방법 논문

크론병 유사 회장염 및 섬유증의 SHIP 결핍 마우스 모델에서 치료 개입 평가

DOI:

10.3791/68928

⸱

2025년 10월 14일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Gastroenterology, University of British Columbia and BC Children's Hospital Research Institute

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 크론병(CD) 유사 회장 염증 및 섬유증의 Src 상동성 2 도메인 함유 5'-이노시톨 포스파타제(SHIP) 결핍 마우스 모델을 사용하여 CD에 대한 새로운 치료법을 테스트하는 방법을 보여줍니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

크론병(CD)은 위장관의 모든 부분에 영향을 미칠 수 있는 분절성 경벽 염증을 특징으로 하는 만성 재발성 염증 상태입니다. CD의 특징은 장 장벽 기능 장애이며 장 섬유증은 흔한 합병증입니다. SHIP 결핍(SHIP-/-) 마우스는 자발적으로 장 장벽 기능 장애, 회장 염증 및 섬유성 병리를 발생시켜 CD 유사 회장염의 주요 특징을 요약합니다. SHIP-/- 마우스는 CD에서 항염증 및 항섬유화 요법을 테스트하기 위한 귀중한 모델 역할을 합니다.

여기에서는 덱사메타손을 효과적인 치료법의 예로 사용하여 이 모델에서 치료 개입을 평가하는 방법을 설명합니다. 우리는 FITC-덱스트란으로 측정한 장 투과성의 생체 내 평가, 육안적 병리학적 검사 및 상세한 조직학적 분석을 포함하여 질병 및 치료 반응을 특성화하기 위한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 조직학적 평가에는 염증에 대한 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색, 섬유증에 대한 Masson의 삼색 염색, 잔 세포 증식 및 비대에 대한 Alcian blue/Periodic Acid-Schiff(PAS) 염색이 포함됩니다. 또한 회장 조직의 사이토카인과 염증 마커를 정량화하여 염증 상태를 평가합니다. 함께 이러한 방법은 CD 유사 회장염의 SHIP-/- 마우스 모델에서 치료 효능을 평가하기 위한 포괄적인 프레임워크를 제공합니다. 이 프로토콜은 장 염증, 점막 치유 및 장 섬유증을 연구하는 연구자에게 광범위하게 적용할 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

염증성 장 질환(IBD)의 두 가지 주요 유형은 크론병(CD)과 궤양성 대장염(UC)이며, 둘 다 재발 완화 또는 진행성 과정을 따를 수 있는 만성 위장관(GI) 염증을 특징으로 합니다1. IBD는 역사적으로 서구화된 국가의 질병으로 간주되어 왔지만 남미, 아시아 및 아프리카 전역의 개발도상국에서 발병률이 급격히 증가하고 있습니다2. 동시에 북미, 유럽 및 호주에서 유병률이 계속 증가하고 있으며, 50년에서 1990년 사이에 보고된 발병률과 유병률 모두 거의 2019% 증가하여 IBD의 전 세계 건강 부담이 증가하고 있음을 강조합니다 2,3. 상당한 연구 노력에도 불구하고 IBD의 근본 원인은 아직 알려지지 않았습니다. 현재 증거는 유전적 감수성, 면역 체계 기능 장애 및 마이크로바이옴의 변화를 포함한 환경 유발 요인 사이의 복잡한 상호 작용을 시사합니다 4,5.

CD와 UC 사이에는 중요한 차이점이 있습니다. UC에서 염증은 결장에 국한되며 점막층으로 제한되는 지속적인 침범을 특징으로 합니다 6,7. 대조적으로, CD는 위장관의 모든 부분, 가장 일반적으로 말단 회장 6,7에 영향을 미칠 수 있는 불연속적이고 경벽적인 염증을 특징으로 합니다. CD의 특징적인 합병증은 장 섬유증으로, 이는 협착 및 장 폐쇄의 형성에 기여합니다8. 섬유증은 콜라겐과 같은 세포외 기질 성분의 과도한 침착과 장 근육층의 두꺼워짐으로 정의됩니다 9,10. CD 환자의 약 30%가 진단 후 10년 이내에 협착성 질환이 발생합니다11. 현재 이 합병증을 연구하기 위해 적절한 전임상 모델을 사용하여 해결할 수 있는 충족되지 않은 임상적 요구인 섬유증을 직접 표적으로 하는 치료법은 없습니다 9,12.

IBD의 병인을 더 잘 이해하고 새로운 치료법 개발을 촉진하기 위해 수많은 마우스 모델이 확립되었습니다12. 많은 수의 대장염 모델이 존재하지만 회장 염증 및 CD 관련 섬유증을 요약하는 모델은 소수에 불과합니다12. 이들 중에는 본원에 기재된 Src 상동성 2 도메인-함유 5'-이노시톨 포스파타제 결핍 (SHIP-/-) 및 SAMP1/YitFc 마우스 및 TnfΔARE 마우스가 있다. 이러한 모델은 각각 고유한 세포 및 분자 메커니즘에 의해 구동되기 때문에 인간 CD의 복잡성을 집합적으로 반영합니다. SAMP1/YitFc 마우스의 질병은 상피 장벽 기능 및 면역 조절에 영향을 미치는 다유전자 소인으로 인해 발생하는 반면13,14, TnfΔARE 마우스는 TNF mRNA에서 AU가 풍부한 요소의 결실을 가지고 mRNA 안정성 증가 및 TNF 과잉 생산을 유발합니다15,16. 이러한 모델은 가치가 있지만 한계가 있습니다. SAMP1/YitFc 모델은 육종 효율성이 낮아 연구17을 위한 충분한 코호트 크기를 생성하는 데 어려움을 겪습니다. 또한 TnfΔARE 모델은 주목할만한 섬유성 병리를 개발하는 데 최대 24주가 필요하므로 개입 연구를 수행하는 데 비용이 많이 들고 어렵습니다16.

SHIP은 포스파티딜이노시톨-3-키나아제(PI3K) 신호 전달 경로의 음성 조절자이며 주로 조혈 세포에서 발현됩니다. 이는 포스파티딜이노시톨 3,4,5-트리스포스페이트에서 5' 인산염기를 제거하여 다운스트림 PI3K 신호 전달을 약화시키는 기능을 합니다18. SHIP-/- 마우스는 전임상 연구에 몇 가지 이점을 제공합니다. 이 쥐는 비교적 번식하기 쉽고 빠르면8세 19주에 섬유증의 징후를 보입니다. 이 모델에서 가속화된 섬유성 리모델링은 조절 장애가 있는 PI3K 경로로 인한 염증 반응 증가에 의해 유발될 가능성이 높으며, 이는 면역 세포 과활성화 및 그에 따른 급속한 조직 리모델링으로 이어집니다. 가장 중요한 것은 우리와 Kerr의 그룹이 SHIP-/- 마우스가 인간 CD와 매우 유사한 특징을 가진 회장염이 발생한다는 것을 독립적으로 보여주었다는 것입니다19,20. 이 모델의 관련성을 뒷받침하기 위해 CD가 있는 개인의 하위 집합은 회장 생검과 PBMC 모두에서 SHIP 활성을 감소시켰습니다21. 더욱이, SHIP 활성이 낮은 사람들은 더 심각한 질병 경과를 경험하는 경향이 있으며 종종 여러 번의 수술이 필요합니다22.

