축삭 손상 모델 구성 및 다중 오믹스 분석 가능을 위한 미세유체 칩

뉴런은 발달 중 편극화를 통해 특수한 기능인 축삭과 수상돌기를 가진 두 가지 유형의 돌출부를 설정합니다 ^1,2. 신경재생은 신경손상 3 후 축소 재성장 과정을 말^{하며, 중}추신경계(CNS) 복구에 중점을 둔 연구가 중심입니다. 말초 신경계와 달리 CNS는 재생 능력이 제한되어 있으며^4,5,6, 척수 손상 또는 외상성 뇌 손상 환자에게 지속적인 기능 장애 또는 영구적인 장애를 초래하는 경우가 많습니다 ^7,8. 따라서 CNS 복구를 강화하기 위한 전략을 개발하고 축삭 재생의 기본 메커니즘을 밝히는 것이 중요합니다.

통합되고 비용 효율적이며 처리량이 높은 시험관 내 배양 시스템으로 기능하는 미세유체 장치는 최근 몇 년 동안 세포 및 뉴런 연구에서 놀라운 이점을 보여주었습니다 ^9,10. 기존 방법과 비교하여 미세유체 기술은 유체 전단 응력, 농도 구배 및 공간 구조를 정밀하게 조절할 수 있으므로 실제 생리학적 및 병리학적 미세 환경을 밀접하게 시뮬레이션하여 세포 성장, 이동, 분화 및 상호 작용을 촉진합니다 11,12,13,14. 미세유체공학 기반 시험관 내 축삭 손상 모델은 공간 분극을 통해 신경 세포체 및 과정의 구획화된 배양을 가능하게 하여 뉴런의 내재적 재생 능력과 손상 후 대사 적응을 탐구하는 데 없어서는 안 될 도구를 제공합니다^{15,1 6,17,18}. 이는 뉴런이 손상에 어떻게 반응하고, 대사 과정을 조절하고¹⁹, 축삭 재생을 촉진하는지에 대한 중요한 창을 제공합니다²⁰. 그러나 축삭 손상 및 대사 연구를 위한 기존 미세유체 플랫폼은 낮은 신경 세포 수율, 대사 측정의 정확도 감소, 표준화된 운영 절차 부족 등의 과제에 여전히 직면해 있습니다.

이러한 한계에 대응하여 이 연구는 축삭 손상의 표준화된 고처리량 유도를 가능하게 하고 구획화된 다중 오믹스 분석을 위한 충분한 세포 물질을 제공하는 새로운 대규모 미세유체 플랫폼을 개발했습니다. 이 통합 설계는 신경 손상 연구에서 충족되지 않은 중요한 요구에 직접적으로 직면합니다. 특히, 우리가 설계한 미세유체 칩은 미세 홈으로 연결된 체세포 챔버와 축삭 챔버의 교대 배열을 특징으로 하며, 제어된 진공 흡인을 통해 축삭 절단이 달성됩니다. 이 접근법은 축삭 재생의 기본 대사 메커니즘 조사와 같이 재현 가능한 고처리량 축삭 손상 모델과 정확한 대사 프로파일링이 필요한 연구에 이상적입니다. 기존 방법에 비해 이 기술은 더 높은 처리량, 더 높은 대사 정밀도 및 표준화된 손상 모델을 설정하는 기능을 제공합니다. 예를 들어, 이전 연구에서는 축삭 재생에서 미토콘드리아 수송의 중요성이 입증되었으며^20,21,22,23, ^우리 플랫폼은 손상 후 축삭 재생에서 포도당 대사의 역할을 추가로 밝혔습니다. 이 프로토콜은 시각적으로 검증 가능하고 운영적으로 표준화된 대규모 축삭 절개 및 대사 분석을 위한 기술 시스템을 구축합니다.

모든 실험은 베이항대학교 윤리위원회의 지침에 따라 진행되었으며 위원회의 승인을 받았습니다(승인 코드: BM20210060). 그림 1 은 실험 타임라인을 간략하게 보여줍니다.

1. 기존 및 대규모 미세유체 장치의 설계

1. AutoCAD를 사용하여 미세유체 장치를 설계하여 2차원(2D) 회로도 및 3차원(3D) 구조 모형을 작성합니다.
2. 이러한 설계를 사용하여 SU-8 네거티브 포토리소그래피를 사용하여 실리콘 웨이퍼에 마스터 몰드를 제작합니다.
3. 폴리디메틸실록산(PDMS)을 주조하여 마스터 몰드를 복제하여 고정밀의 기능성 미세유체 칩을 만듭니다.
4. 각 마이크로채널을 높이가 5μm로 설계하여 체세포를 차단하면서 축삭만 통과할 수 있도록 합니다.
5. 축삭 용량을 늘리기 위해 마이크로채널을 10μm 너비로 만듭니다.
6. 챔버를 높이 120μm, 너비 220μm로 설계하여 신경 체세포를 위한 충분한 공간을 제공합니다.
7. 이 미세유체 플랫폼을 사용하여 유체 흐름과 뉴런 배치를 제어하여 생체 내 축삭 손상을 시뮬레이션합니다.
8. 고정밀 세포 조작을 위해 장치를 사용하여 대사체 및 전사체 샘플을 준비하고 고처리량 처리를 가능하게 하여 샘플 정확도와 생물학적 타당성을 개선합니다.

