형광 폴리스티렌 미세구를 이용한 생체 내 2광자 현미경용 미세혈관 색전증 마우스 모델

요약

이 프로토콜은 형광 스티렌 미세구를 이용한 생 체 내 2광자 현미경 영상에 최적화된 만성 두개골 창문 및 미세혈관 색전증 마우스 모델에 대한 단계별 접근법을 상세히 설명하고 있습니다.

초록

뇌의 미세혈관 폐색은 비교적 흔하지만 여전히 연구가 거의 이루어지지 않고 있습니다. 사건 발생률, 장기적 결과, 그리고 잠재적 정화 메커니즘은 대부분 알려져 있지 않습니다. 광혈전증, 미세색전증 주사와 같은 현재 연구용 모델들은 각각 고유한 장단점을 가지고 있습니다. 이 연구는 만성 두개골 창 준비와 쥐에서 동맥 내 미세구 주입 을 통한 뇌 미세혈관 색전증 유도를 결합한 상세한 프로토콜을 개발하였습니다. 이 구조는 2광자 현미경을 이용해 미세혈관과 미세폐색의 장기 생체 내 영상화를 가능하게 합니다. 미세구는 외경동맥(ECA)에 삽입된 카테터를 통해 전달되며, 이 카테터는 영구적으로 결찰됩니다. 중요한 점은 대경동맥(CCA)과 내경동맥(ICA)이 시술 중과 수술 후에도 온전하게 유지되어 뇌 혈류 방해를 최소화한다는 것입니다. 즉각적인 생체 내 영상 촬영을 용이하게 하고 미세구 집집 또는 피펫 팁 및 카테터에 부착되는 것을 방지하기 위해, 미세구는 FITC-덱트론과 0.1% 트윈 20의 혼합물에 현탁됩니다. 이 주입 기술은 사 후 현장 3D 영상을 통해 미세구의 분포를 확인함으로써 검증되었습니다. 이 연구는 생체 내 2광자 현미경 사례를 통해 그 유용성을 더욱 입증합니다. 이 접근법은 미세혈관 색전증을 유도하고 연구하는 데 일관되고 견고한 방법을 제공하여, 고해상도 생체 영상을 이용해 그 영향과 정치 역학을 조사할 수 있게 합니다.

서론

대뇌동맥 색전증으로 인한 허혈성 뇌졸중은 급성이고 종종 치명^{적인 사건입니다}. 색전은 더 원위 혈관에서도 발생할 수 있습니다. 그 결과 무증상 뇌경색(SBI)이 발생할 수 있으며; 이름에서 알 수 있듯이, 이들은 증상이 없으며, 보통 영상 촬영 중에 우연히 발견되는 경우가 많습니다 ^2,3. SBI는 흔하며, 노인 부검에서 가장 자주 관찰되는 뇌혈관 질환 중 하나입니다 ^4,5. 역학 연구에 따르면 뇌졸중 병력이 없는 사람들에서 유병률이 20%에 달합니다. SBI는 인지 기능 장애와 치매에 기여하고, 전체 사망률을 높이며, 미래 뇌졸중 위험 요인이 됩니다 ^6,7,8. 경색은 일반적으로 몇 밀리미터 직경에 불과하며, 직경 약 100 μm 정도의 관통 동맥 폐쇄와 관련이 있습니다. 이 관통체들은 광범위한 동맥과 모세혈관 층을 형성합니다. 관통 동맥을 통과해 하류 미세순환에 머무는 작은 미세혈전은 혈관조영술⁹에서 발견되지 않을 가능성이 큽니다. 그러나 많은 미세혈전은 심방세동, 동맥경화성 플라크, 그리고 다른 출처에서 방출될 수 있습니다 10,11,12,13,14. 미세혈전증 외에도 지방 입자, 세포 집합체, 심지어 미세플라스틱 등 다른 미세입자(MP)가 미세혈관 색전증을 유발할 수 있습니다. 여러 연구에서 혈액과 뇌 내 모세혈관 직경 5 μm^15,16보다 큰 플라스틱 MP가 존재함을 보여줍니다.

미세혈관 폐색은 급성 뇌졸중과 SBI에 비해 상대적으로 연구가 부족합니다. 사건 발생률, 장기적 영향, 그리고 가능한 청산 메커니즘에 대해서는 거의 알려진 바가 없습니다. 그러나 뇌졸중 내 기계적 혈전절제술이 성공적으로 도입된 이후, 미세혈관 색전증이 큰 원인 동맥의 명백한 재관통 후 미세혈관 재관류를 저해할 수 있다는 점에서 관심이 급격히 증가^{하고 있습니다.} 또한, 미세플라스틱 연구가 급증하고 있는데, 이는 미세혈관 색전증을 통해 부분적으로 영향을 미칠 수 있습니다 18,19,20.

쥐 피질의 미세혈관 폐색은 두개창을 이용한 다광자 현미경 등 여러 방법으로 연구할 수 있습니다. 뇌 미세혈관 폐색을 연구하는 데 가장 일반적으로 사용되는 모델은 광혈전 모델과 미세구 모델입니다. 광혈전증 모델은 광활성화를 통해 선택된 혈관(일반적으로 모세혈관이 아닌 혈관)에서 색전증을 유도하기 위해 광감성 염료를 사용합니다. 그러나 이 모델은 섬유소용해제 시스템이 활성화되어 색전증을 용해시키기 때문에 장기간에 걸친 색전증 연구를 허용하지 않는다^21,22. 더불어, 빛에 민감한 염료의 활성화는 단일 산소 종을 생성하여 내피 및 혈액-뇌 장벽(BBB) 손상을 일으킵니다²³. 뇌색전증 중 내피 및 BBB 기능, 그리고 뇌 순환과 뇌 기능에 대한 장기적 영향에 관한 연구에는 마이크로스피어 모델이 선호됩니다. 미세구체 주입 모델은 뇌 순환에 주입된 미세구체를 사용하여 대뇌 미세혈관 9,24,25,26,27,28,29,30을 막습니다. 이 모델의 단점은 광혈전제법과 달리 색전증의 위치를 미리 결정할 수 없다는 점입니다. 장점은 직경이 명확한 미세구를 주입할 수 있어 특정 직경 33,34,35의 (미세) 혈관을 표적으로 삼을 수 있다는 점입니다.

수년간 설치류의 뇌 순환에 미세구체를 주입하는 다양한 접근법이 개발되어 왔습니다. 이 프로토콜들은 대동맥 삼각형(CCA), 내경동맥(ICA), 외경동맥(ECA)으로 구성된 경동맥 삼각형에 접근하여 동맥 내 미세구상 주입에 합의를 이룹니다. 동맥 내 미세구상 주입 방법은 프로토콜마다 여러 면에서 다릅니다. 첫째, 연구에서는 주사기 9,26,27,29,33,34 또는 카테터 25,28,30,36을 사용했습니다. 둘째, 주입된 마이크로스피어의 수와 크기에 상당한 차이가 있습니다. 마이크로스피어 직경은 일반적으로 10에서 50 μm 사이이며, 선택은 대상 용기 크기에 따라 다릅니다. 경험상, 미세구가 클수록 1번 숫자가 더 낮게 주입되어야 하며, 모세혈관^{25, 26, 30}보다 소동맥이 적기 때문입니다.

일관된 동맥 내 미세구체 주입을 달성하는 것은 여전히 도전적입니다. 실제로는 많은 수의 미세구가 주입되지만, 대뇌 순환에 도달하는 것은 극히 일부에 불과합니다. 이는 생 체 내 2광자 현미경 영상으로 박힌 미세구의 효과를 연구할 때 특히 문제가 되는데, 이 기술의 성공은 준비된 두개골 창을 통해 볼 수 있는 쥐 피질 외층에 미세구가 존재하는 데 달려 있기 때문입니다. 미세구체에 적합한 형광 염료를 선택하는 것은 매우 중요한데, 이는 형질전환 마우스 모델과 혈관 내 염색을 결합하는 것이 미세구체의 강한 형광과 겹치는 방출 스펙트럼 때문에 어려울 수 있기 때문입니다.