SHIP-/- 마우스는 빠르면 생후 4주령에 원위 회장에 국한된 자발적이고 불연속적인 장 염증이 발생하기 시작하며,염증은 20세 6주까지 모든 마우스에 존재합니다. 생후 8주까지 마우스는 외근층의 두꺼워짐과 점막하층과 근육층 사이에 광범위한 콜라겐 축적을 특징으로 하는 섬유성 병리를 확립했습니다19. 이 모델의 염증은 대식세포 유래 인터루킨-1β(IL-1β)21에 의해 유발됩니다. 클로드로네이트 함유 리포좀을 사용한 대식세포의 고갈과 IL-1 수용체 길항제(아나킨라)를 사용한 IL-1 신호의 약리학적 차단은 모두 SHIP-/- 마우스에서 장 염증을 개선했습니다21. 회장염 외에도 SHIP-/- 마우스는 폐 염증을 나타내며, 이를 국소 장 전달을 위해 고안된 치료법의 표적 외 효과를 평가하는 데 사용했습니다23. 다른 사람들은 Z-IETD-FMK를 사용한 카스파제-8 억제가 SHIP-/- 마우스에서 회장 및 폐 염증을 모두 유의하게 감소시킨다고 보고했습니다24, 전신 염증 조절을 평가하기 위한 추가 기능으로서 폐 병리학을 더욱 뒷받침합니다.

이 방법론 논문은 덱사메타손23을 사용한 성공적인 치료에 대해 최근 발표된 연구를 재검토하고 약리학적 테스트에서 마우스 모델을 사용하기 위한 추가 고려 사항과 함께 주요 기술 절차에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 구체적으로, 장 투과성, 육안적 병리학, 조직병리학, 전염증성 매개체 및 이펙터 평가를 포함하여 IBD 모델에서 약물 효능을 평가하기 위한 표준 매개변수를 강조하고 이러한 데이터를 통합하여 전반적인 치료 효능에 대한 결론을 내리는 방법에 대해 논의합니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

동물을 대상으로 한 연구는 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 윤리적 프로토콜과 국가 연구 위원회의 동물 관리 지침에 따라 수행되어야 합니다. 이 프로토콜의 모든 동물 절차는 캐나다 동물 관리 위원회의 윤리적 지침을 따랐으며 브리티시 컬럼비아 대학교 동물 관리 위원회(프로토콜 A21-0212)의 승인을 받았습니다.

참고: SHIP-/- 마우스의 장 병리에 대한 약물의 치료적 영향을 평가하기 위해 SHIP+/+를 비교를 위한 건강한 대조군으로 포함합니다. 치료적 개입을 위해 질병이 모델에서 완전히 확립된 생후 6주에 치료를 시작합니다. 여기서, SHIP+/+ 및 SHIP-/- 마우스 모두 0.5% β-사이클로덱스트린(비히클) 또는 비히클 단독에서 0.5% -사이클로덱스트린(비히클)에 3mg/kg의 덱사메타손을 10μL/g의 부피로 매일 경구 위관하였다.

1. 상피 장벽 투과성을 측정하기 위한 FITC-덱스트란 분석

  1. 분석 전 4시간 동안 마우스를 단속합니다.
  2. 멸균 1x PBS에 4kDa FITC-덱스트란을 최종 농도 80mg/mL로 용해시킵니다.
  3. 마우스당 150 μL에 대해 충분히 준비하고 표준 곡선을 위해 50 μL를 추가로 준비합니다.
    알림: FITC-덱스트란 용액 및 혈장 샘플의 빛 노출을 최소화하십시오.
  4. 각 마우스를 부드럽게 억제(목덜미)하고 경구 강관을 통해 150μL의 FITC-데스트란 용액을 투여합니다.
    참고: 첫 번째 위관을 투여한 직후 타이머를 시작합니다. 안락사와 다운스트림 절차가 시차를 두고 수행될 수 있는 충분한 시간을 허용하기 위해 각 후속 마우스 사이에 10-15분을 기다려 시기 차이로 인한 변동성을 최소화합니다.
  5. 4시간 동안 음식 없이 마우스를 유지합니다.
  6. 표준 기관 절차에 따라 5% 이소플루란(1.5L 산소/분으로 전달되는 흡입 마취제)을 사용한 다음 이산화탄소를 사용하여 마우스를 안락사시킵니다. 25G 바늘과 1mL 주사기로 심장 천자를 통해 혈액을 채취합니다.
  7. 항응고제로 채취한 혈액 100μL마다 산-구연산-포도당 용액 10μL를 즉시 첨가합니다. 반전으로 완전히 섞습니다.
  8. 4°C에서 10분 동안 1500 x g 으로 원심분리하고 혈장(상청액)을 표지된 1.7mL 미세원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 분석할 때까지 샘플을 얼음 위에 보관하고 빛으로부터 보호하십시오.
  9. 각 혈장 샘플을 1x PBS로 1:2 및 1:10으로 희석합니다.
  10. 각 희석액 100μL를 불투명한 96웰 플레이트에 이중으로 첨가합니다.
  11. 1x PBS를 사용하여 원래 80 mg/mL FITC-덱스트란 스톡을 1:2 연속 희석하여 3000, 1500, 750, 375, 187.5, 93.8, 46.9, 23.4 및 0 ng/mL 농도를 달성합니다. 각 농도의 100μL를 96웰 플레이트에 이중으로 추가합니다.
  12. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 485nm 여기 및 535nm 방출에서 형광을 측정합니다.

2. 육안적 병리학 평가

  1. FITC-덱스트란 분석을 위한 채혈 후 소장 전체를 조심스럽게 절제합니다.
  2. 부착된 지방과 결합 조직을 부드럽게 제거합니다.
    알림: 병든 부위는 깨지기 쉽고 찢어지기 쉬우므로 조직을 다룰 때 주의하십시오.
  3. 최적의 대비를 위해 빈 백지 위에 장을 평평하게 놓습니다. 질병의 거시적 징후가 있는지 조직을 육안으로 검사합니다. 염증은 일반적으로 SHIP-/- 마우스에서 소장의 원위 10cm에 국한됩니다.
    참고: 평가할 주요 거시적 특징에는 인접한 정상적으로 보이는 조직에 비해 눈에 띄는 발적 또는 충혈을 보이는 영역이 있는 색상 변화가 포함됩니다. 또한 부드럽게 촉진하면 영향을 받은 부위가 부어오르거나 부종이 있거나 뻣뻣하게 보일 수 있으므로 조직이 두꺼워졌는지 검사하십시오. 눈에 보이는 출혈 반점, 짙은 빨간색 변색 또는 부착된 혈액으로 나타날 수 있는 혈액의 존재를 찾으십시오.
  4. 눈금자를 눈금자 옆에 정렬하여 눈금을 측정하고 사진을 찍어 총체적인 병리학적 소견을 기록합니다.

