동맥을 감싸 천자를 덮는 과정을 포함합니다. 지방 패드는 동맥 주위에 결찰 봉합사로 고정됩니다. 동맥 클립은 점차 풀리고, 출혈에 따라 결찰의 조임 강도를 조절하여 완전한 혈전이 이루어집니다. 이 방법은 혈류를 회복시키고 정상적인 혈역학을 유지하며, 영구 혈관 결찰로 인한 주변 조직의 허혈성 손상을 예방합니다. 특히 마우스 상태의 장기 모델링 후 관찰과 약리학적 개입 평가에 유리하여 전임상 연구의 실험적 엄밀성을 크게 향상시킵니다.

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프로토콜

모든 실험 절차는 실험동물 관리 및 사용 지침(프로토콜 승인 번호)을 엄격히 준수하여 수행되었습니다. SNLL25040501; 동물 사용 허가 번호 SYXK(Liao)2021 - 0010)는 선양농업대학교 기관동물관리 및 이용 위원회(IACUC)에 의해 설립되었습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 실험적 준비

  1. 동물 세부 정보 및 문서화: ARRIVE 지침에 따라 모든 동물 연구 데이터를 문서화하세요(동물 연구: 생체 내 실험 보고). 6-8주 된 수컷 Balb/C 마우스를 사용하며, 무게는 22g ± 4g입니다. 12시간의 빛과 어둠 주기 하에 24± 2°C, 55% ± 5% 상대습도를 유지하세요.
  2. 동물 조리
    1. 기관에서 승인한 프로토콜에 따라 아이소플루란 증기 기화기를 사용해 쥐를 마취합니다. 4% 아이소플루란으로 마취를 유도한 후 2% 아이소플루란으로 유지합니다.
    2. 마취 후에는 경추와 두개골 부위를 제제하고 노출된 피부를 포비돈-요오드로 소독한 뒤, 75% 에탄올로 잔여물을 제거합니다.
    3. 이후 모든 실험 절차를 위해 쥐를 37°C 온열 패드 위에 올려놓으세요.
  3. 쥐의 기초 뇌혈류 측정
    1. 쥐를 엎드린 자세로 배치하세요. 두피 중앙 절개를 해서 두정골을 노출하세요. 두개골 표면에 덮인 근막층을 조심스럽게 해부하고 제거하세요.
    2. LSCI 시스템을 조정하여 노출된 마우스 두정골을 10배 배율로 스캔하고, 기초 대뇌 혈류 데이터를 기록하세요.
  4. 지방 패드와 동맥 천자를 채취하세요
    1. 쥐를 뒤집어 눕히세요. 경추 중앙 절개를 하세요. 나중에 사용할 3mm × 3mm × 1mm 피하 지방 조직 이식을 채취하세요.
    2. 하악하선, 흉골설골근, 흉쇄유돌근을 둔하게 박리합니다. 두 CCA를 모두 폭로하세요.
    3. CCA를 해방시켜 ICA와 ECA를 폭로하라.
    4. 혈관 클램프 1을 CCA의 원위 끝에 적용하고, 혈관 클램프 2를 근위 끝에 부착합니다.
    5. 23G 바늘로 두 클램프 사이의 CCA를 찔러 주세요.
  5. 지방 패드 적용
    1. 바늘을 제거한 후, CCA를 지방 패드의 절단면(비혈청 쪽)으로 감싸세요.
    2. 지방 감싼 부위 아래에 4-0 봉합사를 넣으세요; 그 후 지방 표면에 부드럽게 한 번 묶어 지방 패드와 혈관 벽 사이에 단단한 접촉을 위해 압력을 가합니다; 마지막으로, 혈전을 위한 압력 균형을 위해 결찰을 점진적으로 조정하세요.
    3. 촉촉한 면봉으로 원위 CCA를 올려주세요. 혈관 클램프 1을 해제하고 천천히 면봉을 빼내 천점적인 혈류를 천천히 돌려 천자 부위로 혈액이 흐르도록 하세요.
    4. 혈류 확인; 활성 출혈이 관찰되면 혈관 클램프 1로 원위 CCA를 다시 고정합니다.
    5. 1분간 기다린 후 천천히 혈관 클램프 1을 풀어주세요; 출혈이 발생하면 지방 패드의 위치를 바꾸거나 결사의 단일 투척 부위를 약간 조여 압력을 높입니다; 이 조정을 완전한 혈전이 달성될 때까지 계속합니다.
    6. 촉촉한 면봉으로 근위 CCA를 올려주세요. 혈관 클램프 2를 해제하고 점차 면봉을 빼내어 혈류가 천자 부위로 조절될 수 있도록 합니다.
    7. 출혈이 발생하면 혈관 클램프 2로 원위 CCA를 다시 고정하세요.
    8. 봉합사의 단일 송출부를 약간 조여 압력을 높여; 1분간 기다린 후 근위 CCA를 올리고 혈관 클램프 2를 해제합니다; 천천히 젖은 면봉을 천천히 구멍 자국 쪽으로 굴렸다.
    9. 출혈이 계속되면 완전한 지혈에 도달할 때까지 앞서 두 단계의 단계를 반복하세요.
    10. 봉합사에 추가 한 번 더 던져 초기 매듭 위에 이중 매듭을 만들어 지방 패드를 혈관 벽에 더 잘 고정시키고, 혈관 내 및 외부 압력의 균형을 통해 지혈을 달성합니다.
    11. 지방 패드 양쪽의 총경동맥이 채워져 있고 혈관 직경이 일정한지 확인; 이를 성공적인 혈류 회복과 지혈으로 간주하세요.
    12. 반대쪽 총경동맥에 동일한 절차를 반복하여 천자 지혈을 시행합니다.
    13. 가짜 마우스에서 양측 총경동맥을 동맥 천자나 지방 패드 붕대 없이 노출시키고, 다른 모든 시술은 수술군과 동일하게 유지합니다.
    14. 경추 수술 절개 부위에 봉합하고 소독제를 발라.
  6. 수술 후 뇌혈류 평가 수행
    1. 마우스에서 양측 CCA 천자 혈전이 완료된 후, 노출된 두정골을 촬영하고 10배 확대된 이미지를 획득하도록 LSCI 시스템을 조정합니다; 그 다음 뇌 혈류 변화를 기록하세요.
    2. 두피 절개 부위를 봉합하고 소독제를 바른 뒤, 쥐들이 37°C 온열 패드에서 회복할 수 있도록 한 뒤 다시 우리로 돌려보내 계속 치료를 받게 하세요.
  7. 수술 후 모니터링 및 조직 채취 수행
    1. 수술 후 기간 동안 생쥐의 생존 상태, 운동 활동, 경부하악 부위의 출혈 징후를 매일 모니터링하고 기록하세요.
    2. 수술 후 7일, 14일, 28일째에는 이산화탄소로 쥐를 안락사시키고(기관에서 승인한 프로토콜에 따라), 뇌 조직을 4% 파라포름알데히드로 고정합니다.