미세혈관 폐색은 설치류 모델에서 연구되며, 여러 미세구체의 시너지 효과가 이전에 외부 설치류 뇌에서 입증^되었고, 이러한 입자의 명백한 유출 현상인 혈관식도^33,35,37,38. 생체 내 연구를 가능하게 하기 위해 두개골 창을 가진 쥐를 대상으로 다광자 현미경 관측 방법이 개발되었습니다. 이번 연구의 목적은 쥐에 미세구를 동맥 내 주입하기 위한 상세한 프로토콜을 개발하고 보고하는 것으로, 뇌 조직에 미치는 미세구체의 영향과 운명에 대한 연구를 최적화하는 것입니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 전달 효율이 향상되어 미세구체 손실을 최소화하고 두개골 창문 영상 영역 내 중대뇌동맥(MCA) 영역에 미세구체가 존재할 가능성을 높인다는 점입니다. 최적화된 미세구어 주입 프로토콜은 생체 내 2광자 현미경과 전용 영상 크라이오미세토름 ³⁹를 이용한 사후 현장 3D 이미징을 통해 평가됩니다.

프로토콜

동물을 포함한 모든 절차는 실험동물 관리 및 사용 가이드를 따랐습니다. 네덜란드 중앙동물실험위원회는 전면적인 승인을 내렸다(AVD11400202316817).

참고: 2개월에서 1세 사이의 수컷과 암컷 마우스를 사용했습니다. 도착 후 동물들은 실험 절차 전에 7일간 적응을 시행했습니다. 동물들은 한 우리당 최대 4마리까지 수용되었으며, 음식과 물을 자유롭게 제공받았으며 12시간 동안 빛과 어둠 주기로 관리되었습니다. NG2-DsRed 및 TIE2-GFP 마우스를 얻어 사내에서 육종했습니다(자세한 내용은 재료표 참조).

1. 두개창 이식

1. 마취 및 수술 전 치료
   1. 두개골 창문 수술 시작 1일 전에 0.06 mg/mL 카프로펜을 음용수에 첨가하세요.
   2. 생쥐의 무게를 재고 수술 30분 전에 카프로펜 5mg/kg과 덱사메타손 2mg/kg을 피하 투여합니다.
   3. 수술 부위를 준비하기 위해 입체 정위 프레임에 피드백 시스템이 장착된 온열 패드를 놓고 멸균 천으로 덮습니다.
   4. 모든 멸균 수술 기구를 두 번째 멸균 천 위에 펼쳐 놓으세요.
   5. 1L/분의 공기 혼합물(산소 30%, 의료용 공기 70%)과 3-4% 이소플루란으로 유도 챔버에서 마취한 후, 얼굴 마스크를 사용해 1.5-2% 이소플루란으로 마취를 유지합니다.
   6. 마우스를 입체 정위 프레임에 고정하고, 윤활제를 사용해 온열 패드의 온도계 프로브를 직장에 삽입하세요. 건조를 막기 위해 연고를 바르고 온열 패드를 37°C로 설정하세요.
   7. 수술 5분 전 수술 절개 라인에서 1.5 mg/kg의 로피바카인을 피하 투여합니다.
   8. 목부터 눈 바로 뒤까지 베타딘으로 두개골 피부를 면봉으로 닦아주세요.
2. 헤드바 및 창문 고정을 위한 수술 준비
   1. 멸균 겸자와 수술용 가위를 사용해 두개골 뒤쪽 피부에 초기 절개를 합니다. 람다 봉합선에서 정중선을 따라 앞으로 절개를 확장하여 브레그마 바로 앞쪽의 전두실 봉합선까지 확장합니다(그림 1A). 조심스럽게 피부를 당기고 제거하여 양쪽 측두근을 완전히 노출시킵니다.
   2. 출혈을 최소화하기 위해 약 0.1mL의 1% 리도카인을 두개골에 바릅니다.
   3. 골막을 제거하고 머리 바가 고정될 두개골 부위를 수술용 칼날로 긁어주세요. 긁힌 부분을 두개골 전체에 수직으로 하여 헤드 바가 단단히 붙도록 하세요.
   4. 남은 피는 면 끝으로 닦고 압축 공기로 두개골을 말리세요.
3. 헤드 바 고정
   1. 4 °C의 차가운 세라믹 용기에 100 μL 단량체를 0.1g 폴리머에 첨가한 후 혼합하여 치과용 접착제 혼합물을 만듭니다. 접착제의 빠른 응고를 시작하기 위해 혼합물에 촉매 1방울을 첨가합니다.
   2. 헤드바 바닥에 접착제를 바르세요. 시상동에서 왼쪽 외측으로 머리 막대를 약간 기울여 두개골에 누르세요. 헤드 바 가장자리에 추가 접착제를 발라 모든 구멍을 밀봉하세요. 이로 인해 단단한 접착이 보장됩니다.
   3. 100 μL 치아 시멘트 액체와 0.1g 분말을 섞어 치과용 시멘트 혼합물을 만듭니다. 시멘트를 헤드 바의 모든 면에 바르면서도 시멘트가 드릴링 부위로 흘러가지 않도록 하세요. 머리 막대 위에 치과 시멘트를 추가하여 웰을 형성하여 두개골 창에 액체를 주입할 수 있게 합니다(그림 1B).
   4. 치과용 접착제와 시멘트를 최소 10분 정도 말리세요.
   5. 두개골 절개술이 진행될 두개골에 부드럽게 압력을 가하여 머리 바의 단단한 부착을 확인하세요. 두개골이 움직이지 않고 치과 시멘트와 두개골 사이에 액체가 없을 때는 헤드바가 제대로 부착됩니다.
4. 두개술
   1. 마우스를 헤드 바를 이용해 영상 홀더에 부착하거나, 입체 정위 프레임에 넣어 두개골 절개 수술 중 동물의 머리를 단단히 고정하세요.
   2. 두개골에 직경 4mm의 두개골 드릴링 타겟을 미세 점으로 표시하세요. 두개골을 통해 보이는 MCA를 찾아 두개골 창이 최적의 위치에 위치해 MCA를 최대한 많이 덮도록 하세요. 시추 타겟의 정확한 크기와 위치를 확인하려면 표식 부위 위에 덮개 유리를 올려놓고 필요에 따라 타겟 크기를 조절하세요.
   3. 두개골에 압력을 가하지 않고 표시 부위를 원형으로 뚫어 열이 발생하지 않도록 하세요(그림 1C). 30초마다 식염수를 뿌려 두개골을 식히세요. 냉각 중에는 드릴 헤드를 물에 담근 후 종이 타월로 닦아 청소하고 식히세요. 압축 공기를 사용해 뼈 가루를 정기적으로 제거하세요. 두개골 크기는 덮개 유리를 두개골에 씌우고 필요하면 드릴링을 조정해 확인하세요.
   4. 뼈가 충분히 얇아질 때까지 원을 그리며 계속 드릴을 돌리세요. 두개골이 거의 구멍이 나면 드릴링 부위에 금이 생깁니다. 두개골을 부드럽게 하기 위해 식염수를 추가하고, 드릴링 부위 내에서 두개골 중앙을 부드럽게 눌러 뼈가 충분히 얇아졌는지 확인하세요. 두개골이 부드러운 압력 하에 모든 면에서 고르게 움직일 때 드릴 부위는 충분히 얇습니다. 이 지점에 도달할 때까지 계속 시추하세요. 두개골을 뚫지 마세요; 이로 인해 경막과 뇌 조직이 손상될 위험이 있습니다. 경막이 손상되거나 출혈이 발생하면 드릴 부위를 aCSF로 적셔 두세요.
      참고: 두개골을 제거하기 전에 드릴링 부위의 모든 뼈 먼지가 제거되었는지 확인하세요. 경막에 남아 있는 뼈 입자가 창문 아래에서 뼈 재생을 촉진할 수 있습니다.
   5. aCSF와 압축 공기를 사용해 뼈 가루를 완전히 제거하세요. 두개골이 완전히 잠길 때까지 드릴된 부위에 aCSF를 적용하세요. 27게이지(0.4mm x 16mm) 또는 30게이지(0.3mm x 13mm) 바늘을 사용해 얇아진 두개골을 수평(~180°)으로 조심스럽게 찔러 경막과 뇌에 손상을 주지 않도록 합니다. 뼈를 부드럽게 위로 밀어 올려 최소한의 힘을 가해 분리시킵니다. 뼈가 쉽게 분리되지 않으면 계속 드릴링하세요. 분리된 두개골을 겸자로 제거하고, 뇌를 aCSF에 담근 상태로 유지합니다(그림 1D).
   6. 뇌를 aCSF로 세척한 후, 멸균되고 흡수성이 있는 돼지 젤라틴 혈모 스펀지를 aCSF에 적셔 2분간 국소 출혈을 조절합니다. 스펀지를 조심스럽게 제거하고 뇌를 뇌 담가에 담가둡니다. 뇌에 뼈 먼지나 혈액이 남지 않도록 aCSF로 계속 세척하세요. 출혈이 계속되면 신선하고 멸균된 흡수성 지혈 스펀지를 뇌에 두면서(aCSF)에 적셔 놓으세요.
      참고: 뼈 제거 시 경미한 출혈이 흔합니다. 유리를 놓기 전에 반드시 잔여 피임이 멈췄는지 확인하세요. 잔여 피임은 창문의 투명도를 저하시킬 수 있습니다.
5. 커버 유리 배치
   1. 면봉으로 뇌를 덮고 있는 aCSF를 흡수하고, 얇은 층만 남깁니다. 덮개 유리를 뇌에 올려놓고 구부린 마이크로 겸자로 두개골 구멍에 부드럽게 눌러줍니다. 커버 유리가 두개골 높이보다 약간 아래에 위치하고, 머리 막대와 평행하게 위치하도록 하세요.
      참고: 유리는 충치 형성을 방지하고 창문 품질을 유지하기 위해 뇌에 단단히 눌러야 합니다. 커버 글라스를 헤드 바와 평행하게 유지하면 현미경 대물렌즈에 수직이 되어 이미지 품질이 향상됩니다.
   2. 커버 글라스를 에폭시 접착제로 두개골과 헤드 바에 붙이고, 유리를 단단히 고정하고 헤드 바와 평행하게 고정한 채 옆면에 붙입니다.
   3. 뇌 노출을 막기 위해 커버 유리의 모든 가장자리를 접착제로 밀봉하세요. 접착제가 창문 아래로 스며들거나 경막에 닿는 것을 막기 위해 뇌에 aCSF 한 방울을 유지하세요(그림 1E).
   4. 접착제가 5분간 굳어지도록 두세요.