2. 기존 및 대규모 미세유체 장치 제작

1. PDMS 베이스와 경화제를 10:1(w/w) 비율로 계량하고 원심분리기 튜브에 넣습니다.
2. PDMS 혼합물이 들어 있는 원심분리기 튜브를 원심 교반기 믹서에 넣습니다. 2000 × g 에서 4분 동안 원심분리하여 혼합한 다음 다시 2000 × g 에서 4분 동안 원심분리하여 가스를 제거합니다.
3. 탈기된 PDMS 13-15g을 미세유체 금형에 부어 금형 바닥이 완전히 덮이도록 합니다.
4. 금형을 진공 건조기에 놓습니다. 진공 펌프를 사용하여 5-10분 동안 공기를 배출하여 PDMS에서 기포를 완전히 제거합니다.
5. 고무 전구를 사용하여 PDMS 표면을 가볍게 두드려 남아 있는 표면 기포를 부수십시오.
6. 금형을 컨벡션 오븐에 넣고 80°C에서 100분 동안 구워 PDMS를 경화시킵니다.
7. PDMS가 완전히 경화되면 메스 끝을 PDMS 가장자리 아래로 부드럽게 밀어 조심스럽게 들어 올려 금형에서 분리합니다.
8. 직경 2.0-2.5mm의 생검 펀치를 사용하여 배양 배지 주입 및 세포 로딩을 위해 PDMS에 구멍을 만듭니다.
9. 접착 테이프를 사용하여 PDMS에서 표면 불순물을 제거한 다음 깨끗한 유리 접시에 넣고 알루미늄 호일로 싸서 보관합니다.
10. (선택 사항) PDMS 표면을 산소 플라즈마(30W, 20초)로 처리한 다음 비가역적 결합을 위해 다른 표면에 대고 누릅니다.
11. 실험 전에 미세유체 장치를 121°C 및 101kPa에서 5분 동안 오토클레이브하여 멸균을 보장합니다.

3. 피질 뉴런의 준비

1. 출생 후 Sprague-Dawley(SD) 쥐 3마리(출생 후 12시간 이내)를 얼음 위에 5분 동안 놓아 마취시킨 다음 빠르게 참수합니다.
2. 대뇌 피질의 운동 영역을 해부하고 조직을 예식된 해부 완충액(예: 칼슘 및 마그네슘이 없는 HBSS 2mL)에 넣습니다.
   참고: 미리 냉각된 용액을 사용하여 얼음 위에서 모든 조직 해부 절차를 수행합니다.
3. 멸균 가위를 사용하여 조직을 약^{1mm 3} 조각으로 다진 다음 15mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
4. 5분 동안 그대로 둔 다음 상청액을 조심스럽게 흡인하여 잔류 혈액과 완충액을 제거합니다.
5. 37°C로 가열된 칼슘과 마그네슘이 포함된 HBSS 5mL에 예열된 파파인 용액(1mg/mL)을 첨가합니다.
6. 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 40분 동안 배양하고 튜브를 10분마다 3회 부드럽게 뒤집습니다.
7. 분해 후 200μL 피펫을 사용하여 현탁액을 100회 부드럽게 분쇄합니다.
   알림: 세포 스트레스를 방지하기 위해 기포가 유입되지 않도록 하십시오.
8. 300× g 에서 3분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
9. 1 mg/mL 프로테아제 억제제(예: 칼슘 및 마그네슘이 포함된 5mL의 HBSS에 600 μL의 파파인 해리 시스템 키트 억제제 바이알)를 포함하는 종단 용액을 첨가하여 세포를 재현탁시킵니다.
10. 40μm 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 여과하고 여과액을 새 원심분리기 튜브에 수집합니다.
11. 여과액을 200× g 에서 10분 동안 원심분리하고 상청액을 버립니다.
12. 2% B27 및 1% GlutaMAX를 함유한 500μL의 완전 신경 배양 배지에 펠릿을 재현탁합니다.
13. 세포(약 300만 개/쥐)를 계산하고 나중에 사용을 위해 밀도를 1 × 10⁶ 세포/mL로 조정합니다.

4. 코팅

참고: 커버슬립 또는 배양 접시를 폴리-D-라이신(PDL) 용액으로 처리하여 뉴런 접착력을 개선하고 뉴런 성장을 위한 최적의 환경을 조성합니다.

1. 커버슬립 코팅
   1. 35mm 배양 접시에 기존 미세유체 장치(Φ25mm, 두께 0.17mm)용 커버슬립을 넣고 0.1mg/mL PDL 용액 2mL를 첨가합니다.
   2. 37°C에서 6시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다.
   3. 배양 후 재사용 또는 적절한 폐기를 위해 PDL 용액을 조심스럽게 회수하십시오.
   4. 접시에 멸균 초순수 2mL를 넣고 시계 방향으로 50회 돌린 다음 시계 반대 방향으로 50회 돌립니다(여러 접시의 경우 더 큰 접시에서 동시에 회전).
   5. 멸균 피펫 팁에 연결된 진공 펌프를 사용하여 물을 흡입하고 액체 폐기물 용기에 폐기물을 수집합니다.
   6. 세탁 절차(4.1.4-4.1.5단계)를 총 세 번 반복합니다.
   7. 사용하기 전에 커버슬립을 생물 안전 캐비닛에서 자연 건조시키십시오.
2. 배양 접시 코팅
   1. 배양 접시 또는 웰 플레이트에 적당량의 0.1 mg/mL PDL 용액을 첨가합니다(예: 기존 미세유체학의 경우 35 mm 접시에 2 mL, 대규모 미세유체학의 경우 10 cm 접시에 5 mL를 첨가).
      알림: 오염을 방지하기 위해 생물 안전 캐비닛이 멸균 공기 흐름으로 제대로 작동하는지 확인하십시오.
   2. 용액이 바닥을 완전히 덮고 37°C에서 6시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다.
   3. PDL 용액을 회수한 후, 4.1.4단계에 설명된 대로 적당량의 멸균 초순수로 배양 접시를 3회 세척한다.
   4. 잔여 초순수를 제거하고 나중에 사용할 수 있도록 층류 후드에서 배양 접시를 자연 건조시킵니다.