3. 조직학적 평가

  1. 주사기를 사용하여 1x PBS로 내강을 부드럽게 세척하여 장 내용물을 제거합니다. 융모와 crypt 구조가 왜곡될 수 있으므로 조직에 너무 많은 힘을 가하지 마십시오.
  2. 육안적 병리를 가장 대표하는 원위 회장의 약 1cm를 식별하고 수확합니다. 눈에 보이는 영향을 받는 영역(있는 경우)을 포함합니다. 비교(SHIP+/+ 대 SHIP-/-)를 위해 일치하는 해부학적 위치에서 조직을 수집했는지 확인하십시오.
    참고: 치료 효능의 초기 평가를 위해 회장을 스위스 롤로 준비하는 것이 좋습니다. 이 방법은 질병의 전반적인 시각화를 제공하고 샘플링 편향을 줄입니다.
  3. 조직학 카세트에 조직을 평평하게 놓고 접히지 않도록 스펀지 사이에 놓습니다.
  4. 헤마트실린 & 에오신(H&E) 및 Masson's trichrome 염색의 경우, 조직 부피의 최소 10-20배(카세트당 약 5mL)를 사용하여 4°C에서 밤새 10% 중성 완충 포르말린에 조직을 고정하고 모든 카세트가 완전히 잠기도록 합니다. 보관을 위해 카세트를 70% 에탄올로 옮기고 처리할 때까지 완전히 물에 잠긴 상태로 유지합니다.
    참고: 3.7% 포름알데히드를 함유한 고정제인 10% 포르말린은 강력한 호흡기 자극제이자 피부 감작제이며 인간 발암 물질로 분류됩니다. 흡입, 섭취 또는 피부 접촉은 급성 독성을 유발할 수 있으며, 만성 노출은 암 위험을 증가시킬 수 있습니다. 포르말린과 관련된 모든 절차는 실험실 가운, 내화학성 장갑 및 보안경을 포함한 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용한 상태에서 인증된 화학 흄 후드에서 수행해야 합니다. 기관의 유해 폐기물 프로토콜에 따라 적절한 폐기를 위해 "포르말린 폐기물"이라고 명확하게 표시된 용기에 폐기물을 수거하십시오. 포르말린으로 오염된 모든 물질(예: 피펫 팁, 티슈, 장갑)은 화학적으로 유해한 폐기물로 처리하고 현지 환경 보건 및 안전(EHS) 절차에 따라 폐기해야 합니다.
  5. Alcian blue/PAS 염색의 경우, 카세트당 약 5mL 또는 조직 부피의 10-20배를 사용하여 밤새 4°C에서 Carnoy 용액(60% 에탄올, 30% 클로로포름 및 10% 빙초산)에 조직을 고정합니다. 카세트를 100% 에탄올로 옮겨 처리할 때까지 보관합니다.
    참고: Carnoy의 용액은 60% 에탄올, 30% 클로로포름 및 10% 빙초산으로 구성됩니다. 이 혼합물은 휘발성이 높고 가연성이며 독성이 있습니다. Carnoy의 용액은 흄 후드에서만 취급하고 열원이나 발화원에서 멀리 떨어진 단단히 밀봉된 용기에 보관하십시오. Carnoy의 폐기물은 혼합 유기 용매를 위한 지정된 용기에 수거하고 기관 유해 폐기물 지침에 따라 폐기해야 합니다. Carnoy의 용액으로 오염된 모든 물질은 화학적으로 유해한 폐기물로 처리해야 합니다.
  6. 파라핀에 조직을 매립하고 염색을 위해 5μm 절편을 절단합니다.
  7. 표 1의 기준에 따라 H&E 염색 회장 절편을 16점 척도로 점수를 매깁니다. 최종 조직학적 손상 점수는 실험 조건에 대해 눈이 먼 2명의 검토자의 점수를 평균하여 결정됩니다.
  8. 표 2의 기준에 따라 6점 척도를 사용하여 Masson의 삼색 염색 단면을 평가합니다. 최종 섬유증 점수는 실험 조건에 대해 눈이 먼 두 명의 독립적인 검토자가 할당한 점수의 중앙값으로 계산됩니다.

4. 사이토카인 평가

  1. 조직학 샘플을 해부 및 제거한 후 회장의 원위 10cm의 나머지 부분을 수집합니다.
  2. 티슈를 닦아내고 무게를 기록합니다. 액체 질소에서 급속 냉동하고 향후 처리를 위해 -80°C에서 보관합니다.
  3. 처리할 준비가 되면 조직을 회수하여 항상 얼음 위에 보관하십시오.
  4. 조직 샘플의 무게를 측정합니다. 프로테아제 억제제를 1x PBS(아프로티닌 및 류펩틴, 각각 10μg/mL)에 첨가하여 모든 샘플에 대해 충분한 균질화 완충액을 준비합니다. 조직 mg당 10 μL의 완충액을 사용합니다(예: 100 mg의 조직에는 1 mL의 완충액이 필요함).
    참고: 균질화 완충액은 프로테아제 억제제가 효과적인지 확인하기 위해 균질화 당일에 신선하게 준비해야 합니다.
  5. 벤치탑 균질화기를 사용하여 얼음처럼 차가운 균질화 완충액에서 전층 회장 조직을 균질화합니다. 균질이 균일하고 눈에 보이는 조직 조각이 없는지 확인하십시오. 교차 오염을 방지하기 위해 샘플 사이에 균질화기 팁을 PBS로 철저히 헹굽니다.
  6. 조직 균질체를 10,000 x g 으로 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
  7. 동결-해동 주기를 피하기 위해 정화된 상청액을 분취하고 향후 분석을 위해 -80°C에서 보관합니다.
  8. 제조업체의 지침에 따라 관심 있는 사이토카인을 정량화하기 위해 정화된 상청액에 대해 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)을 수행합니다.
    참고: 450nm에서의 광학 밀도는 보정을 위해 570nm의 기준 파장으로 Skanlt RE 7.0.2 소프트웨어가 있는 Varioskan LUX 마이크로플레이트 리더를 사용하여 측정되었습니다. 데이터 분석에는 Microsoft Excel을 사용하였고, 사이토카인 농도를 결정하기 위해 표준 곡선의 선형 범위 내의 흡광도 값을 보간하였다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