그림 1: 두개술 프로토콜 개요. 두개골 절개술과 머리 고정 수술 중 중요한 단계에 대한 상세한 예시 사진과 도식도. (A) 피부 제거 (2.2단계). (B) 헤드바 부착 (2.3단계). (C) 4mm 두개골 절개술 드릴링 (단계 2.4.3). (D) 두개골 제거 (단계 1.4.5). (E) 커버 유리 배치 (1.4.7단계). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

6. 수술 후 관리
   1. 카프로펜 5 mg/kg을 피하 투여하세요.
   2. 동물을 37°C 회복 케이지에 30분간 옮기세요. 수술 후 최대 2일간 0.06 mg/mL 카프로펜을 식수에 넣은 채 집 케이지로 돌려보내세요.
   3. 동물이 수술 전 체중으로 돌아올 때까지 0.06 mg/mL 카프로펜에 적신 음식을 제공하세요.
   4. 미세혈관 색전증 모델 수술을 시행하기 전에 최소 7일간 동물이 회복할 시간을 주세요.

2. 미세혈관 색전증 마우스 모델

1. 카테터 조립
   1. 길이 20cm 마이크로 카테터(ID 0.23114 OD 0.27432 mm)의 끝을 투명 카테터(ID 0.31 OD 0.64 mm)에 삽입하고 에폭시 접착제와 테이프로 연결을 밀봉합니다. 카테터 전체 길이가 최소 160 μL를 담을 수 있는지 확인하세요.
   2. 투명 카테터 반대편 끝에 27게이지 루어락 바늘(0.1mm x 16mm)을 삽입합니다. 끝부분을 에폭시 접착제와 테이프로 밀봉하세요.
   3. 1mL 주사기에 생리식염수를 채우고 카테터 바늘의 루어 락에 연결하세요. 0.7mL의 식염수로 세척하여 누수나 기포가 남지 않도록 하세요.
   4. 카테터에 80 μL의 생리식염수를 채우고 카테터 내 도달한 수치를 표시하세요.
2. 마취 및 수술 전 치료
   1. 미세혈관 색전증 수술 하루 전에 0.06 mg/mL 카프로펜이 포함된 물을 쥐에게 제공하세요.
   2. 피드백 시스템이 있는 온열 패드를 멸균 천 아래에 놓고 37°C로 설정하세요.
   3. 모든 멸균 수술 기구를 두 번째 멸균 천 위에 올려놓으세요.
   4. 수술 30분 전에 마우스 무게를 재고 5 mg/kg 카프로펜을 피하 투여하세요.
   5. 3-4% 이소플루란을 유도 챔버에서 1L/분의 가스 흐름으로 30% 산소와 70% 외과용 공기로 만든 마취를 시행합니다.
   6. 마우스를 수술대로 옮기고, 1.5-2% 이소플루란을 분당 1리터에 산소 30%, 공기를 70% 투여하는 얼굴 마스크 로 마취를 유지하세요.
   7. 윤활된 직장 온도 탐침을 삽입하고 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 바르세요.
   8. 2mL 주사기를 누운 쥐의 목 아래에 놓아 수술 부위에 쉽게 접근할 수 있게 하세요.
   9. 앞발을 부드럽게 테이프로 수술대에 고정하세요.
   10. 수술 부위를 면도하고 베타딘을 바른 뒤 리도카인을 바르세요.
3. 베기
   1. 발가락 집기로 마취 깊이를 확인하세요.
   2. 수술용 가위와 박리 겸자를 사용해 하악골 아래 기관 위 약 0.5cm 중앙선 절개를 합니다.
   3. 미세 봉합 겸자를 사용해 경추근막과 표면 결합 조직을 해부하여 기저 흉골설근을 노출시킵니다.
   4. 왼쪽과 오른쪽 흉골설골근을 부드럽게 결합 조직을 찢어 분리하세요. 조직 훅으로 오른쪽 오모모하피근을 후리-외측으로 당깁니다. CCA, ICA, ECA를 포함한 오른쪽 경동맥 삼각형이 명확히 보이도록 하세요.
4. CCA, ICA, ECA 및 후두정동맥(PPA)의 외과적 준비
   참고: 미주신경을 잡거나 꼬집는 것을 피하세요; 동물의 건강에 부정적인 영향을 주지 않도록 조심스럽게 움직이세요. 기관을 만지지 마세요. 호흡기 문제를 일으킬 수 있습니다. 후두동맥(OA)은 ICA의 Y자형 분기점과 ECA 기원 사이 중간 지점에서 분기하며, 상갑상선 동맥(TA)은 ECA의 내측에서 분기됩니다. 이 동맥들은 매우 약하므로 매우 주의해서 다뤄야 합니다.
   1. CCA를 둘러싼 남아 있는 근막과 지방 조직을 제거하세요.
   2. CCA를 미주신경과 조심스럽게 분리하세요.
   3. CCA 주위에 4/0 1.5 나사산 두 개를 끼우고 느슨하게 묶으세요. 매듭이 CCA 혈류를 방해하지 않도록 하세요.
   4. ICA와 PPA에서 근막과 지방 조직을 제거하세요. PPA와 모든 ICA 측 지선, OA를 포함해 4/0 1.5 실로 매듭을 묶어 임시로 연결하세요.
   5. ECA와 TA에서 근막과 지방 조직을 제거하세요. ECA와 TA 주위에 4/0 1.5 실로 느슨한 매듭 두 개를 만듭니다. 가장 먼 실을 Y자형 분기점에서 최대한 멀리 위치시키고, 이를 사용해 ECA와 TA를 영구적으로 연결하세요. 근접 매듭은 풀어두세요.
5. 미세구형 용액 준비 및 카테터 적재
   참고: 주입 직전에 FITC-덱스트란/미세구체 용액을 준비하여 미세구가 카테터에 부착하는 것을 최소화하세요.
   1. 10 μm 마이크로스피어(7.2 x 10⁶ 마이크로스피어/mL)를 균질화하고 초음파 처리하여 개별 입자의 균일한 현탁액을 얻습니다.
   2. 25 mg/mL 70 kDa FITC-덱터른 140 μL (0.1% Tween20 함유)를 준비한 후, 균질화된 마이크로스피어 20 μL 추가하여 160 μL FITC-Dextran/Tween20/마이크로스피어 혼합액 1.44 × 10⁵ 마이크로스피어를 얻습니다.
   3. 카테터에 연결된 주사기를 잠시 당겨 에어록을 만드세요.
   4. 카테터 끝을 준비된 FITC-덱스트란/트윈20/마이크로스피어 혼합물에 담그고 주사기를 천천히 당겨 혼합물이 카테터 안에 들어갈 때까지 유지합니다.
   5. 카테터 안에 기포가 없는지 확인하세요. 혼합물이 있다면 0.5mL 용기에 비우고 2.5.3, 2.5.4단계를 반복합니다.
   6. 주사기를 주사기 펌프에 넣으세요. 펌프를 10 μL/min으로 설정하고 카테터 끝에 미세한 구체 혼합물이 작은 방울이 나올 때까지 작동시킵니다.
6. 카테터 삽입 및 마이크로스피어 주입