5. 신경 배지의 준비

1. 일상적인 뉴런 배양을 위한 완전한 배지를 준비합니다.
   1. 일회용 50mL 주사기에서 플런저를 제거합니다. 고무 헤드가 위를 향하도록 주사기를 생물 안전 캐비닛 내의 깨끗한 벤치에 놓습니다.
   2. 페니실린 스트렙토마이신 500 μL, B27 1 mL, GlutaMAX 125 μL 및 태아 소 혈청(FBS) 500 μL를 주사기에 순서대로 추가합니다. 교차 오염을 방지하기 위해 각 구성 요소의 피펫 팁을 교체하십시오.
      참고: 일관성을 유지하기 위해 지정된 순서로 각 구성 요소를 추가합니다.
   3. 새 멸균 50mL 원심분리기 튜브를 가져갑니다. "Neurobasal-A(NBA) + 2% B27 + 0.25% GlutaMAX + 1% FBS + 1% PS"로 표시하십시오.
      참고: 배아 뉴런이 아닌 경우 NBA를 사용하십시오. 배아 뉴런에 신경기저(NB)를 사용합니다.
   4. 0.22μm 주사기 필터를 주사기 끝에 부착합니다.
      알림: 누출을 방지하기 위해 필터가 주사기에 단단히 연결되어 있는지 확인하십시오.
   5. NBA를 사용하여 첨가제 부피를 포함하여 최대 50mL의 액체로 주사기를 채웁니다. 플런저를 다시 설치하십시오.
   6. 플런저를 약 2mL/s로 천천히 밀어 액체를 라벨이 부착된 원심분리기 튜브로 여과합니다.
   7. 원심분리기 튜브의 캡을 조입니다. 튜브를 3-5회 뒤집어 매체를 혼합합니다.
2. [^U-13C₆]-포도당을 함유하는 완전 배지(대사 플럭스 분석용): 손상된 뉴런의 포도당 대사에 대한 대사 플럭스 분석을 위해 무설탕 NBA를 사용하여 [^U-13C₆]-포도당을 함유한 완전 배지를 준비합니다.
   1. 무포도당 NBA를 기본 용액으로 사용하고 여과 전에 [^U-13C₆]-포도당을 최종 농도 25mM까지 첨가합니다([^U-13C₆]-포도당이 고체인 경우 미리 계산하고 계량합니다). 섹션 5.1에 설명된 대로 다른 구성 요소와 여과 및 혼합 단계를 추가하는 것과 동일한 순서를 따릅니다.

6. 세포 계수

1. 혈구계를 75% 에탄올로 철저히 닦습니다. 계속하기 전에 모든 표면이 완전히 건조되었는지 확인하십시오.
2. 멸균 인산염 완충 식염수(PBS) 완충액 90μL를 1.5mL 멸균 원심분리기 튜브에 첨가합니다.
3. 수집된 신경 세포 현탁액을 위아래로 3-5회 피펫팅하여 부드럽게 재현탁하여 완전히 혼합되도록 합니다.
4. 10μL 피펫을 사용하여 혼합 세포 현탁액 10μL를 90μL의 PBS(1:10 희석)가 들어 있는 원심분리 튜브로 옮깁니다.
5. 200μL 피펫을 사용하여 용액을 10회 부드럽게 혼합하여 기포가 생기지 않도록 합니다.
6. 피펫 팁을 새 10μL 팁으로 교체합니다. 혼합물 10μL를 추출하여 혈구계의 샘플 챔버에 추가합니다.
7. 혈구계를 현미경 스테이지에 놓고 20x 대물렌즈를 사용하여 초점을 맞춥니다. 중앙 4 × 4 그리드를 찾아 표준 혈구계 규칙에 따라 16개 사각형 모두에서 세포를 계산합니다.
8. 16개 정사각형 모두에서 총 셀 수를 기록합니다. (총 개수 × 10) × 10⁴ 세포/mL 공식을 사용하여 세포 농도를 계산합니다.
   알림: 항상 적절한 개인 보호 장비를 갖춘 생물 안전 캐비닛에서 작업하십시오.