6주령 SHIP+/+ 및 SHIP-/- 마우스를 2주 동안 매일 0.5% β-사이클로덱스트린(비히클 대조군; n = 6/유전자형) 또는 덱사메타손 3mg/kg(n = 6/유전자형)으로 경구 위관 투여했습니다. 치료 시기와 기간은 모델에 따라 다르며 질병 진행의 시작과 속도, 개입이 예방적 또는 치료적인지 여부를 고려해야 합니다. 실험에는 동일한 수의 수컷과 암컷 마우스를 사용해야 합니다. SHIP-/- 마우스의 질병 자연사에서 성별 기반 차이를 확인하지는 않았지만 다른 치료 프로토콜은 성별 특이적 반응을 보일 수 있습니다. 이 모델에서는 염증 및 섬유증의 발병을 예방하기 위해 생후 4-6주부터 예방적 치료를 사용할 수 있는 반면, 생후 6-8주, 8-10주 또는 6-10주부터 수행되는 치료 요법은 확립된 질병에 대한 치료 효능을 평가하는 데 사용될 수 있습니다. 최적의 투여 및 시기는 문헌 및 적정 연구에 따라 결정되어야 합니다. 우리는 이전에 덱사메타손에 대한 이 투여 요법이 회장 염증이 발생한 후에 투여할 때 효과적이라는 것을 보여주었습니다.

수확일에 대한 권장 일정은 그림 1A에 요약되어 있습니다. 덱사메타손은 육안적 검사를 기반으로 SHIP+/+ 마우스에서 어떠한 장 병리도 유도하지 않았습니다. SHIP-/- 마우스는 염증을 나타내는 눈에 띄는 발적 및 두꺼워진 영역을 보였습니다. 이러한 총체적인 병리학적 특징은 덱사메타손으로 치료된 SHIP-/- 마우스에는 없었습니다(그림 1B). 장 장벽 기능을 평가하기 위해 경구 위관 투여 후 FITC-덱스트란의 혈장 농도를 측정했습니다. 통계적으로 유의하지는 않지만 SHIP-/- 마우스는 SHIP+/+ 대조군에 비해 혈장 FITC-덱스트란 농도가 상승하여 장 투과성이 증가했음을 시사합니다. 덱사메타손 치료는 SHIP-/- 마우스에서 FITC-덱스트란 농도를 SHIP+/+ 마우스에서 관찰된 것과 유사한 농도로 감소시켰습니다(그림 1C).

SHIP-/- 마우스의 장 단면에 대한 조직학적 검사는 면역 세포 침윤, 파괴된 융모-암호화 구조, 잔 세포 증식/비대 및 근층의 비중을 포함한 특징적인 병리학적 특징을 나타냈습니다(그림 2A). 이러한 특성은 SHIP+/+ 마우스에 비해 상당히 높은 조직학적 손상 점수에 반영되었습니다(p = 0.0005, 그림 2B). 덱사메타손으로 치료한 SHIP+/+ 마우스에서는 조직학적 손상이 관찰되지 않았습니다. 육안적 병리학 및 장벽 기능에서 나타난 개선과 일치하게, 덱사메타손은 SHIP-/- 마우스의 조직병리학을 감소시켰지만, 그 효과는 통계적으로 유의하지 않았다(p = 0.0981, 그림 2A 및 그림 2B). Masson의 삼색 염색은 SHIP+/+ 대조군에 비해 상당히 높은 섬유증 점수를 동반하여 SHIP-/- 장 조직에서 상당한 콜라겐 침착을 나타냈습니다(그림 2C). 덱사메타손은 SHIP-/- 마우스의 섬유화 특징을 효과적으로 약화시켜 섬유증 점수를 SHIP+/+ 대조군과 비슷한 값으로 낮췄습니다(그림 2C). 또한, 알시안 블루/PAS 염색은 덱사메타손으로 치료했을 때 감소된 SHIP-/- 마우스에서 잔 세포 증식/비대를 확인했습니다(그림 2D).

염증성 사이토카인 농도를 평가하기 위해 전층 회장 조직 균질체에 대해 ELISA를 수행했습니다(그림 3A). IL-1β 농도는 SHIP+/+ 대조군에 비해 SHIP-/- 마우스에서 유의하게 더 높았으며(p = 0.0468), 이는 이 모델에서 IL-1β 발현을 질병 중증도와 연관시키는 이전 연구 결과와 일치합니다. 덱사메타손 치료는 SHIP-/- 마우스에서 IL-1β 농도를 유의하게 감소시켰습니다(p = 0.0023). 이전 보고서와 일치하게 IL-6 또는 TNF 농도는 4개의 실험군에서 차이가 없었습니다. 우리는 또한 염증의 추가 생화학적 마커로서 전층 회장 균질체에서 호중구 관련 단백질 골수과산화효소(MPO) 및 리포칼린-2(LCN-2)의 농도를 측정했습니다(그림 3B). MPO 및 LCN-2 농도는 모두 SHIP+/+ 대조군에 비해 SHIP-/- 마우스에서 유의하게 더 높았지만(각각 p = 0.0031 및 p = 0.0002), LCN-2의 증가는 주로 6마리의 마우스 중 2마리에서 측정된 고농도에 의해 주도되었습니다. 덱사메타손 치료는 MPO를 감소시키고 LCN-2를 약간 감소시켰으며 차이는 유의하지 않았습니다. 이러한 데이터는 MPO가 SHIP-/- 마우스에서 염증의 유용한 마커인 반면 LCN-2 농도는 일관되거나 신뢰할 수 없음을 시사합니다.

SHIP-/- 마우스 모델에서 염증성 특징과 섬유화 특징 사이의 관계를 조사하기 위해 전층 회장 조직의 조직학적 손상 점수, 섬유증 점수 및 IL-1β 농도를 사용하여 Spearman 상관 분석을 수행했습니다(그림 4). IL-1β 농도는 조직학적 손상 점수(r = 0.6813)와 양의 상관관계가 있었으며, 이는 염증 증가가 조직 손상 증가와 관련이 있음을 나타냅니다(그림 4A). IL-1β 농도와 섬유증 점수(r = 0.4117) 사이에도 중간 정도의 상관관계가 관찰되었으며, 이는 염증성 사이토카인 생성과 섬유화 리모델링 사이의 연관성을 시사합니다(그림 4B). 또한, 조직학적 손상 점수는 섬유증 점수(r = 0.6241)와 유의미한 상관관계가 있었으며, 이는 SHIP-/- 마우스에서 구조적 손상과 섬유증이 병렬로 진행됨을 시사합니다(그림 4C).