   참고: 혈관계에 공기 방울을 주입하는 것은 심각한 부작용이나 사망을 초래할 수 있으므로 피해야 합니다. 공기 방울은 잘못된 카테터 하중이나 튜빙 내 누출로 인해 발생할 수 있습니다.
   1. ICA에 그릇 클립을 끼우고 미리 준비한 근위 매듭 중 하나를 CCA 주위에 조이세요(2.4.3 단계 참조).
   2. 마이크로 가위를 사용해 ECA에 결찰 실에서 약 0.5mm 떨어진 곳에 작은 대각선 절개를 합니다. 절개 크기가 카테터 직경보다 약간 작게 유지되도록 하세요.
   3. 멸균된 천이나 조직으로 혈액을 흡수하여 결찰부와 혈관 클립을 넘어 혈액이 새지 않도록 하세요.
      참고: ECA 절개 후 혈관 삼각형은 혈액이 없어야 합니다. 잔류 혈액은 혈전 형성을 유발할 수 있으며, 이는 경동맥 흐름 회복 시 큰 뇌 허혈 사건을 일으키거나 ECA를 막아 미세구상 주입을 방해할 수 있습니다.
   4. 잠시 주사기 펌프를 작동시켜 카테터 끝에 미세구상 혼합물을 한 방울씩 형성하고, 카테터 끝에 공기가 남아 있지 않는지 확인합니다.
   5. ECA 절개부를 열고 미세한 마이크로 겸자로 카테터를 삽입합니다. 삽입 시 미세구 혼합물이 손실되거나 카테터로 공기가 유입되는 것을 방지하기 위해 다른 표면을 접촉하지 마세요. 삽입이 실패하거나 카테터 끝이 표면에 닿으면 2.6.4단계를 반복한 후 다시 시도하세요.
   6. ECA를 감싸는 근위 봉합선을 조여 카테터를 고정하세요(2.4.5 단계 참조).
   7. 혈관 내에 누설이나 기포가 없는지 확인하여 주사기 펌프를 분당 10 μL로 시작하세요. 둘 중 하나라면 카테터를 분리하고 2.6.4단계로 돌아가세요.
   8. 누출이나 기포가 감지되지 않으면 10 μL/분으로 계속 펌핑하여 카테터와 혈관의 압력을 점차 증가시켜 동맥이 눈에 띄게 확장되는 것을 관찰합니다. 동물의 동맥압과 일치시키기 위해 ICA와 CCA를 다시 열기 전에 카테터와 혈관에 충분한 압력을 설정하세요. CCA와 ICA에서 혈류가 회복되면 일부 혈액이 카테터로 들어갈 수 있지만, 이후 다시 ICA로 주입됩니다. 마이크로스피어 혼합물이 ECA에 주입된 것을 육안으로 확인하고, 동맥을 채우는 녹색 FITC 염료를 관찰하여 압력 축적이 성공했는지 확인하세요. 만약 이 현상이 나타나지 않는다면, 주사기 펌프를 멈추고 카테터를 제거한 후 2.6.4부터 2.6.8까지 단계를 반복합니다.
   9. ICA에서 혈관 클립을 제거한 후 주사기 펌프 유량을 분당 20 μL로 증가시킵니다. PPA 분기점 먼 ICA가 FITC 염료로 채워져 있는지 확인하여 마이크로스피어 주입 성공을 확인하세요. 확인되면 2.6.11 단계로 진행; 그렇지 않으면 2.6.10 단계로 진행하세요.
   10. 주사기 펌프를 멈추고 PPA 결찰을 느슨하게 하세요. PPA 연결부를 ICA-PPA 분기점에서 더 멀리 위치시키고, 그 후 결합을 조인합니다. 2.6.9단계로 돌아가세요.
   11. CCA를 연결한 나사를 제거하여 미세구 혼합물이 ICA로 흘러들어갈 수 있게 합니다.
   12. 마이크로스피어 혼합물 주입 시 역행 흐름 시 문제 해결:
       1. 마이크로스피어 혼합물이 CCA로 역행하는 흐름이 발생하면, 주사기 펌프 유량을 분당 10 μL로 줄입니다.
       2. 역행성 혈류가 계속되면 마이크로 겸자로 ECA, ICA, CCA를 부드럽게 압착하여 혈전으로 인한 혈류 장애가 없는지 확인합니다.
       3. 혈관 내에 공기 색전이 없다는 것을 시각적으로 확인하세요. 공기 색전은 혈관 내 투명한 부분으로 인식할 수 있습니다.
       4. 공기 색전이 있으면 주사기 펌프를 멈추고 마이크로 겸자를 이용해 동맥을 부드럽게 눌러 공기 색전을 ECA로 옮기세요. CCA를 연결하고 ECA에 수기 클립을 부착하세요. 카테터와 공기 색전을 제거하고 2.6.4단계로 돌아가세요.
       5. 막힘이 없지만 역행 흐름이 계속된다면, 혈관 클립을 사용해 CCA를 닫고 2.6.10 단계로 복귀합니다.
          참고: 미세구체 혼합물이 CCA로 역행하는 것은 발생해서는 안 되며, 이는 ICA 재개막 부족, 공기 색전증 또는 혈전 형성을 나타낼 수 있어 실험 결과에 잠재적으로 해로운 영향을 미칠 수 있습니다.
   13. 카테터 내 혼합물이 80 μL 지점에 도달하면 주사기 펌프를 끄어 마이크로스피어 주입을 멈춥니다(3.1.4 단계 참조). 총 80 μL FITC-덱스트란/Tween20 용량에 7.2 x 10⁴ 마이크로스피어가 주입됩니다.
7. 절차 완료
   1. 남은 준비된 매듭으로 CCA를 묶고(2.4.3 단계 참조) 그리고 VESSEL 클립으로 ICA를 닫습니다.
   2. 카테터를 ECA에서 분리하되, 카테터를 고정하는 나사는 같은 위치에 유지하세요.
   3. 카테터를 고정한 실을 조여 ECA를 영구적으로 결찰하세요.
   4. 혈관 클립과 CCA, ICA, PPA 주변의 나사산을 제거하여 혈류를 회복하세요. 수술 부위를 식염수 몇 방울로 적셔주세요.
   5. 12mm 길이의 역방향 절단 3/8 곡선 바늘과 흡수성 없는 3-0(USP) 실크 봉합으로 피부를 봉합합니다.
8. 수술 후 관리
   1. 카프로펜 5 mg/kg 피하 투여.
   2. 동물을 회수 케이지(~33 °C)로 옮기고 30-60분간 보관하세요. 완전히 회복되면 동물을 집 우리로 돌려보내세요.
   3. 처음 이틀 동안은 0.06 mg/mL의 카프로펜에 10분간 음식을 담가 동물에게 주고, 마시는 물에는 0.06 mg/mL의 카프로펜을 보충합니다. 이 기간 이후에는 카프로펜 없이 적신 음식을 계속 주어 동물이 수술 전 체중으로 돌아올 때까지 계속하세요.
   4. 처음 이틀은 하루에 여러 번 관찰하고, 그 이후에는 주 3회로 관찰하세요. 인도적인 결과가 나오면 동물을 안락사시키세요.
      참고: 인간 종점은 유럽의회 지침 2010/63/EU에 따라 정의됩니다. 또한, 원형 행동이나 마비 등 허혈 징후가 보이면 미세혈관 색전증 모델이 주요 허혈 사건을 일으키지 않도록 안락사시키세요.