7. 기존 또는 대규모 미세유체 장치에서 피질 뉴런의 시험관 내 배양

1. 프로토콜 A(기존 미세유체 장치).
   1. 35mm 배양 접시의 유리 표면이 완전히 건조되었는지 확인합니다.
   2. 멸균 미세 팁 겸자를 사용하여 마이크로 채널이 아래를 향하도록 고압멸균된 미세유체 칩을 유리 표면 중앙에 놓습니다.
   3. 200μL 피펫 팁을 사용하여 칩을 유리 표면에 부드럽게 눌러 완전한 접착을 보장합니다.
   4. 영구 마커를 사용하여 왼쪽 챔버를 점(·)으로 표시하여 소마 구획을 지정합니다.
   5. 10μL 피펫을 사용하여 10μL의 신경 현탁액(1,000만 세포/mL)을 흡인합니다.
   6. 표시된 소마 구획 위의 적재 포트에 서스펜션을 천천히 분배합니다.
   7. 왼쪽 챔버의 하부 저장소로 유체가 제대로 흐르는지 확인합니다.
   8. 배양 접시를 가습된 인큐베이터(37°C, 5% CO₂)에 20분 동안 옮깁니다.
   9. 인큐베이터에서 배양 접시를 꺼냅니다.
   10. 20× 위상차 현미경을 사용하여 마이크로채널을 통해 체세포 구획에서 축삭 구획으로의 배지 관류를 확인합니다.
   11. 150μL의 신경 기저 배지를 축삭 구획(오른쪽 챔버)의 상부 포트에 추가하여 하부 저장소로 중력 구동 흐름을 허용합니다.
   12. 유사하게, 15μL의 완전한 뉴런 배지를 체세포 구획(왼쪽 챔버)의 상부 포트에 추가합니다.
       참고: 이 단계에서 뉴런은 눈에 띄게 부착되어야 하며 대부분의 세포 파편은 하부 웰로 흘러들어갑니다. 배양 중에 배지를 교체하지 마십시오. 5.1.3단계에 설명된 대로 완전한 뉴런 배지를 한 번 추가하여 사용합니다.
   13. 150mm 배양 접시에 초순수 20mL를 부어 습도 챔버를 만듭니다. 35mm 배양 접시를 큰 접시 안에 놓습니다.
   14. 전체 배양 시스템을 인큐베이터로 옮기고 필요한 기간(예: 7일) 동안 유지합니다.
       참고: 생물 안전 캐비닛의 멸균 조건에서 모든 세포 배양 절차를 수행합니다. 적절한 개인 보호 장비(실험실 가운 및 장갑)를 착용하십시오. 절차 전후에 작업 표면의 오염을 제거합니다.
2. 프로토콜 B(대규모 미세유체 칩).
   참고: 기존 사양의 표준 프로토콜에 따라 두 가지 수정이 이루어졌습니다.
   1. 장치 배치를 위해 10cm 페트리 접시를 사용하십시오.
   2. 각 방법에는 서로 다른 축삭 손상 프로토콜이 필요하므로 실험적 필요에 따라 전체 채널 또는 간격 채널 시딩을 선택하십시오.
   3. 파종이 완료된 후 뉴런 성장을 유지하기 위해 10cm 페트리 접시에 5mL의 완전 뉴런 배양 배지를 추가합니다.
   4. 150mm 큰 접시에 초순수 20mL를 넣어 습도 챔버를 만듭니다. 그런 다음 큰 접시 안에 10cm 접시를 넣습니다.
   5. 7.1.14단계와 동일합니다.

8. 기존 미세유체 장치에서 시험관 내 축삭 손상 모델 구축

1. 미세유체 장치의 왼쪽을 체세포 구획("·" 표시로 표시됨)으로 표시하고 오른쪽을 축삭 말단 구획으로 표시합니다.
2. 피질 뉴런을 체세포 구획에 시드합니다.
3. 7일(DIV7)까지 시험관 내에서 뉴런을 배양하여 축삭이 마이크로채널을 통해 축삭 말단 구획으로 확장되도록 합니다.
4. DIV7에서 시험 관 내 축삭 손상 모델을 확립하기 위해 축쇄 말단 구획에서 축삭 손상 절차를 수행합니다.
5. 적당량의 NBA 배지를 취하여 나중에 사용할 수 있도록 새 15mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
6. 지정된 기간 동안 미세유체 장치에서 피질 뉴런을 배양합니다. 그런 다음 장치를 깨끗한 벤치로 옮깁니다.
7. 보푸라기가 없는 종이를 사용하여 35mm 배양 접시의 바닥을 건조시킵니다. 200μL 피펫을 사용하여 미세유체 장치의 두 오른쪽 구멍에서 배지를 흡인합니다.
8. 진공 펌프 튜브를 멸균된 필터가 없는 200μL 피펫 팁에 연결하고 진공 펌프를 켜고(흡입 속도 60L/min) 팁을 축삭 단말 챔버의 하단 구멍과 챔버 사이의 연결 지점에 겨냥하여 오래된 매체를 흡인합니다(이 시점에서 음압으로 인해 축삭이 파손됨).
9. 200μL 피펫 팁을 교체하고 150μL의 NBA를 흡입하여 오른쪽 챔버의 하단 구멍을 통해 천천히 추가합니다.
   알림: 액체 흐름이 너무 느리고 기포가 생기면 팁에서 액체를 빠르게 배출하여 챔버를 빠르게 채우십시오.
10. 액체 추가를 위해 두 개의 오른쪽 구멍을 번갈아 사용: 각 NBA 추가 후 즉시 진공 펌프를 사용하여 다른 구멍에서 액체를 흡인하여 축삭을 절단합니다. 이 작업을 4회 반복하고 마지막 흡인 후 신선한 완전 신경 배지로 교체합니다.
11. 세포체 측면 구멍에서 오래된 배지를 흡인하고 약물이 포함된 신선한 완전 뉴런 배지를 추가합니다(필요한 경우).
12. 미세유체 장치를 배양 접시와 함께 150mm 배양 접시에 넣고 지정된 시간(예: 24시간) 동안 배양을 계속합니다.
    참고: 축삭 손상 수술에는 NBA 배지가 필요한데, 뉴런 완전 배지는 절단 효과에 영향을 미치는 기포를 생성하기 때문입니다.