2. 병리 검사

  1. 24시간 고정 후 뇌 조직을 에탄올 구배로 탈수시키고, 자일렌으로 투명하게 만든 후 파라핀에 박아 절절 절단을 진행합니다.
  2. 해마 절편에 H&E 염색을 시행하고 현미경으로 뇌 조직 형태를 검사합니다.
  3. 해마 절편에 니슬 염색을 시행하고 현미경으로 신경 구조를 관찰합니다.

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결과

수술 전후 레이저 스펙클 대비 영상 데이터와 상대적 관류 측정 분석 결과, 가짜 및 수술 그룹 모두에서 유의미한 변화가 없었으며, 이 동맥 지혈 기법이 뇌혈류를 방해하지 않고 총경동맥 천자 부위를 성공적으로 봉인했음을 입증했습니다(그림 1).

수술군 쥐들은 수술 후 28일간 지속적으로 관찰되었으며, 사망은 관찰되지 않았습니다. 이들의 운동 활동은 가짜 그룹이나 자신의 수술 전 기준 수치와 비교해 차이가 없었으며, 경추나 하악부 부위에서는 출혈이 발견되지 않았습니다. 이 결과는 이 방법이 동맥 지혈에 효과적임을 확인시켜 줍니다.

가짜 및 수술 그룹 모두에서 나온 뇌 조직 H&E 염색은 피질, 해마, 시상에서 조직 구조가 보존된 명확한 조직학적 구조를 보여주었으며, 유의미한 병리학적 변화는 보이지 않았다. 뉴런은 세포 밀...

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토론

MCAO 모델에서는 ECA를 더 잘 보존함으로써 ECA 결찰 및 절개와 관련된 안면 허혈 손상을 예방하여 임상 병리를 더 잘 재현합니다. CCA 천공 을 통한 필라멘트 삽입의 기존 접근법은 기술적으로 간단하지만, 천자 부위의 양측 결찰이 필요해 윌리스 서클 측부 순환에 의존하는 뇌관류가 발생하는데, 이는 진정한 뇌졸중 병태생리를 최적으로 나타내지 못합니다. 본 연구에서 제시된 지방 패드 지혈 기법은 봉합사 제거 시 혈관 수리와 혈류 회복을 동시에 가능하게 하여, 허혈성 합병증 없이 뇌와 얼굴의 동시 관류를 보장합니다. 이 방법은 보상적 순환 기전 없이 즉각적인 수술 후 재관류를 가능하게 합니다. 따라서 최적화된 MCAO 모델은 인간 뇌졸중 기전을 보다 정확하게 모방하고, 임상적으로 관련 있는 데이터를 생성하며, 연결 유발 허혈성 동반질환 없는 장기 생존 연구를 지원합니다.