그림 2: 미세혈관 색전증 수술. 미세혈관 색전증 수술 중 중요한 단계에 대한 상세한 예시 사진과 도식도. (A) CCA(2회), ECA(2회), TA, OA, PPA 연결 (2.4단계) 준비. (B) (서두) 결찰(^1st)과 ECA를 결찰한 후, OA와 PPA를 닫고 혈관 클립으로 ICA를 임시로 닫아 출혈 없이 ECA를 절개할 수 있게 합니다(단계 2.6.2). (C) 해리된 ECA에 카테터를 삽입하며, 두 번째 봉합사와 연결됩니다(단계 2.6.7). (D) CCA 주변 근위 봉합선을 열고 혈관 클립을 제거하여 혈류를 회복한 후, 미세구체 혼합물을 ICA에 주입하는 것(단계 2.6.10). CCA = 총경동맥; ECA = 외경동맥; TA = 갑상선 동맥; OA = 후두동맥; PPA = pterygopalatine 동맥; ICA = 내경동맥. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

3. 생체 내 영상

1. 2광자 현미경
   1. 동물을 현미경의 2광자 영상 홀더에 넣어 수술 후 생체 내 영상을 촬영합니다. 산소 30%와 공기가 섞인 1리터/분의 혼합물에서 1.2% 이소플루란으로 가벼운 마취를 유지하고, 호흡 빈도와 깊이를 모니터링하세요. 현미경 설치 세부 사항은 보충 표 1 을 참조하십시오.
   2. 10배 대물렌즈(10x/0.30 DRY)와 수은 램프 조명을 사용해 두개골 창문을 통해 박힌 미세구를 찾아냅니다. 그 후 25배 물 침수 대물렌즈(25배/0.95 WATER)를 사용한 2광자 영상으로 전환합니다. 영상 설정은 보충 표 2 를 참조하세요.
   3. 관심 있는 미시구 주변에 Z-스택을 기록하세요.

4. 부후 분석

1. 현장 영상의 실험적 평가 지표
   1. 실험적 종점에 도달하면, 30% 산소와 70% 의료용 공기를 혼합한 분당 1리터 비율의 혼합물> 4% 이소플루란 하에서 자궁경부 탈구로 동물을 안락사시킵니다.
2. 현장 뇌 영상
   1. 뇌를 추출하여 3.0% 카복시메틸셀룰로오스 나트륨 용매(Sigma)와 0.1% 검은색 잉크(VWR)를 혼합한 상태에 삽입하고, −20°C에서 최소 24시간 이상 냉동합니다.
   2. Juch R.N.S. 외 ⁴⁰편에서 이전에 설명한 맞춤형 소형 3D 형광 영상 크라이오미세토름 시스템(small-3D-FICS)을 사용해 뇌를 영상화합니다. 시스템을 설정하여 뇌를 수직으로 16 μm 단위로 나누고 13.66 μm 해상도× 영상 촬영합니다. 영상 설정과 시스템 사양은 보충표 3 과 보충표 4 를 참조하십시오. Articulus 소프트웨어⁴¹을 사용해 이미지를 분석하세요.
3. 현장 전체 마우스 영상
   1. 동물의 가죽, 이빨, 꼬리를 벗기세요.
      참고: 꼬리 제거는 선택 사항이지만 영상 속도를 증가시킵니다.
   2. 동물을 3.0% 카복시메틸셀룰로오스 나트륨 용매(시그마)와 0.1% 검은잉크(VWR)를 혼합한 상태에 넣고, −20°C에서 최소 24시간 이상 냉동합니다.
   3. 앞 ^{서 설명}한 대로 맞춤형 대형 3D 형광 영상 크라이오미세토미션 시스템(large-3D-FICS)으로 동물을 촬영하세요. 시스템을 25.9 μm 구간을 26.09μm의 평면 내 해상도로 절단하도록 설정하세요. 영상 설정과 시스템 사양은 보충 표 5 와 보충 표 6 을 참조하십시오. Articulus 소프트웨어⁴¹을 사용해 이미지를 분석하세요.

결과

현장 부사 영상

미세혈관 색전증 수술의 성공은 미세혈관 색전증 수술 4일 후 전신 및 전뇌 사 후 현장 영상을 통해 확인되었습니다(그림 3A). 쥐의 시상 절단은 뇌 내 미세구가 머무는 것을 보여줍니다. 그림 3B, C 는 미세혈관 색전증 수술 1일 후 추출된 마우스 뇌의 예시를 보여줍니다. 미시구는 주로 동측 반구, 중전부 대뇌동맥의 흐름 영역에 위치했다. Tween20을 혼합물에 첨가했을 때 뇌 절편 내 미세구어 수가 유의미하게 증가했습니다(그림 3E). 미세색전증 수술 후 회복 기간 동안 체중을 모니터링한 결과, Tween20이 포함된 미세구체 혼합물을 주입했을 때 쥐는 더 적은 체중 감량과 수술 후 더 빠른 회복을 보였습니다(그림 3F).