figure-results-1
그림 1: 덱사메타손은 SHIP-/- 마우스의 육안적 장 병리 및 투과성을 감소시킵니다. SHIP+/+ 및 SHIP-/- 마우스를 6주령에서 8주령까지 비히클 대조군(VC)으로 0.5% β-사이클로덱스트린을 투여하거나 덱사메타손(Dex; 3mg/kg)을 매일 경구 투여했습니다. (A) 권장 실험 일정. (B) 맹장 및 원위 회장의 총체적 형태를 평가하고 대표 이미지를 보여줍니다(그룹당 n = 4-6마리의 마우스). 별표는 육안적 검사에서 관찰된 고르지 못한 발적 및 두꺼워진 영역을 나타냅니다. 이미지는 전반적인 병리학의 대표적인 예로 사용되기 위한 것이며 정량적 분석을 위한 것이 아닙니다. (C) 장 투과성을 평가하기 위해 마우스를 4시간 동안 금식시키고 80mg/mL FITC-덱스트란으로 위관화하였다. 추가로 4시간의 금식 후 심장 천자를 통해 혈액을 채취하고 혈장 FITC-덱스트란 농도를 측정했습니다. 데이터는 평균±SD로 표시됩니다. 회색 막대는 강황25 후 4시간 동안 건강한 C57BL/6 마우스에서 일반적으로 관찰되는 혈장 FITC-덱스트란 농도의 범위를 나타냅니다. 통계적 유의성은 Kruskal-Wallis 테스트에 이어 Dunn의 다중 비교 테스트를 사용하여 결정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 덱사메타손은 SHIP-/- 마우스의 원위 회장에서 조직학적 손상 점수, 콜라겐, 근육 두께, 잔 세포 증식 및 비대를 감소시킵니다. SHIP+/+ 및 SHIP-/- 마우스를 6주령에서 8주령까지 비히클 대조군(VC)으로 0.5% β-사이클로덱스트린을 투여하거나 덱사메타손(Dex; 3mg/kg)을 매일 경구 투여했습니다. (A) 마우스의 H&E 염색 회장 단면을 10배 배율로 촬영했습니다. 스케일 바 = 200 μm. (B) IQR 중앙값을 나타내는 SHIP+/+ 및 SHIP-/- 마우스에 대한 조직학적 손상 점수±. (C) 고정된 회장 단면은 섬유증에 대해 Masson의 삼색으로 염색되었습니다. 콜라겐은 파란색으로 물들었습니다. 이미지는 10배 배율로 촬영되었습니다. 스케일 바 = 200 μm. SHIP+/+ 및 SHIP-/- 마우스에 대한 섬유증 점수는 중앙값 ± IQR로 표현됩니다. (D) 고정된 회장 단면을 알시안 블루/PAS로 염색하였다. 이미지는 10× 배율로 촬영되었습니다. 스케일 바 = 200 μm. 모든 섹션은 그룹당 n = 6마리의 마우스를 대표합니다(SHIP+/+ Dex 및 SHIP-/- Dex, n = 5 제외). 조직학적 손상 점수에 대한 통계적 유의성은 Kruskal-Wallis 테스트에 이어 Dunn의 다중 비교 테스트를 사용하여 결정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: 덱사메타손은 SHIP-/- 마우스의 전층 회장 균질체에서 IL-1β 농도를 감소시킵니다. SHIP+/+ 및 SHIP-/- 마우스를 6주령에서 8주령까지 비히클 대조군(VC)으로 0.5% β-사이클로덱스트린을 투여하거나 덱사메타손(Dex; 3mg/kg)을 매일 경구 투여했습니다. (A) IL-1β, TNF 및 IL-6 농도를 전층 회장 균질체에서 측정하였다. (B) 골수과산화효소(MPO) 및 리포칼린-2(LCN-2) 농도를 전층 회장 조직 균질체에서 측정했습니다. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. 통계 분석은 Kruskal-Wallis 테스트에 이어 Dunn의 다중 비교 테스트를 사용하여 수행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: IL-1β 농도는 SHIP-/- 마우스에서 조직학적 손상 및 섬유증과 양의 상관관계가 있으며 섬유증은 조직학적 손상 점수와 상관관계가 있습니다. SHIP-/- 마우스의 전층 회장 조직에서 조직학적 손상 점수, 섬유증 점수 및 IL-1β 농도 간의 관계를 평가하기 위해 Spearman 상관 분석을 수행했습니다. (A) 조직학적 손상 점수와 IL-1β 농도(r = 0.6813), (B) 섬유증 점수와 IL-1β 농도(r = 0.4117), (C) 조직학적 손상 점수와 섬유증 점수(r = 0.6241). 각 데이터 포인트는 개별 마우스를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

손상 성분점수
크립트 아키텍처의 손실0 = 없음
1 = <25% 손실
2 = 25-50% 손실
3 = 50-75% 손실
4 = >75% 손실
면역 세포 침윤0 = 없음
1 = 고유층의 간헐적인 면역 세포
2 = 고유층의 면역 세포 증가
3 = 고유층의 융합 면역 세포 및 점막 침열
4 = 섹션 전체의 면역 세포 침윤
글램 세포 증식 및 비대0 = 없음
1 = 잔 셀 수 및 크기의 <50% 증가
2 = 잔 셀 수 및 크기의 >50% 증가
궤양0 = 없음
1 = 중간 궤양
2 = 상당한 궤양
부0 = 없음
1 = 섹션의 <50%
2 = 섹션의 >50%
근육 비후0 = 없음
1 = 중간 농축
2 = 상당한 농축

표 1: 조직학적 손상 점수. H&E로 염색된 SHIP+/+ 및 SHIP-/- 마우스의 회장단면의 조직학적 손상은 구조 손실(0-4), 면역 세포 침윤(0-4), 잔 세포 증식 및 비대(0-2), 궤양(0-2), 부종(0-2) 및 근육 비후(0-2).

섬유증 성분점수
과도한 콜라겐0 = 일반 아키텍처; 과도한 콜라겐 없음
1 = 콜라겐의 경미한 증가; 점막하 또는 장막하에 국한됨
2 = 무질서한 다발과 함께 점막하층 및 부분 고유근층으로의 중간 정도의 콜라겐 확장
3 = 점막하층과 근육층(경벽)을 포함하는 정상 구조를 대체하는 광범위하고 조밀한 콜라겐
점막하층의 섬유근 증식/근육화/근육 소멸0 = 없음, 정상 근육 점막하층 함량
1 = 근육 함량의 경미한 증가
2 = 점막하층에 많은 양의 근육이 있어 형태에 영향을 미치지만 정상적인 구조
3= 근육이 전체 점막하 공간을 제거했습니다.