9. 대규모 미세유체 장치 축소 손상

1. 방법 1: 수동 축삭 손상.
   1. 미세유체 장치의 모든 챔버에 뉴런을 시드합니다.
   2. 5% CO₂ 가 포함된 가습 인큐베이터에서 37°C에서 3일 동안 장치를 배양한 다음 전체 미세유체 장치를 제거합니다.
      참고: 마이크로채널로 성장한 축삭의 기계적 응력 또는 찢어짐을 방지하려면 DIV7 대신 DIV3에서 미세유체 장치를 제거하십시오. 이는 실험 설계에 손상되지 않은 대조군이 포함된 경우 특히 중요합니다.
   3. DIV7에서 미세유체 장치가 들어 있는 배양 접시를 인큐베이터에서 제거하고 멸균 단계에 놓습니다.
   4. 20배 배율의 현미경을 준비하고 작업 영역을 75% 에탄올로 멸균합니다.
   5. 10μL 멸균 여과 피펫 팁을 잡고 현미경 안내 하에 원래 마이크로채널의 축삭 번들을 식별합니다.
   6. 피펫 팁을 사용하여 각 축삭 다발을 따라 세로 스크래치를 수행합니다.
   7. 긁은 후 현미경으로 축삭 파손을 실시간으로 관찰합니다.
      참고: 살아있는 뉴런을 다룰 때는 니트릴 장갑을 착용하고 UV 멸균 실험실 환경에서 작업하십시오
2. 방법 2: 진공 보조 축삭 손상.
   1. 대형 미세유체 장치에서 번갈아 가며 피질 뉴런을 시드합니다.
   2. 진공 펌프를 켜고 60L/min으로 설정합니다.
   3. 멸균 피펫 팁을 사용하여 진공 펌프 튜브의 끝을 축삭 챔버 포트에 연결합니다.
   4. 기존의 미세유체 프로토콜을 통해 진공 압력을 가하여 축삭 분리를 완료합니다.
   5. (선택 사항) 손상된 축삭을 구체적으로 수집하려면 축삭 절개술 후 정의된 시점에서 진공 펌프(흡입 속도 60L/min)를 사용하여 세포체 구획의 내용물을 빠르게 흡인하여 세포체를 제거함으로써 마이크로채널 내에 축삭만 남깁니다.

10. 기존 또는 대규모 미세유체 장치의 저산소 처리

1. 미세유체 장치에서 1차 뉴런을 시드하고 정상 산소 조건(37°C, 5% CO₂)에서 DIV7까지 배양합니다.
2. 미세유체 장치를 저산소증 인큐베이터 챔버에 넣고 1%_O2, 5%_CO2 및 균형_N2로 구성된 가스 혼합물을 공급합니다.
3. 로타미터를 사용하여 가스 유량을 제어하고 25L/min으로 설정합니다.
4. 공기를 대체하기 위해 챔버를 5분 동안 세척합니다.
5. 저산소 챔버의 입구를 고정하는 동안 출구 감압 밸브를 닫습니다.
6. 저산소 챔버의 출구 튜브를 고정하고 마지막으로 가스 실린더 밸브를 단단히 닫습니다.
7. 미세유체 장치를 3°C의 저산소 챔버에서 1시간 동안 배양합니다.

11. 오믹스 분석을 위한 대규모 미세유체 장치를 사용하여 시험관 내에서 배양된 뉴런의 샘플 준비

1. 전사체학용 샘플.
   1. 축삭 손상이 완료된 후 6시간 후에 손상된 축삭이 있는 미세유체 장치를 층류 후드로 옮깁니다.
   2. 오래된 배지를 폐기한 후 멸균 PBS로 신경 세포를 2-3회 세척합니다.
   3. 표준 RNA 추출 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 RNA를 분리하고 정제하십시오.
   4. RNA 시퀀싱을 수행합니다. 획득한 시퀀싱 데이터에 대한 후속 생물정보학 분석을 수행합니다.
2. 대사 플럭스 분석용 샘플.
   참고: 대규모 미세유체 장치를 사용하여 손상 후 뉴런의 포도당 대사 플럭스의 변화를 모니터링하기 위해 [^U-13C₆]-포도당 추적 대사 플럭스 분석을 사용했습니다²⁴. LC-MS 분석을 위한 샘플을 준비하는 프로토콜은 다음과 같습니다.
   1. 실험에 P0 SD 쥐 새끼를 사용하십시오. 피질 뉴런을 해부하고 시험관 내에서 단기(DIV5-DIV7) 또는 장기(DIV15-DIV30)로 배양합니다.
   2. 젊은(DIV5-DIV7) 및 성숙한(DIV15-DIV30) 뉴런 모두에 대해 손상 그룹과 손상되지 않은 대조군을 설정합니다.
   3. 배지를 25mM[^U-13C₆]-포도당(포도당이 없는 Neurobasal-A, 1% FBS, 2% B27, 25mM[^U-13C₆]-포도당)을 함유한 배지로 교체하고 37°C에서 4시간 동안 배양합니다.
      참고: 배지 교환 중 삼투압 또는 pH 변화로 인한 뉴런 스트레스 및 세포사멸을 피하기 위해, 파종 시 25mM[^U-13C₆]-포도당을 함유한 배지에서 배양된 추가 뉴런을 준비하고 이 배지를 교환에 사용합니다.
   4. 예열된 HBSS(칼슘 및 마그네슘 함유) 5mL로 부드럽게 두 번 헹구고 샘플을 액체 질소에 급속 동결하고 -80°C에서 보관합니다.
      알림: 액체 질소를 다룰 때는 니트릴 장갑과 실험실 가운을 착용하십시오.

12. 종래 및 대규모 미세유체 장치에 기반한 신경 면역형광 염색

참고: 미세유체 장치를 사용하여 시험관 내에서 뉴런을 배양할 때, 살아있는 세포 고정을 위해 이러한 장치를 분해하는 동안 발생할 수 있는 마이크로채널 내의 뉴런 축삭에 대한 잠재적 손상을 고려해야 합니다.