그림 3: 미세혈관 색전증 수술 후 마우스 내 미세구 분포. Articulus 소프트웨어⁴¹을 사용해 시각화한 마우스 내 10 μm 미세구의 현장 위치 확인. (A) 미세혈관 색전증 수술 후 대형 3D-FICS로 촬영한 전체 마우스의 시상면(시상면) 예시. (B-D) 소형 3D FICS를 사용해 촬영한 마우스 뇌의 대표적인 축, 관상, 시상 이미지. (E) 대조군 및 Tween20 조건에서 약 브레그마에서 50 μm 관상동맥 뇌 절편당 평균 검출된 미세구± 0.5 mm. 막대는 평균± 표준편차를 나타냅니다. 개별 측정값은 점으로 표시되어 있습니다. 통계적 비교는 쌍이 없는 t-검정을 사용하여 수행되었으며; p-값은 그래프에 표시됩니다. 이상치는 2분위 범위(IQR) 방법을 사용하여 식별 및 제거되었으며(두 그룹 모두 n = 1), 최종 그룹 크기는 대조군의 경우 n = 3, 20세 그룹은 n = 14가 되었습니다. (F) 미세혈관 색전증 수술 후 시간 경과에 따른 정상화된 체중 변화가 0시점에서 나타납니다. 수술 시 각 동물의 기준선에 맞춰 무게를 정규화했습니다. 선은 그룹별 평균 ± SD를 나타냅니다 (컨트롤, n = 4; Tween20, n = 5) 컨트롤은 파란색, Tween20은 짙은 주황색으로 표시됩니다. 각 시점에서 그룹 간 통계적 유의성은 쌍이 없는 양측 t-검정을 사용하여 평가하였다. (* = p < 0.05, ** = p < 0.01) 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

미세구체 주입 및 생체 내 2광자 현미경

미세구어 주입 시, 5% BSA로 코팅된 카테터는 많은 미세구가 카테터 표면에 부착되어 있었고, 흐르는 미세구들이 종종 군집되어 있어 더 큰 폐색을 일으킬 수 있습니다(보충 영상 1 참조). 또한, 미세구체 혼합물에 5% BSA를 첨가하여 부착과 군집을 방지하는 것은 주입 시 면역 반응 가능성이 있어 바람직하지 않습니다^43,44. 이를 우회하기 위해 0.1% Tween20 용액을 미세구체 혼합물에 사용하여, 카테터를 통과하는 미세구체 수가 눈에 보여 증가했고, 영상 창 내 원하는 수(> 20개)의 미세구체가 나타났습니다(그림 4 및 보조 영상 2). 그림 4A, B는 미세혈관 색전증 수술 0.5시간 후 뇌 피질의 형광 현미경 개요 이미지를 보여줍니다. 각 흰 점은 대뇌 미세혈관 내 모세혈관을 막는 미세구를 나타냅니다. 그림 4C,D는 2D 투영의 2광자 z-스택 이미지를 예시로 보여줍니다. 미세구체는 관류 장애와 함께 뇌 미세혈관 색전증을 유발하며, 이는 미세구 하류에 인내염료가 없다는 점에서 나타난다(그림 4E 및 보완 영상 3). 또한, 이러한 색전증은 FITC-덱터렌 염료의 유출로 인해 BBB에 교란을 일으킵니다(그림 4F,G).

이 결과는 미세구체-트윈 혼합물을 주입할 때 관찰된 미세구체 부착 수의 적음과 최소한의 미세구체 군집과 일치합니다. 그러나 카테터 내 마지막 20μL 혼합물에는 많은 수의 미세구가 모여 있었으므로, 대규모 경색 발생 가능성을 막기 위해 주입해서는 안 됩니다( 보충 영상 4 참조).

그림 4: 박힌 미세구의 2광자 생체 현미경.마우스 피질에 박힌 미세구의 생체 내 형광 및 2광자 이미지 예시. (A) 로지의 미세구형 두개골 창을 통한 형광 전경. (B) 선택된 ROI의 형광 이미지. (C, D) 대뇌 미세순환계 내 갇힌 미세구체의 2광자 현미경 이미지와 상세 영상을 위한 선택된 ROI를 포함합니다. Z-스택 이미지는 Z-스택을 따라 픽셀 세기의 표준편차를 계산하여 2D로 표현됩니다. (E-G) 세 가지 뇌 미세혈관 색전증을 보여주는 대표적인 생체 내 2광자 현미경 이미지. 빨간 화살표는 FITC-덱터른 유출 부위를 강조하여 BBB 교란과 염료 누출을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 표 1: 2광자 현미경 시스템 사양. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충표 2: FITC-덱스트란 및 미세구체 이미징을 위한 2광자 현미경 설정. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충표 3: 청색 미세구체를 이용한 쥐 뇌 영상을 위한 소형 3D 형광 영상 크라이오미세토름 시스템 설정. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 표 4: 소형 3D 형광 영상 크라이오미세토름 시스템 명세: 청색 미세구체를 이용한 쥐 뇌 영상 촬영. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 표 5: 붉은 미세구체를 이용한 전체 마우스 영상을 위한 대형 3D 형광 영상 크라이오미세토름 시스템 설정. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 표 6: 붉은 미세구체를 이용한 전체 마우스 영상을 위한 대형 3D 형광 영상 크라이오미세토름 시스템 사양. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

추가 영상 1: 5% BSA 코팅 카테터와 미세구체 부착이 카테터 벽에 부착되어 있으며, 주입 시 25 mg/mL FITC-덱트론 미세구 혼합물에서 미세구가 군집됨. 이 영상을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 영상 2: 0.1% Tween20 코팅 카테터와 미세구 부착이 카테터 벽에 일부 부착됨, 미세구체 군집 없는 25 mg/mL FITC-Dextran 및 0.1% Tween20 혼합물에 미세구이 삽입됨. 이 영상을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 영상 3: 미세구체에 의한 미세혈관 폐색의 3D 분할. 이 영상을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 영상 4: 25 mg/ml FITC-덱터런과 0.1% Tween20 혼합물에서 고미세구어 농도의 최종 주입량. 이 영상을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 파일 1: 피펫 팁 미세관 준수 검증. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 파일 2: 미세색전술 수술 후 1일, 7일, 28일에 CD45 커버리지를 면역조직화학적 평가하여 동측과 반대쪽 반구를 비교합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

미세혈관 색전증을 모델링하기 위해, 생 체 내 2광자 현미경을 이용해 미세색전증을 연구할 수 있는 미세구체를 쥐의 뇌 순환에 주입하는 프로토콜이 기술되었습니다. 이 방법은 뇌 내 미세구체 포획을 최적화하여 동측 피질의 첫 500 μm 내에 여러 개의 미소구체를 가두어 효과적인 2광자 영상 촬영을 가능하게 했습니다.