표 2: 섬유증 점수. Masson's trichrome으로 염색된 SHIP+/+ 및 SHIP-/- 마우스의 회장 단면의 섬유증은 과도한 콜라겐 침착(0-3) 및 섬유근 증식 또는 점막하층의 근육 소실(0-3). 콜라겐은 범위 및 구조적 파괴에 대해 평가되는 반면, 근육 변화는 근육 침윤 정도와 점막하 구조의 왜곡에 따라 평가됩니다.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 섬유성 병리를 동반하는 CD 유사 장 염증의 쥐 모델인 SHIP-/- 마우스에서 회장염 및 장 섬유증을 평가하기 위한 절차를 간략하게 설명합니다. SHIP-/- 마우스 모델은 장 염증의 다른 마우스 모델, 특히 회장 국소화, 고르지 못한 및 경벽 염증 및 섬유성 병리에서 흔히 볼 수 없는 CD의 특징을 요약합니다19,26. 번식의 용이성과 질병 발현까지의 짧은 시간과 결합된 SHIP-/- 모델은 CD19의 중개 연구를 위한 강력한 도구로 잘 자리매김하고 있습니다.

이 연구에서 FITC-덱스트란 분석 및 조직학적 점수에 대한 통계적 유의성은 Kruskal-Wallis 테스트를 사용하여 평가되었는데, 이러한 데이터 세트는 일원 분산 분석에 필요한 정규성 가정을 충족하지 못하고 조직학적 점수는 불연속적이고 비모수적 변수를 나타냅니다. 우리의 분석은 덱사메타손 치료군과 비히클 치료 그룹 간에 통계적으로 유의미한 차이를 산출하지 못했지만 명확한 추세를 관찰했습니다. 덱사메타손은 SHIP-/- 마우스의 장 투과성 및 조직병리학을 감소시켰으며, 이러한 효과는 더 큰 표본 크기에서 유의성에 도달했을 수 있습니다.

이 프로토콜을 수행할 때 몇 가지 기술적 문제가 발생할 수 있습니다. 조직 취급과 관련하여 SHIP-/- 회장은 찢어지기 쉽기 때문에 해부 중에 부드러운 조작이 필요합니다. 이는 육안 이미징을 위해 조직을 준비할 때 특히 중요합니다. 조직 고정은 조직학적 분석의 또 다른 중요한 요소입니다. 포르말린 고정 조직은 H&E 및 Masson의 삼색 염색 모두에 적합하지만 Alcian Blue/PAS 염색과 호환되지 않습니다. 대조적으로, Carnoy의 고정 조직은 H&E 및 Alcian Blue/PAS 염색에는 적합하지만 Masson의 삼색에는 적합하지 않습니다. Carnoy의 고정은 강렬하고 확산된 진한 파란색 염색으로 이어져 콜라겐과 근육층 시각화를 모호하게 만듭니다. 사이토카인 분석을 위해서는 사이토카인이 분해에 매우 민감하기 때문에 얼음 위에서 시료를 처리하는 것이 필수적입니다. 처리 직후 정화된 조직 균질을 분취하는 것이 중요합니다. 반복적인 동결-해동 주기는 사이토카인 무결성을 실질적으로 손상시키고 유전자형 및/또는 치료군 간의 잠재적 차이를 약화시킬 수 있습니다. 마지막으로, 정확한 정량화를 보장하기 위해 각 샘플을 여러 번 희석하여 판독값이 분석 표준 곡선의 선형 범위 내에 있는지 확인하고 복잡한 조직 매트릭스의 잠재적 간섭을 최소화하는 것이 좋습니다. 이러한 기술적 고려 사항을 해결하는 것은 재현 가능하고 해석 가능한 결과를 생성하는 데 필수적이지만 SHIP-/- 마우스에 내재된 생물학적 가변성도 신중하게 관리해야 합니다.

SHIP-/- 마우스에는 재현성을 보장하고 교란 변수를 최소화하기 위해 고려해야 하는 몇 가지 중요한 측면이 있습니다. 장내 미생물군집은 쥐 IBD 모델의 질병 발달 및 치료 반응에 지대한 영향을 미칩니다27,28. 우리의 이전 연구는 SHIP-/- 마우스의 장 염증이 미생물군에 의존적이며 항생제로 개선될 수 있음을 보여주었습니다29. 따라서 미생물군집 기반 변동성을 줄이기 위해 쓰레기 대조군을 사용해야 하며 치료 그룹은 케이지 기원에 대해 균형을 이루어야 합니다30. 또한 세심한 성별 매칭이 필수입니다. SHIP-/- 마우스에서 침투율 또는 질병 중증도의 성별 기반 차이는 관찰되지 않았지만 SAMP1/YitFc와 같은 다른 회장염 모델은 암컷에서 더 일찍 발병하고 질병 중증도가 증가했습니다14,31. 성 호르몬은 또한 미생물 구성을 조절할 수 있기 때문에32, 치료 연구에서 잠재적인 교란 요인을 최소화하려면 성별 일치가 중요합니다. 또한, 평가 중인 개별 치료는 수컷 및 암컷 마우스에서 차별적인 효능을 가질 수 있습니다. 현재 연구 결과가 덱사메타손에 대한 질병 또는 치료 반응의 성별 관련 차이를 밝히지 않지만 모든 치료 연구에서 성별 일치를 수행해야 합니다.

위에서 설명한 마이크로바이옴 및 성별 고려 사항 외에도 장 염증이 없는 상태에서 비히클 및 치료제의 효과를 평가하기 위해 치료 연구에 SHIP+/+ 마우스를 포함하는 것이 중요합니다. 이를 통해 약물이나 전달 방법이 건강한 장에서 병리를 유발하거나 기여하지 않도록 하여 치료 효능과 안전성의 해석을 향상시킵니다.

치료 개입의 시기도 필수적이며 생후 4주, 8주 및 12주령19,26에 마우스의 염증과 섬유증 모두에 상당한 차이가 있기 때문에 실험 목표에 따라 수정되어야 합니다. SHIP-/- 마우스는 빠르면 생후 4주에 장 염증이 발생하며, 모든 생쥐는 생후 6주까지 염증을 나타내며, 섬유성 병리의 마커는 이르면 생후 6주에 측정할 수 있으며생후 8주까지 잘 확립됩니다. 따라서 회장 염증을 표적으로 하는 치료는 생후 6주에 시작해야 합니다. 항섬유화 개입은 6주에 예방적으로 시작하거나 8-10주 사이에 치료적으로 시작할 수 있습니다. 그러나 질병의 발병 및 중증도는 미생물 환경에 따라 달라질 수 있으며 이는 시설마다 다릅니다. 조사관은 치료 프로토콜을 구현하기 전에 먼저 콜로니의 질병 동역학을 결정해야 합니다. 또한, SHIP-/- 마우스는 4-5주까지 최대 17%의 체중 감소를 나타낼 수 있으며, 8-10주까지 추가로 5% 감소할 수 있다33. 심각한 체중 감소를 보이는 동물은 질병의 심각한 징후를 반영하고 장 병리와 관련된 치료 결과를 훼손할 수 있으므로 연구에서 제외되어야 합니다.