1. 미세 폐기물 진공 펌프를 사용하여 미세유체 장치의 4개 웰에서 배양 배지를 제거합니다.
   참고: 면역형광 염색 과정 내내 액체를 두 개의 챔버에 보관하십시오. 흡입 매개변수는 신경 세포체와 축삭의 손상 또는 흡인을 방지하기 위해 너무 높지 않아야 합니다(2.5L/min이 최적임).
2. 미세유체 장치의 두 상부 웰 각각에 100μL의 1x PBS를 추가합니다(PBS는 자연스럽게 하부 웰로 흐릅니다).
3. 진공 펌프 끝에 있는 필터리스 팁을 교체하고 아래쪽 웰에서 PBS를 흡인한 다음 이 과정을 세 번 반복합니다. 최종 반복에서 4개의 웰에서 모든 PBS를 흡인합니다.
4. 150μL의 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액을 두 개의 상부 웰 각각에 첨가하고 실온에서 10-15분 동안 고정합니다.
   참고: 뉴런 구조적 무결성을 유지하기 위해 살아있는 세포 고정 중에 장치 분해를 피하십시오. 이 접근법은 신경 체세포와 축삭의 위치를 보다 명확하게 구별하는 데 도움이 됩니다.
5. 1x PBS로 3회 세척한 다음 5% 염소 혈청, 0.3 M 글리신, 2% 소 혈청 알부민(BSA), PBS 및 0.1%(또는 0.5%) Triton X-100을 포함하는 차단 완충액으로 뉴런을 1시간 동안 배양합니다.
6. 1차 항체(예: βIII-튜불린, 마우스, 1:2000)를 블로킹 완충액에 희석하고, 왼쪽 상단 웰에 100 μL, 오른쪽 상단 웰에 50 μL를 첨가하고, 뉴런과 함께 4°C에서 하룻밤 동안 배양한다.
7. 1차 항체를 흡인한 후, 단계 12.2-12.3에 설명된 대로 1x PBS로 3회 세척한다. 그런 다음 차단 완충액으로 제조된 2차 항체를 단계 12.6에 설명된 대로 미세유체 장치의 상부 웰에 첨가하고 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다(필요한 경우 알루미늄 호일로 덮음).
8. 1x PBS로 3회 세척한 후 초순수로 한 번 헹굽니다. 곡선형 핀셋을 조심스럽게 사용하여 미세유체 설정의 오른쪽 상단에서 장치를 잡고 제거합니다.
9. 배양 접시에 PBS 1mL를 첨가하여 접시에서 큰 커버슬립을 분리합니다.
10. 피펫을 사용하여 15μL의 설치 매체를 끌어와 커버슬립을 위해 지정된 위치의 커버슬립에 떨어뜨립니다.
11. 셀 쪽을 마운팅 매체 위로 부드럽게 내리고 커버슬립을 놓고 여분의 액체를 제거합니다.
12. 마운팅 매체가 실온에서 완전히 건조되도록 합니다.
13. 실온에서 마운팅 매체가 건조되면 회전 디스크 공초점 현미경을 사용하여 이미징을 수행합니다.
14. 20x 공기 대물렌즈를 선택하고 노출 시간을 프레임당 100-200ms로 설정하고, 녹색 형광 단백질(GFP)의 경우 488nm 여기 및/또는 적색 형광 단백질(RFP)의 경우 561nm로 레이저 출력을 최대값의 5-10%로 설정합니다.

13. 기존 미세유체 장치의 살아있는 세포 이미징

1. DIV7까지 미세유체 장치에서 피질 뉴런을 배양합니다.
2. 제조업체의 지침에 따라 살아있는 세포 염료(예: 미토콘드리아 막 전위에 대한 프로브)를 준비합니다.
3. 미리 예열된(37°C) 신경 유지 배지에서 염료를 희석합니다.
4. 미세유체 장치의 체세포 구획에 염료 용액을 로드합니다.
5. 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다.
6. 칼슘과 마그네슘을 함유한 예열된(37°C) HBSS 3mL로 구획을 부드럽게 세척합니다.
7. 페놀 레드가 없는 살아있는 세포 이미징 용액을 미세유체 칩에 추가합니다.
8. (선택 사항) 장시간 이미징을 위해 GlutaMAX(0.25%) 및 B27(2%)을 포함합니다.
9. 미세유체 칩을 현미경 스테이지에 놓고 왼쪽에 체세포 챔버를, 오른쪽에 축삭 말단 챔버를 놓습니다.
10. 대물 렌즈에 침지 오일 한 방울을 추가하여 오일이 칩 아래의 커버슬립과 접촉하도록 합니다.
11. 이미징을 위해 150ms 노출과 10-15% 최대 레이저 출력으로 40x 대물렌즈를 사용하십시오.
    참고: 염료 광안정성에 따라 이러한 매개변수를 조정하십시오.

14. 데이터 분석

1. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 현미경 이미지를 분석합니다. 바이오분석기로 RNA 품질을 평가합니다. 적절한 플랫폼을 사용하여 RNA-seq를 수행하고 분석합니다.
2. 대사체 연구의 경우 MRMPROBS 프로그램(버전 2.60)을 사용하여 원시 질량 분석 데이터를 추출하고 동위원소 세부 정보 및 피크 면적을 포함하여 식별된 대사 산물에 대한 정보를 수집합니다.
3. 모든 통계 분석에 GraphPad Prism(버전 8.4.3)을 사용합니다. SEM± 데이터를 평균으로 제시합니다. 그룹 비교를 위해 짝이 없는 양측 t-테스트 또는 Mann-Whitney 테스트를 사용하고 그룹 내 여러 시점 간의 비교를 위해 양방향 ANOVA를 적용합니다(유의성: ns, 유의하지 않음, *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001).