뇌 피질 영역에서 높은 미세구어 수는 생체 내 2광자 영상에 매우 중요합니다. 마이크로스피어 혼합물 제조 과정에서 피펫 팁에 5% BSA 또는 0.1% Tween20을 코팅하여 미세구 접착을 줄여 마이크로스피어 손실을 최소화했습니다(보조 파일 1 참조). 부착된 미세구의 정확한 수는 정량화할 수 없었으나, 평균 강도 측정을 통해 코팅의 효과가 확인되었습니다. 또한 Tween20은 카테터 내 미세구의 군집을 방지하는 것으로 보이며, 이로 인해 카테터를 통과하는 단일 미소구의 수가 시각적으로 더 많아졌으나, 이는 정량화되지는 않았습니다. 이로 인해 미세혈관 색전술 모델링 목적상 바람직하지 않은 대형 혈관 폐색 위험과 대규모 허혈성 및 저산소 영역 형성 위험이 줄어듭니다. 더불어, 쥐는 Tween20이 함유된 마이크로스피어 혼합물을 주입했을 때 수술 전 체중으로 더 빠르게 회복했습니다. Tween20은 흔히 사용되는 분산제(^45,46,47)로, 이 연구에서 사용된 낮은 농도는 BBB 무결성에 독성이나 부작용을 일으킬 것으로 예상되지 않습니다. 또한, 우리 데이터는 BBB 누출이 미세구 침착 근처(또는 통과 후)에서만 발생하며 체계적으로 발생하지 않으며, 전체 백혈구 수치의 유의미한 증가를 일으키지 않는다는 것을 보여줍니다(보충 파일 2 참조). 이는 0.1% Tween20 사용을 뒷받침합니다. 전반적으로 Tween20의 추가는 미세구의 응집을 줄이고 뇌 순환에 미세구를 전달하는 데 기여하며, 이는 뇌 절편에서 미세구를 수치한 것으로 확인되며, 2광자 현미경 검사에 충분한 미세구를 확보하는 결과를 낳았습니다. Tween20 사용으로 뇌에 박힌 미세구의 수가 증가하지만, 미세구체 주입의 변동성은 여전히 존재합니다. 이러한 변동에는 여러 요인이 작용할 수 있습니다. 첫째, 카테터나 혈관 내에서 혈전이 형성되면 미세구가 혈전에 달라붙을 수 있습니다. 둘째, 기포의 존재가 원활한 전달을 방해할 수 있습니다. 마지막으로, CCA 또는 ICA에서 혈류가 완전히 회복되지 않으면 혈역학이 변화하여 혈관벽에 미세구가 부착되거나 내강 내에 밀집될 수 있습니다. 안타깝게도 이러한 편차는 주사 시술 중에 감지할 수 없습니다.

폴리스티렌 마이크로스피어는 물보다 밀도가 높아 미세스피어 혼합물이 카테터에 주입되면 분포가 고르지 않습니다. 대부분의 미세구체는 카테터 벽 근처에 가라앉는데, 이곳에서는 유체 마찰로 인해 중심 흐름이 더 빠른 흐름에 비해 이동 속도를 늦춥니다. 이로 인해 결국 카테터의 마지막 20μL 내에 미세구가 축적됩니다. 이 농축된 부분을 주사하는 것은 큰 색전과 허혈 사건을 유발할 수 있으므로 피해야 합니다. 이를 방지하기 위해 마이크로스피어 혼합물 부피는 주입 부피의 두 배로 준비해야 합니다.

미세혈관 색전증 수술은 상당한 훈련과 정밀함을 요구합니다. 가장 기술적으로 어려운 단계 중 하나는 PPA, OA, ICA의 측 지류에 봉합선을 설치하여 미세구체 혼합물이 윌리스와 MCA 영역 내에 정확히 전달되도록 하는 것입니다. 이 단계는 미주신경이 CCA 근처에 가까이 위치해 있고, 혈관의 직경이 작으며, 수술 공간이 제한되어 있어 봉합사를 놓기 어렵고 신경 손상이나 혈관 손상을 유발하기 어렵습니다.

혈관 클립은 봉합사를 이용해 PPA를 일시적으로 결찰하는 대안으로 고려될 수 있지만, 추가적인 위험을 초래합니다. 클립이 의도치 않게 분리되어 용기가 다시 열릴 수 있습니다. 더불어, PPA에 기존 ICA 클립과 함께 두 번째 클립을 사용하면 공간 제한으로 인해 ICA 클립이 분리될 가능성이 높아집니다. 이런 일이 발생하면 심각한 출혈이 발생하며, 즉각적인 개입 없이 실험이 조기 종료될 수 있습니다. 따라서 PPA를 용기 클립으로 닫는 것은 권장되지 않습니다.

현재 프로토콜은 마이크로스피어 주입을 위해 주사기 대신 카테터를 사용합니다. 이 방법은 주입 속도와 부피를 더 잘 제어할 수 있으며, 미세구를 더 멀리서(예: 현미경이나 MRI 스캐너와 같은 영상 기법 내부에서) 주입할 수 있게 합니다.

CCA를 입구로 선택하여 주사 시술 중 CCA가 완전히 열린 상태를 유지하여 수술 내내 생리적인 뇌관류 상태를 유지하는 데 도움을 줍니다. 또한, CCA 대신 ECA를 통해 미세구체를 주입하는 데는^{다음과 같은 장점이 있습니다 48}: i) 재관류 중 총 작업 시간 단축; ii) 주사 및 수술 후 출혈 위험 감소; iii) CCA 입구법에서는 바늘을 제거한 후 CCA에 불안정한 협착과 혈전증이 형성^됩니다. 이로 인해 혈류가 방해받고, 뇌로 유입될 수 있는 미세혈전증 형성 위험도 있습니다. 또한 CCA를 통해 입국하면 CCA가 영구적으로 닫힐 위험이 커 수술 후 생존 기간 동안 뇌 재관류가 최적이 되지 않을 수 있으며, 쥐에서 윌리스 원의 큰 변동으로 인해 악화될 수 있습니다^50,51

완전히 최적화되었음에도 불구하고, 프로토콜에는 몇 가지 한계가 있습니다. 첫째, 미세구체가 카테터 벽을 따라 더 느리게 이동하고 주입 시 고르게 분포하지 않는다는 관찰은 예상보다 ICA에 적게 전달되는 미세구체를 시사합니다. Tween-20을 사용해 밀착을 줄였음에도 불구하고, 일부 미세구체는 여전히 피펫 팁, 에펜도르프 튜브, 카테터에 달라붙습니다. 따라서 실제 주입되는 마이크로스피어 수는 계산된 7.2 x 10 4 입자 한 마리당 적을 가능성이 큽니다. 그럼에도 불구하고, 충분한 미세구가 대뇌 순환에 도달해 2광자 현미경을 통한 영상 촬영이 가능합니다. 주입 프로토콜과 혼합물 조성은 10 μm 폴리스티렌 마이크로스피어에 최적화되어 있습니다. 사용된 재료(팁, 튜브, 카테터)나 미세구의 크기가 변경되면 용액과 주입 절차를 모두 재평가해야 합니다. 둘째, MCA의 내관내 폐쇄를 통한 대혈관 폐쇄에 가장 적합한 방법을 조사한 연구들은 ECA의 영구 결찰을 통한 혈관계 유입이 몰아넣는 근육과 삼킴근의 허혈을 초래한다는 것을 보여주^었다. 이로 인해 쥐의 먹이 섭취량이 줄어들어 과도한 체중 감량, 운동 기능 저하, 신경학적 결손이 증가할 수 있습니다. 하지만 이 주장은 다른⁴⁸명에 의해 반박되었습니다. 본 연구에서 체중 모니터링 결과, 수술 후 예상 체중 감소가 있었으나 며칠 내에 수술 전 체중으로 빠르게 회복하여, 영구 ECA 결찰 후 쥐들이 정상적으로 회복하고 먹고 마시는 것으로 나타났습니다. 동물의 체중은 모니터링되었지만, 이는 동물의 복지를 간접적으로 대변하는 지표일 뿐, 국소 먹음이나 운동 장애와 같은 기능적 장애를 완전히 배제하지는 못합니다. 기능 회복에 대한 직접적인 평가는 수행되지 않았으며, 이는 본 연구의 한계입니다. 또 다른 연구에서는 CCA 또는 ECA를 통한 혈관계 유입을 비교하여, CCA를 통한 유입이 뇌순환의 재관류를 방해할 수 있음을 보여주었고, ECA 진입 방법이 더 바람직하다고 결론지었습니다⁵³. 셋째, 공기 방울, 혈전, 누출 없이 적절하고 안전한 카테터 삽입, 그리고 CCA와 ICA의 혈류를 막지 않으려면 상당한 연습이 필요합니다. 마지막으로, Rose-Bengal 주입²²를 이용한 광혈전증과 같은 다른 미세폐색 기법과 달리, 미세구체가 순환 내 어디에 박힐지 예측할 수 없습니다.