SHIP-/- 모델에서 질병 진행을 분석할 때 중요한 고려 사항은 적절한 염증 마커를 선택하는 것입니다. SHIP-/- 마우스에 대한 광범위한 경험을 바탕으로 사이토카인 프로파일링은 일반적으로 질병 진행 중에 상향 조절되는 것으로 알려진 IL-1β와 같은 특정 매개체에 초점을 맞춥니다. 그러나 염증 반응의 초기 특성화를 위해 또는 새로운 치료 전략을 평가할 때 다중 사이토카인 분석이 권장됩니다. 이러한 편견 없는 접근 방식은 염증 환경에 대한 광범위한 프로파일링을 가능하게 하고 질병 병인 또는 치료 반응과 관련된 예상치 못한 표적을 밝힐 수 있습니다.

SHIP-/- 마우스 모델은 재현성과 효율성을 허용하는 실용적인 이점을 제공합니다. SHIP-/- 마우스는 외인성 유발 요인 없이 자발적이고 일관된 회장 염증 및 섬유증을 발생시킵니다. 이는 장 염증을 유발할 때 시약 준비 및 비표준화된 투여 프로토콜과 관련된 가변성을 제거합니다. 질병 발병은 빠르며 염증은 생후 4-6주에 명백하고 섬유증은 생후 8주에 나타나 모델이 시간과 비용 효율적입니다. 또한 SHIP-/- 마우스는 번식 및 유지 관리가 쉽고 유전자형 분석이 간단하며 전문적인 번식 전략이 필요하지 않습니다. 이는 콜로니 관리를 단순화하고 기술적 작업량을 줄이며 의도하지 않은 유전적 변이성을 도입할 위험을 낮춥니다 19,21,26. 질병은 FITC-덱스트란 분석, H&E 및 Masson의 삼색 염색, ELISA를 포함하여 대부분의 연구 환경에서 널리 사용 가능한 기술을 사용하여 안정적으로 평가할 수 있습니다. 이러한 결합된 기능은 효율적인 연구 설계를 지원하고, 재정 및 기술적 장벽을 낮추며, 실험실 간의 일관된 데이터 생성을 촉진합니다.

SHIP-/- 모델은 고유한 장점을 제시하지만 이 모델에는 한계도 있습니다. 모든 전임상 모델과 마찬가지로 유전적, 면역 및 환경적 요인의 영향을 받는 인간 IBD의 복잡하고 다인적인 특성을 완전히 복제할 수 없습니다34. DSS 및 TNBS 모델은 단순성과 비용 효율성으로 인해 여전히 널리 인기가 있습니다. 유전자 변형과 결합될 때 이러한 화학 모델은 장벽 기능에 대한 유전자 특이적 기여를 이해하는 효과적인 도구 역할을 할 수 있습니다35. 그러나 이들의 주요 유용성은 급성 상피 손상을 모델링하는 데 있습니다. 그들은 CD를 특징짓는 만성 면역 매개 병리와 직접적인 임상적 관련성이 부족한 화학 작용제에 의해 유발된 상피 손상 메커니즘을 포착하지 못합니다36. 하나의 모델에만 의존하면 치료 가능성에 대한 불완전하거나 오해의 소지가 있는 평가가 발생할 수 있으므로 치료 효능을 보장하기 위해 여러 모델을 사용하는 것이 좋습니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 BC 어린이 병원 연구소의 동물 관리 시설과 캐나다 글리코믹스 네트워크(GlycoNet, A Network of Centre of Excellence) 및 캐나다 보건 연구소(MOP-133607 to LS)를 통한 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회의 자금 지원을 받습니다. KS와 WM은 TRIANGLE(TRaIning a New generation of researchers in Gastroenterology and LivEr program) 박사 장학금을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.7mL 스냅캡 마이크로튜브  디암드SPE155-N
1배 DPBS (염화칼슘, 염화마그네슘 없음)깁코참고 14190-144
25G x figure-materials-1” needles BD참고305122심장 천자를 위해
26G x figure-materials-2” 바늘BD참고 305110장 홍조
아세트산시그마-올드리치A6283조직학
산성 시트레이트 덱스트로스 용액 (38mM 구연산, 107 mM 시트레이트 나트륨, 136 mM 포도당)밀리포어 시그마C3821
동물 먹이 주사기, 비멸균, 재사용, 304SS 타입밀리포어 시그마와 nbsp;CAD7900 가비지<브루/> 스트레이트<브릴/> 사이즈: 24G,<브릴/> Lxdiam. 1인치. x 1.25 mm,
볼
아프로티닌케이맨 케미컬9087-70-1균질화 버퍼
BD 루어-록 주사기, 멸균, 일회용, 5 mLBD참고309646장 홍조
BD OptEIA 마우스 IL-6 ELISA 세트BD 생명과학555240
BD 옵티에어 마우스 TNF ELISA 세트 IIBD 생명과학558534
BD® 루어 슬립팁 주사기 멸균, 일회용, 1mLBD참고309659
생검 폼 패드 정사각형, 30.2 x 25.4 x 2 mm 높이.소포트 사이언티픽참조 M476-1조직학
버퍼 포르말드-프레시 (저향 10% 포르말린)피셔 케미컬SF93-4조직학
투명 평평한 바닥 면역 비멸균 96웰 플레이트써모 사이언티픽439454
에펜도르프 5415R 냉장 원심분리기  마샬 사이언티브EP-5415R
에틸 알코올 무수화물그린필드 글로벌P016EAAN조직학
피셔브랜드 TRU-FLOW 티슈 카세트피셔 사이언티브15-200-403조직학
FITC-덱스트란, 3-5kDa (1g)밀리포어 시그마FD4-1G< > CAS 번호: 60842-46-8
루펩틴밀리포어 시그마103476-89-7균질화 버퍼
마우스 IL-1 베타/IL-1F2 듀오셋 ELISA R& D 시스템즈DY401
멀티스크린 96웰 플레이트, 솔리드 바텀밀리포어 시그마MSSWNFX40하얗고, 멸균되지 않고, 치료도 안 했어요
옴니퓨어 클로로포름밀리포어 시그마3150조직학
폴리트론 PT-MR2100 균질화 장치키네매티카 AG632081
Varioskan Lux 멀티모드 마이크로플레이트 리더써모 사이언티픽VL0L00D0