피질 뉴런의 대사 조절 메커니즘을 연구하기 위한 포괄적인 연구 플랫폼을 구축하기 위해 먼저 기존의 미세유체 장치에서 피질 뉴런을 배양하여 마이크로채널을 따라 축삭 성장을 정밀하게 제어했습니다(그림 2A). 적절한 설계를 통해 마이크로채널은 낮은 높이(5μm)와 더 큰 너비(10μm)로 구성되어 각 채널이 세포체가 들어가는 것을 허용하지 않고 더 많은 축삭을 호스팅할 수 있습니다. βIII-튜불린에 대한 면역형광 염색은 마이크로채널을 통해 축삭 말단 챔버로 축삭 성장을 확인했습니다(그림 2B). 축삭 손상이 신경 생존에 영향을 미치는지 여부를 추가로 확인하기 위해 축삭 손상 전후의 신경 밀도를 정량적으로 분석했습니다. 그 결과 축삭 손상 후 신경 밀도에 유의미한 차이가 없었으며, 이는 축삭 손상이 현저한 신경 사멸로 이어지지 않았음을 나타냅니다(그림 2C). 다중 오믹스 분석을 위한 샘플 크기 요구 사항(일반적으로 샘플당 약 3 × 106 세포)을 충족하기 위해 확장 가능한 레이아웃과 3차원 구조를 갖춘 대규모 미세유체 장치를 개발하여 정확한 실험 데이터를 보장했습니다(그림 3A-C). PDMS 복제 금형의 천공되지 않은 버전과 천공된 버전 모두 PC 보드 또는 10cm 배양 접시에 잘 접착됩니다(그림 3D,E).

대규모 미세유체 장치에서 축삭 손상을 확인하기 위해 두 가지 손상 방법이 사용되었습니다. 기존의 축소 절개술(그림 4A,B)의 경우 축삭은 진공 펌프를 사용하여 손상되었습니다. 스크래치 손상(그림 4C,D)의 경우 DIV3에서 미세유체 몰드를 제거하고 DIV7에서 피펫 팁으로 축삭을 수동으로 긁었습니다. βIII-튜불린 면역형광 염색을 사용하여 손상 전후의 축삭 형태를 시각화했습니다. 손상 전에 손상된 축삭이 축삭 말단 챔버에서 관찰되었습니다(그림 4A,C). 손상 직후, 형태가 파괴된 절단된 축삭 그루터기가 나타나(그림 4B,D), 성공적인 축삭 손상을 확인하고 후속 재생 분석을 가능하게 했습니다. 수동 스크래치 분석 전후의 현미경 관찰은 손상되지 않은 뉴런의 축삭이 손상되지 않은 상태로 남아 있는 반면, 손상 후 6시간 및 24시간에 다양한 정도의 축삭 재생이 관찰된 것으로 나타났습니다(그림 5). 기존 배양 사양의 규모가 작기 때문에(칩당 약 1 × 105) 단백질 농도를 감지하기 어렵습니다. 반면 대규모 미세유체 뉴런 배양(칩당 약 300만 개)에서는 단백질 농도가 더 높아 단백질 분석이 더욱 실현 가능하고 정확합니다. 도 6은 축삭 손상 후 6시간 및 24시간의 대조군에서 신경 단백질의 농도가 각각 1420.4230, 1748.9397 및 1823.7007 μg/mL임을 보여줍니다.

축삭 손상 반응의 분자 메커니즘을 밝히기 위해 칩당 300만 개의 세포를 가진 뉴런 배양을 위한 대형 미세유체 장치를 사용했습니다. 배양 5일(DIV5) 후 축삭 손상을 유도하고 손상 후 6시간 동안 세포를 용해하여 총 RNA를 추출했습니다. 테스트 결과, 대조군과 실험군의 총 RNA 양은 각각 5.28μg과 5.27μg으로 RNA-시퀀싱(RNA-seq)에 대한 품질 요구 사항을 충족했습니다(그림 7A). 그 후, RNA-seq 분석을 통해 595개의 손상 특이적 유전자와 609개의 손상되지 않은 뉴런 특이적 유전자가 확인되었습니다(그림 7B). KEGG 분석은 또한 축삭 손상 후 TCA 주기, 미토파지, 활성 산소종, 산화적 인산화 및 콜레스테롤 대사의 상당한 상향 조절을 나타냈습니다(그림 7C). 이러한 결과는 젊은 뉴런이 손상으로 인한 스트레스에 대처하기 위해 에너지 대사와 세포내 환경을 능동적으로 조절하고 있음을 시사합니다. 추가 대사 플럭스 분석은 [U-13C6]포도당 표지 후 TCA 주기 중간체 구연산염 및 푸마르산염의 수준이 전사체에서 TCA 주기 경로의 활성화 추세와 일치하여 축삭 손상 후 신경 에너지 대사 재프로그래밍의 가설을 뒷받침하는 것으로 나타났습니다(그림 8).

요약하면, 이러한 결과는 피질 뉴런 배양, 손상 및 재생을 연구하는 데 있어 미세유체 장치의 유용성을 입증하여 다중 오믹스 분석을 위한 재현 가능한 플랫폼을 제공합니다.