본 연구는 음성(가짜) 또는 양성(광혈전증) 대조군을 의도적으로 포함하지 않는데, 이는 주요 목적에 추가적인 가치를 제공하지 않기 때문입니다. 이 모델의 성공은 특히 두개골 창 부위에 위치한 대뇌 미세순환 내에 위치한 미세구의 수에 의해 정의되며, 이는 고해상도 생체 현미경 관찰을 가능하게 합니다. 가짜 절차는 정의상 목표 부위에 미세구가 전혀 나타나지 않아 생체 내 영상 평가 결과에 대한 적절한 비교를 제공하지 않습니다. 마찬가지로, 광혈전증 모델의 포함은 근본적으로 다른 병태생리학적 메커니즘을 다루는 것이므로, 이 연구는 방법론 비교보다는 미세혈관 색전증 모델의 특성화에 초점을 맞추는 연구의 범위를 벗어납니다. 색전증과 그것이 BBB 또는 국소 신경 조직에 미치는 잠재적 영향에 대한 광범위한 조직학적 분석은 진행되지 않았으며, 연구는 조직 수준 검증보다 생체 내 3D 시각화를 우선시하도록 설계되었다.

두개창 준비와 미세혈관 색전증 모델에 대한 상세한 수술 프로토콜은 미세혈관 색전증과 동측 반구 전반에 걸친 무증상 뇌경색 발생과 관련된 미세혈관 변화에 대한 신뢰할 수 있고 재현 가능한 연구를 지원합니다. 마이크로스피어 혼합물의 최적화된 준비 및 주입은 이 실험 접근법의 일관성과 타당성을 더욱 향상시킵니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
27게이지 바늘 (0.1x16 mm)	테루모	-	27게이지 바늘 (2.1.2단계)
아티큘러스 소프트웨어	-	-	3D 분석 소프트웨어 (Step 4.2.2 & 4.3.3)
베타딘 30ml (100 mg/ml)	마일란	8712207037612	베타딘/요오드 (1.1.8단계 & 2.2.10.)
C& B 단량체	선 메디컬	7111	순간접착제의 구성 요소 (1.3.1단계)
탄소강 수술용 칼날 (번호 15)	스완-모튼	205	두개골을 긁는 칼 (1.2.4단계)
카프로펜 (50 mg/ml)	조에티스	-	진통제 (1.1, 1.6, 2.2 & 2.8단계)
촉매기	선 메디컬	7110	순간접착제의 구성 요소 (1.3.1단계)
카테터 (ID 0.31 OD 0.64 mm)	프로이덴베르크	228-0661	투명 카테터 (2.1.1단계)
코스톰이 티슈 후크를 만들었다	-	-	티슈 훅 (2.3.4단계)
면 팁	-	-	면 팁 (1.1.8, 1.2.4 & 1.5.1.)
커버 유리	워너 악기	64-0724	두개골 창문 덮개 유리 (1.4.2단계)
맞춤 제작 마우스 헤드바	-	-	영상 홀더용 헤드바 (Step 1.3.2)그리고 nbsp;
맞춤 제작된 마우스 이미징 홀더;	-	-	이미징 마우스 홀더 (Step 1.4.1. & 3.1.1.)
맞춤형 입체 정치 프레임	-	-	입체정위 프레임 (Step 1.1.7.)
치과 카멘트 액체	쿨처	64707937	치과 시멘트의 구성 요소 (Step 1.3.3.)
치과 시멘트 가루	쿨처	64707945	치과 시멘트의 구성 요소 (Step 1.3.3.)
치과 드릴	새신	그리고 nbsp; L-206	드릴 (1.4.3단계)
덱사메타손 (4 mg/ml)	센트라팜	-	수술 전 약물 투여 (Step 1.1.4).
박리 겸자	브라운-아스쿨라프	BD023R	겸자 (Step 1.2.2. & 2.3.2.)
드릴 버 비트 PK/100,5 (0.5mm)	순수 과학	19007-05	드릴 비트 (1.4.3단계)
듀라테아르 (3.5g)	알콘	-	눈 연고 (1.1.8단계 & 2.2.7.)
에폭시 글루 (1g)	패텍스	9H PSMG3X	에폭시 접착제 (Step 1.5.2. & 2.1.1.)
미세 겸자 직선	정밀 과학 도구	듀몽 #5	미세 겸자 (Step 2.6.6)
FITC-덱터런 (70 KDa)	시그마-올드리치	FD70S	FITC-덱터른 해법 (2.5.2단계)
이소플루란 (1000 mg/g)	라보라토리오스 카리주 S.A.	118938	마취 (Step 1.1.6. & 2.2.5.)
대형 3D 형광 영상 크라이오미세토미 & nbsp;	맞춤 제작	-	large-3D-FICS (4.3.3단계)
리도카인 (100 mg/ml)	아스펜	-	국소 마취 (Step 1.2.3. & 2.2.10)
마이크로 가위 바나 3-3/8인치	브라운-아스쿨라프	OC498R	마이크로 가위 (Step 2.6.2)
둥근 손잡이가 달린 미세 봉합사 겸자 묶기	브라운-아스쿨라프	FD280R	마이크로포셉스 (Step 2.3.3.)
미세 봉합사 묶기 원형 손잡이 구부러진 상태에서	브라운-아스쿨라프	FD281R	마이크로포셉스 벤처 (1.5.1 & 2.3.3.)
미세 혈관 클립	브라운-아스쿨라프	FD562R	용기 클립 (2.6.1단계)
마이크로 카테터 (ID 0.23114 mm 외경 0.27432 mm)	마이크로루멘		미세카테터 (2.1.1단계)
마우스 온열 패드와 직장 탐침	스톨팅	53800R	온열 패드 (1.1.2단계 & 2.2.2.)
NG2-Ds레드 마우스	잭슨 연구소, 바 하버, 미국 재고 번호 008241
폴리에틸렌글리콜 소르비탄 모노라우레이트	시그마-올드리치	9005-64-5	트윈20 (2.5.2단계)
폴리스티렌 플루어스피어 블루 (365/415)	인비트로젠	F8829	파란색 미소구 (2.5.1단계)
폴리스티렌 플루어스피어 레드 (580/605)	인비트로젠	F8834	적색 미시구(Step 2.5.1)
회수 케이지	-	-	회복 케이지 (1.6.2단계 & 2.8.2.)
봉합이 포함된 3/8 곡선 바늘(12mm) 역절단	브라운	0762067	봉합 (2.7.5단계)
로피바카&이움; Ne (2 mg/ml)	-	-	약물 및 nbsp; (1.1.5단계)
소형 3D 형광 영상 크라이오미세토름   그리고 nbsp;	맞춤 제작		스몰-3D 픽스 (4.2.2단계)
스폰고스탄	에티콘	MS0005	스폰고스탄 (1.4.6단계)
외과용 현미경	유로멕스 마이크로스코펜 B.V.	뉴질랜드 1903-B	수술용 현미경 (Step 1.2. 2.1.1.)
외과용 가위	브라운-아스쿨라프	BC303R	수술용 가위 (Step 1.2.2. & 2.3.2.)
주사기 펌프 (1ml 주사기용)	하바르드 장치	70-2208	1ml 주사기 펌프 (2.5.6단계)
실, 100m   4/0 1.5 & nbsp; 그리고 nbsp;	브라운	F1134035	4/0.15 스레드 (Step 2.4.3.)
TIE2-GFP 마우스	잭슨 연구소, 바 하버, 미국 재고 번호 003658
울트라 퓨어 더스터	토를랩	CA6-EU	압축 공기 (1.2.5단계)
유니버설 폴리머 클리어	선 메디컬	T058E	순간접착제의 구성 요소 (1.3.1단계)