이 프로토콜은 축삭 손상 후 신경 대사 역학을 모델링하는 미세유체 시스템을 설명하여 내재 대사 리모델링의 이미징, 다중 오믹스 분석 및 기계론적 연구를 가능하게 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
뉴런은 분극되어 수상돌기와 축삭을 형성하여 세포간 통신을 가능하게 합니다. 축삭 손상은 이러한 연결을 방해하고 손상 신호를 체막에 전달하여 종종 신경 변성을 유발합니다. 따라서 축삭 항상성을 유지하는 것은 국소 축삭 재생을 촉진하고 신경변성을 예방하는 데 필수적입니다. 이 과정은 세포 대사에 의존하여 에너지와 생합성 전구체를 공급하며 대사 균형을 조절하고 부산물을 제거하는 메커니즘에 의해 유지됩니다. 그러나 신경 대사는 체세포와 축삭 사이에서 구획화되며 성상세포 유래 대사 활동(예: 성상세포-뉴런 젖산 셔틀)과 같은 주변 미세 환경에 의해 생체 내에서 추가로 영향을 받습니다. 이러한 요인은 뉴런의 고유한 대사 메커니즘에 대한 조사를 복잡하게 만듭니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 여기에서 우리는 생리학적 해당작용 플럭스 및 미토콘드리아 호흡을 포함하여 생체 내에서 관찰된 주요 대사 특성을 보존하는 시험관 내에서 일차 피질 뉴런을 배양하기 위한 미세유체 플랫폼을 개발했습니다. 이 시스템은 축삭 손상 후 뉴런의 내재적 대사 리모델링을 조사하기 위한 단순화된 모델을 제공합니다. 기존의 미세유체 칩은 시험관 내 축삭 손상 모델을 지원하며 살아있는 세포 이미징, 면역형광 염색 및 저산소증 치료와 호환됩니다. 수백만 개의 세포를 포함하는 대규모 전사체 및 대사체 분석을 수용하기 위해 최적화된 작동 프로토콜을 갖춘 고처리량 미세유체 칩을 추가로 설계하고 제작했습니다. 이 장치는 마이크로채널로 연결된 교대로 배열된 체세포와 축삭 챔버를 특징으로 하며, 축삭 구획에서 유체의 진공 흡인에 의해 축삭 손상이 유도됩니다. 이 플랫폼을 통해 대사 산물 및 효소 역학을 신속하게 평가하여 다중 오믹스 조사의 정확성과 재현성을 향상시킬 수 있습니다.
서론
뉴런은 발달 중 편극화를 통해 특수한 기능인 축삭과 수상돌기를 가진 두 가지 유형의 돌출부를 설정합니다 1,2. 신경재생은 신경손상 3 후 축소 재성장 과정을 말하며, 중추신경계(CNS) 복구에 중점을 둔 연구가 중심입니다. 말초 신경계와 달리 CNS는 재생 능력이 제한되어 있으며4,5,6, 척수 손상 또는 외상성 뇌 손상 환자에게 지속적인 기능 장애 또는 영구적인 장애를 초래하는 경우가 많습니다 7,8. 따라서 CNS 복구를 강화하기 위한 전략을 개발하고 축삭 재생의 기본 메커니즘을 밝히는 것이 중요합니다.
통합되고 비용 효율적이며 처리량이 높은 시험관 내 배양 시스템으로 기능하는 미세유체 장치는 최근 몇 년 동안 세포 및 뉴런 연구에서 놀라운 이점을....
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프로토콜
모든 실험은 베이항대학교 윤리위원회의 지침에 따라 진행되었으며 위원회의 승인을 받았습니다(승인 코드: BM20210060). 그림 1 은 실험 타임라인을 간략하게 보여줍니다.
1. 기존 및 대규모 미세유체 장치의 설계
- AutoCAD를 사용하여 미세유체 장치를 설계하여 2차원(2D) 회로도 및 3차원(3D) 구조 모형을 작성합니다.
- 이러한 설계를 사용하여 SU-8 네거티브 포토리소그래피를 사용하여 실리콘 웨이퍼에 마스터 몰드를 제작합니다.
- 폴리디메틸실록산(PDMS)을 주조하여 마스터 몰드를 복제하여 고정밀의 기능성 미세유체 칩을 만듭니다.
- 각 마이크로채널을 높이가 5μm로 설계하여 체세포를 차단하면서 축삭만 통과할 수 있도록 합니다.
- 축삭 용량을 늘리기 위해 마이크로채널을 10μm 너비로 만듭니다.
- 챔버를 높이 120μm, 너비 220μm로 설계하여 신경 체세포를 위한 충분한 공간을 제공합니다.
- 이 미세유체 플랫폼을 사용하여 유체 흐름과 뉴런 배치를 제어하여 생체 내 축삭 손상을 시뮬레이션....
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결과
피질 뉴런의 대사 조절 메커니즘을 연구하기 위한 포괄적인 연구 플랫폼을 구축하기 위해 먼저 기존의 미세유체 장치에서 피질 뉴런을 배양하여 마이크로채널을 따라 축삭 성장을 정밀하게 제어했습니다(그림 2A). 적절한 설계를 통해 마이크로채널은 낮은 높이(5μm)와 더 큰 너비(10μm)로 구성되어 각 채널이 세포체가 들어가는 것을 허용하지 않고 더 많은 축삭을 호스팅할 수 있습니다. βIII-튜불린에 대한 면역형광 염색은 마이크로채널을 통해 축삭 말단 챔버로 축삭 성장을 확인했습니다(그림 2B). 축삭 손상이 신경 생존에 영향을 미치는지 여부를 추가로 확인하기 위해 축삭 손상 전후의 신경 밀도를 정량적으로 분석했습니다. 그 결과 축삭 손상 후 신경 밀도에 유의미한 차이가 없었으며, 이는 축삭 손상이 현저한 신경 사멸로 이어지지 않았음을 나타냅니다(
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토론
축삭 손상 및 재생을 연구하기 위한 고급 시험관 내 모델의 확립은 신경 복구와 관련된 분자 및 대사 메커니즘을 밝히는 데 필수적입니다16,19. 이 연구에서 우리는 미세유체 장치, 대규모 신경 배양 및 정확한 축삭 손상 프로토콜을 통합하여 손상된 피질 뉴런의 강력한 다중 오믹스 분석을 가능하게 하는 표준화된 워크플로를 제시합니다.
이 접근 방식의 성공 여부는 몇 가지 중요한 절차 단계에 크게 좌우됩니다. 미세유체 칩 준비에서 PDMS 경화 시간(80°C에서 100-120분) 및 멸균 시간(5-10분)을 정밀하게 제어하여 칩 과경화 및 미끄러짐 또는 누출 문제를 방지하는 데 중요합니다25. 또한 축소 절개술 중 진공 펌프에 대한 정확한 매개변수 설정이 필수적입.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 베이징 자연과학 재단(보조금 번호 L222080, F251031, Z240011, 7192103) 및 중국 국가 자연 과학 재단(보조금 번호 82271513)의 지원을 받았습니다
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재료
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참고문헌
- Namba, T., et al. Pioneering axons regulate neuronal polarization in the developing cerebral cortex. Neuron. 81 (4), 814-829 (2014).
- Donato, A., Kagias, K., Zhang, Y., Hilliard, M. A. Neuronal sub-compartmentalization: a strategy to optimize ne....
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