그림 1: 실험 절차의 워크플로 다이어그램. 먼저 PDMS를 사용하여 미세유체 장치를 제작합니다. 다음으로, 시험관 내에서 1차 뉴런을 배양하고 미세유체 장치에 시드합니다. 추가 배양을 위해 장치를 CO2 인큐베이터에 넣습니다. 원하는 일수 후에 진공 펌프를 사용하여 축삭 손상을 유도하거나 저산소 챔버에서 저산소 치료를 적용합니다. 이미징 또는 샘플 준비는 이러한 치료 후 지정된 시점에 수행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 기존의 미세유체 장치를 사용하여 피질 뉴런을 배양합니다. (A) 신경 배양 중 35mm 접시에 장착된 표준 미세유체 장치. 스케일 바: 1mm. (B) 기존 크기의 미세유체 장치에서 7일 동안 배양된 피질 뉴런의 면역형광 염색. 축삭은 βIII-튜불린(녹색)을 사용하여 녹색으로 표시됩니다. 스케일 바: 50μm. (C) 미세유체 장치에서 체세포 측면 피질 뉴런(DIV7)의 대표 이미지(왼쪽) 및 해당 정량 분석(오른쪽)은 손상되지 않은 상태와 축삭 손상 후 24시간 모두에 대해 표시됩니다. 데이터는 단위 면적당 생존 뉴런의 수를 나타내며 대조군에 의해 정규화됩니다. 스케일 바: 20μm. DAPI(파란색), MAP2(녹색). 데이터는 SEM± 평균으로 표시되었습니다. N = 3; n(-)도끼 = 30, n(+)도끼 = 33. p-값은 양측 짝이 없는 스튜던트 t-테스트를 사용하여 계산되었습니다. 의미: ns, 중요하지 않음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 대규모 미세유체 장치의 설계 도면. (A) 치수가 밀리미터 단위인 초대형 미세유체 칩의 AutoCAD 레이아웃. (B) 초대형 미세유체 칩의 3차원 전체 구조에 대한 개략도. (C) 초대형 미세유체 칩의 평면도, 마이크로채널을 보여주는 확대 보기. (D) 실리콘 웨이퍼 마스터의 PDMS 복제본에서 성형 및 경화된 대규모 미세유체 칩 장치의 이미지는 PC 보드(구멍 없음)에 연결되었습니다. 스케일 바: 5mm. (E) 10cm 접시에 연결된 대규모 미세유체 칩 장치(세포 및 축삭 챔버 포함, 구멍 포함)의 이미지. 스케일 바: 10mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 대규모 미세유체 장치에서 배양된 피질 뉴런(DIV7)의 면역형광 이미지. (A) DIV7에서 βIII-튜불린(녹색)으로 표지된 초대형 미세유체 칩의 뉴런, 마이크로채널 및 축삭 말단 챔버에서 성장하는 축삭을 보여주는 확대된 보기. 스케일 바: 2000 μm(왼쪽), 500 μm(오른쪽). (B) 초대형 미세유체 칩의 뉴런은 DIV7에서 축삭절개술을 받았고 βIII-튜불린(녹색)으로 표지되었습니다. 확대된 보기는 진공에 의해 흡입되는 마이크로 채널의 축삭 절개술 후 축삭 그루터기를 보여줍니다. 스케일 바: 2000μm(왼쪽), 100μm(오른쪽). (C) 대규모 미세유체 장치 내의 완전한 마이크로채널에 시딩된 뉴런의 면역형광 이미지(왼쪽: 파노라마, 스케일 바: 2000μm; 오른쪽: 확대 보기, 스케일 바: 100μm). (D) 현미경으로 수동 긁힘 손상 후 면역형광 이미지(왼쪽: 손상 파노라마, 스케일 바: 2000 μm; 오른쪽: 부상 부위 확대 보기, 스케일 바: 100μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 대규모 미세유체 장치에서 배양된 피질 뉴런(DIV15)의 현미경 이미지. (A) 부상을 입지 않은 그룹; (B) 축삭 손상 후 6시간; (C) 축삭 손상 후 24시간. 스케일 바: 100μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 대규모 미세유체 장치 내에서 손상된 뉴런(DIV21)의 단백질 농도. (A) BCA(Bicinchoninic Acid) 방법을 사용하여 단백질 농도를 결정하기 위한 표준 곡선. 0-2000 μg/mL BSA 표준물질(562 nm 검출)을 사용하여 표준 곡선을 설정했습니다. 선형 회귀 방정식은 y = 0.0004637x + 0.002350(R2 = 0.9916)입니다. (B) 대조군 및 축삭 손상 후 6시간 및 24시간에 대규모 미세유체 장치에서 수집된 총 신경 단백질 수율의 정량적 분석. 데이터는 SEM± 평균으로 표시되었습니다. N = 3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 대규모 미세유체 장치에서 축삭 손상 후 피질 뉴런(DIV5)의 RNA-seq 분석. (A) 대규모 미세유체 장치 내에서 배양된 피질 뉴런에서 축삭 손상 후 6시간 후에 추출된 총 RNA. 데이터는 SEM± 평균으로 표시되었습니다. N = 3. (B) 축삭 손상 전과 후 6시간 유전자 발현 수준의 벤 다이어그램은 595개의 유전자가 손상 후 특이적인 반면 609개의 유전자는 손상되지 않은 그룹에 특이적임을 보여줍니다. (C) 축삭 손상 그룹(DIV5_Ax)에서 상향 조절된 유전자에 대한 KEGG 경로 농축 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 

그림 8: [U-13C6]-포도당으로 추적된 대규모 미세유체학에서 배양된 손상된 뉴런의 대사 플럭스 분석. 피질 뉴런을 대규모 미세유체 장치에서 배양하였고, 손상되지 않은 그룹과 손상된 그룹(손상 후 20시간)을 [U-13C6]-포도당을 함유한 배지에서 4시간 동안 연속 배양한 후 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)을 통해 뉴런(DIV5)에서 구연산염(A)과 숙시네이트(B)의 동위원소 분포를 검출했습니다. 모든 데이터는 SEM± 평균으로 표시되었습니다. N = 6, n[(-)Ax] = 7, n[(+)Ax24h] = 6; p-값은 양방향 ANOVA를 사용하여 계산되었습니다. 의미: ****p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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