혈관 내피 손상이나 풍선에 의한...

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감사의 글

이 연구는 관세 총행정 과학 연구 프로젝트(보조금 번호 2005HK006)의 지원을 받아 "중국 북부 국경 지역에서 매개체-매개 감염병에 대한 다중화 병원체 검출 기술의 연구 개발 및 적용"이라는 프로젝트로 진행되었습니다. 또한 이 연구는 중국 국가 핵심 연구개발 프로그램(보조금 번호 2022YFC2302700)과 과학기술부 국제 과학기술 협력 프로그램(보조금 번호)의 지원도 받았습니다. KY201901014). 이 동맥 지혈법의 성공적인 개발은 전문가의 지도를 제공한 페리 교수(The Perry Manual of Mouse Experiments의 편집장)와 RWD 라이프 사이언스 주식회사(선전)의 레이저 스펙클 대비 영상 시스템을 제공한 데 깊은 감사를 드립니다. 멘토인 한샤오후 교수님과 선양바이오하오바이오텍유한회사에 진심으로 감사드립니다. 이 연구를 가능하게 해주신 모든 기여자분들께도 진심 어린 감사를 전합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4-0 실 바늘 사용상하이 푸둥 진환 의료용품 주식회사
발브/C 마우스베이징 화푸캉 생명공학 유한회사(유한회사)6-8w, 남성
DHG 시리즈 가열 및 건조 오븐상하이 이헨 테크놀로지 유한회사DHG-9123A
헤마톡실린과 이오신(H& E) 고화질 스테인 키트서비스바이오G1076-500ML
이소플루란선전 루이워드 생명 기술 유한회사R510-22
레이저 스펙클 분석기선전 루이워드 생명 기술 유한회사RFLSI ZW
니슬 염료 용액서비스바이오G1036-100ML
조직 임베딩 머신라이카히스토코어 아카디아 H
슬라이드 스캔 영상 시스템선전성창 기술 유한회사SQS-40R
소동물 마취기선전 루이워드 생명 기술 유한회사R500
조직 탈수기라이카히스토코어 펄
초순수 시스템열학50132370
초박형 반자동 미세토름라이카히스토코어 멀티컷

참고문헌

  1. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  2. Yang, X. Y., Wang, K. K., Liu, D. N. Relationship between cerebral ischemia-reperfusion injury and mitochondrial autophagy in mice. Chin J Comp Med. 33 (2), 48-55 (2023).
  3. Wang, Y., Wang, T., Zhao, L., Li, L. The effect of local cerebral ischemia-reperfusion injury on TMEM166 gene and neuronal autophagy in mice. Chin J Comp Med. 28 (7), 28-32 (2018).
  4. Xue, J., Sun, F., Liu, T. The effect of mononucleoside on Wnt7a and APC expression in focal cerebral ischemia-reperfusion rats. Chin J Comp Med. 9, 9-13 (2014).
  5. Hu, Z., Zhao, J., Song, W., et al. Protective effect of ginkgo biloba extract on the brain in a cerebral ischemia-reperfusion injury rat model. Chin J Comp Med. 32 (9), 55-61 (2022).
  6. Chen, Z., et al. Cardiac damage after permanent focal cerebral ischemia in mice. CNS Neurosci Ther. 20 (11), 989-997 (2014).
  7. Wang, C., Ma, X. Experimental study on establishing atherosclerotic animal models using high-fat diet combined with arterial intimal mechanical injury. J Pract Tradit Chin Intern Med. 26 (6), 31-33 (2012).
  8. Zhang, C., Li, L., Qi, W., Zhao, Y., Zhang, H. Intervention effect of puerarin on restenosis after carotid artery balloon injury in rats based on Wnt signaling pathway analysis. J Integr Tradit Chin West Med Cardiovasc Cerebrovasc Dis. 21 (4), 662-665 (2023).
  9. Cai, B., Xie, M. Effect of Xiaoyu Tablet on the stability of atherosclerotic plaque in rabbit abdominal aorta. J Chin Med Pharm. 5, 855-857 (2006).
  10. Liu, Z. Study on the mechanism of detoxification and blood circulation formula promoting vascular re-endothelialization after balloon injury of rat thoracic aorta. , Jiangxi Univ Tradit Chin Med. (2023).
  11. Chen, H., et al. N-methyl-D-aspartate receptor-mediated spinal cord ischemia-reperfusion injury and its protective mechanism. Folia Neuropathol. 60 (3), 308-315 (2022).
  12. Comba, F. G., Smith, J. A., Jones, R. B. The mechanical properties of human adipose tissues and their relationships to the structure and composition of the extracellular matrix. Am J Physiol Cell Physiol. 325 (5), C1226-C1240 (2023).

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