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khor, B., Gardet, A., Xavier, R. J. Genetics and pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 474 (7351), 307-317 (2011).
  2. Ng, S. C., et al. Worldwide incidence and prevalence of inflammatory bowel disease in the 21st century: a systematic review of population-based studies. Lancet. 390 (10114), 2769-2778 (2017).
  3. Wang, R., Li, Z., Liu, S., Zhang, D. Global, regional and national burden of inflammatory bowel disease in 204 countries and territories from 1990 to 2019: a systematic analysis based on the Global Burden of Disease Study 2019. BMJ Open. 13 (1), e065186(2023).
  4. Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).
  5. Guan, Q. A comprehensive review and update on the pathogenesis of inflammatory bowel disease. J Immunol Res. 2019, 7247238(2019).
  6. Chang, J. T. Pathophysiology of inflammatory bowel diseases. N Engl J Med. 383 (27), 2652-2664 (2020).
  7. Graham, D. B., Xavier, R. J. Pathway paradigms revealed from the genetics of inflammatory bowel disease. Nature. 578 (7796), 527-539 (2020).
  8. Li, J., et al. Pathogenesis of fibrostenosing Crohn's disease. Transl Res. 209, 39-54 (2019).
  9. Rieder, F., Mukherjee, P. K., Massey, W. J., Wang, Y., Fiocchi, C. Fibrosis in IBD: from pathogenesis to therapeutic targets. Gut. 73 (5), 854-866 (2024).
  10. D'Alessio, S., et al. Revisiting fibrosis in inflammatory bowel disease: the gut thickens. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 19 (3), 169-184 (2022).
  11. Louis, E., et al. Behaviour of Crohn's disease according to the Vienna classification: changing pattern over the course of the disease. Gut. 49 (6), 777-782 (2001).
  12. Iliopoulou, L., Kollias, G. Harnessing murine models of Crohn's disease ileitis to advance concepts of pathophysiology and treatment. Mucosal Immunol. 15 (1), 10-26 (2022).
  13. Rivera-Nieves, J., et al. Emergence of perianal fistulizing disease in the SAMP1/YitFc mouse, a spontaneous model of chronic ileitis. Gastroenterology. 124 (4), 972-982 (2003).
  14. Pizarro, T. T., et al. SAMP1/YitFc mouse strain: a spontaneous model of Crohn's disease-like ileitis. Inflamm Bowel Dis. 17 (12), 2566-2584 (2011).
  15. Kontoyiannis, D., Pasparakis, M., Pizarro, T. T., Cominelli, F., Kollias, G. Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies. Immunity. 10 (3), 387-398 (1999).
  16. Steiner, C. A., et al. The TNFΔARE mouse as a model of intestinal fibrosis. Am J Pathol. 193 (8), 1013-1028 (2023).
  17. Li, J., et al. Mouse models of intestinal fibrosis. Methods Mol Biol. 2299, 385-403 (2021).
  18. Pauls, S. D., Marshall, A. J. Regulation of immune cell signaling by SHIP1: a phosphatase, scaffold protein, and potential therapeutic target. Eur J Immunol. 47 (6), 932-945 (2017).
  19. McLarren, K. W., et al. SHIP-deficient mice develop spontaneous intestinal inflammation and arginase-dependent fibrosis. Am J Pathol. 179 (1), 180-188 (2011).
  20. Kerr, W. G., Park, M. Y., Maubert, M., Engelman, R. W. SHIP deficiency causes Crohn's disease-like ileitis. Gut. 60 (2), 177-188 (2011).
  21. Ngoh, E. N., et al. Activity of SHIP, which prevents expression of interleukin 1β, is reduced in patients with Crohn's disease. Gastroenterology. 150 (2), 465-476 (2016).
  22. Fernandes, S., et al. SHIP1 deficiency in inflammatory bowel disease is associated with severe Crohn's disease and peripheral T cell reduction. Front Immunol. 9, 9(2018).
  23. Ma, W. J., et al. Bespoke plant glycoconjugates for gut microbiota-mediated drug targeting. Science. 388 (6706), 1410-1416 (2025).
  24. Park, M. Y., et al. Impaired T-cell survival promotes mucosal inflammatory disease in SHIP1-deficient mice. Mucosal Immunol. 7 (6), 1429-1439 (2014).
  25. Tsai, K., et al. Highly sensitive, flow cytometry-based measurement of intestinal permeability in models of experimental colitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 15 (2), 425-438 (2023).
  26. Lo, Y., Sauve, J. P., Menzies, S. C., Steiner, T. S., Sly, L. M. Phosphatidylinositol 3-kinase p110δ drives intestinal fibrosis in SHIP deficiency. Mucosal Immunol. 12 (5), 1187-1200 (2019).
  27. Sellon, R. K., et al. Resident enteric bacteria are necessary for development of spontaneous colitis and immune system activation in interleukin-10-deficient mice. Infect Immun. 66 (11), 5224-5231 (1998).
  28. Taurog, J. D., et al. The germfree state prevents development of gut and joint inflammatory disease in HLA-B27 transgenic rats. J Exp Med. 180 (6), 2359-2364 (1994).
  29. Dobranowski, P. A., Tang, C., Sauvé, J. P., Menzies, S. C., Sly, L. M. Compositional changes to the ileal microbiome precede the onset of spontaneous ileitis in SHIP-deficient mice. Gut Microbes. 10 (5), 578-598 (2019).
  30. Robertson, S. J., et al. Comparison of co-housing and littermate methods for microbiota standardization in mouse models. Cell Rep. 27 (6), 1910-1919.e2 (2019).
  31. Goodman, W. A., et al. Loss of estrogen-mediated immunoprotection underlies female gender bias in experimental Crohn's-like ileitis. Mucosal Immunol. 7 (5), 1255-1265 (2014).
  32. Org, E., et al. Sex differences and hormonal effects on gut microbiota composition in mice. Gut Microbes. 7 (4), 313-322 (2016).
  33. Helgason, C. D., et al. Targeted disruption of SHIP leads to hemopoietic perturbations, lung pathology, and a shortened life span. Genes Dev. 12 (11), 1610-1620 (1998).
  34. Boyapati, R., Satsangi, J., Ho, G. T. Pathogenesis of Crohn's disease. F1000Prime Rep. 7, 44(2015).
  35. Mizoguchi, E., Low, D., Ezaki, Y., Okada, T. Recent updates on the basic mechanisms and pathogenesis of inflammatory bowel diseases in experimental animal models. Intest Res. 18 (2), 151-167 (2020).
  36. Koboziev, I., Karlsson, F., Zhang, S., Grisham, M. B. Pharmacological intervention studies using mouse models of the inflammatory bowel diseases: translating preclinical data into new drug therapies. Inflamm Bowel Dis. 17 (6), 1229-1245 (2011).
  37. Raftery, A. L., Pattaroni, C., Harris, N. L., Tsantikos, E., Hibbs, M. L. Environmental and inflammatory factors influencing concurrent gut and lung inflammation. Inflamm Res. 73 (12), 2123-2139 (2024).
  38. Maxwell, M. J., et al. Genetic segregation of inflammatory lung disease and autoimmune disease severity in SHIP-1-/- mice. J Immunol. 186 (12), 7164-7175 (2011).

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

SHIPFITCMasson s Trichrome

관련 논문