방법 논문

표준 현미경 및 비디오 분석을 사용한 제브라피쉬 배아의 기능적 심장 영상: 환경 및 생물 의학 연구에서의 응용

DOI:

10.3791/68941

⸱

2025년 10월 10일

 ,  ,  ,  , 
1Medical Faculty, Department of Pathophysiology, University of Belgrade, 2Faculty of Electronic Engineering, University of Nis

이 논문에서

정오 공지

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요약

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이 프로토콜은 제브라피쉬 배아의 심장 형태 및 기능을 평가하기 위한 저비용 광학 현미경 방법을 설명하여 고급 이미징 시스템 없이도 발달 심장 독성을 재현 가능하게 평가할 수 있습니다.

초록

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제브라피쉬(Danio rerio)는 인간과의 유전적 유사성, 초기 발달 동안의 광학적 투명성 및 생체 내 이미징에 대한 적합성으로 인해 심혈관 연구에서 척추동물 모델로 널리 사용됩니다. 이 원고는 명시야 광학 현미경을 사용하여 수정 후 96시간(hpf)에 제브라피쉬 배아의 심장 형태 및 기능을 평가하기 위한 표준화되고 접근 가능한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법에는 배아 수집, 형태학적 스크리닝, 아가로스 고정, 박동하는 심장의 비디오 녹화, 심실 치수, 박출량, 심박수, 박출률 및 심박출량과 같은 심장 매개변수의 이미지 기반 분석이 포함됩니다. 계산은 오픈 소스 소프트웨어(예: ImageJ, Zembryo Analyzer)를 사용하여 심실의 기하학적 근사치를 기반으로 합니다. 이 프로토콜은 널리 사용 가능한 장비를 사용하여 심장 성능을 정량적으로 평가할 수 있으므로 자원이 제한되어 있고 처리량이 많은 검사가 필요한 실험실에 적합합니다. 본 연구에서는 96hpf 제브라피쉬 유충을 광학 현미경으로 박동하는 심장을 기록하여 분석하였다. 측정된 주요 심장 매개변수에는 분당 박동수로 결정되는 박출량과 심박수를 계산하는 데 사용되는 심실 치수가 포함되었습니다. 이로부터 박출률과 심박출량을 도출하여 전반적인 심장 성능을 평가했습니다. 건강한 배아의 대표적인 결과는 일관된 심실 수축과 강력한 기능 지표를 보여주는 반면, 카드뮴에 노출된 배아는 심장 형태가 손상되고 심박출량이 크게 감소했습니다. 전반적으로 이 방법은 발달 심장 독성을 감지하는 데 중요하며 초기 제브라피쉬 발달 동안 생체 내 심장 기능을 평가하기 위한 재현 가능한 비침습적 접근 방식을 제공합니다.

서론

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제브라피쉬(Danio rerio)는 인간과의 유전적 상동성, 외부 수정, 배아의 광학적 투명성 및 빠른 발달로 인해 심혈관 연구에서 저명한 척추동물 모델 유기체로 부상했습니다 1,2. 비용 효율성 및 확장성과 결합된 이러한 특징으로 인해 제브라피쉬는 초기 심장 형태 형성, 선천성 심장 결함 및 발달 심장 독성 연구에 특히 적합합니다3. 이들의 관련성은 척추동물 종 전반에 걸쳐 심장 발달을 조절하는 유전자 및 신호 전달 경로의 높은 보존에 의해 더욱 강화됩니다4. 특히, 제브라피쉬 모델은 정상 및 병리학적 조건 모두에서 심장 형성, 리모델링 및 기능의 유전적, 생리학적 기초를 이해하는 데 크게 기여했습니다 5,6.

구조적으로 제브라피쉬 심장은 단일 심방과 단일 심실로 구성되어 있으며 선형 방식으로 연결되어 포유류 4방 심장의 전형적인 중격이 없습니다. 그럼에도 불구하고 제브라피쉬 심장은 심내막 및 심근층의 존재, 심장 전도 시스템, 리드미컬한 수축 활동 및 신경 호르몬 인자에 의한 조절을 포함하여 인간 심장 생리학의 주요 측면을 요약합니다 7,8. 중요한 것은 제브라피쉬 심장이 인간 배아 발달과 유사한 심관의 오른쪽 루프와 그에 따른 심실의 확장 및 묘사를 포함하여 주요 형태 발생 사건을 나타낸다는 것입니다9. 또한, 제브라피쉬 심장은 활동 전위 전파, 수축성 조절 및 칼슘 순환 역학을 포함하여 고등 척추동물에서 볼 수 있는 많은 전기생리학적 및 혈역학적 특성을 유지합니다7.

이러한 유사성을 감안할 때 제브라피쉬는 독성학, 특히 화학 물질 노출이 심장 발달 및 기능에 미치는 영향을 평가하는 데 중추적인 모델로 부상했습니다10. 그러나 이 분야의 주요 한계 중 하나는 기술적으로 까다로운 이미징 기술에 대한 의존도입니다. 공초점 또는 라이트 시트 현미경 또는 형광 심장 마커를 발현하는 형질전환 라인과 같은 기존의 고해상도 방법은 강력하지만 비용이 많이 들고 상당한 기술 인프라가 필요합니다11. 이러한 제약은 특히 자원이 제한된 환경이나 고처리량 스크리닝이 필요한 응용 분야에서 제브라피쉬 기반 심장 표현형의 광범위한 구현을 제한합니다12.

따라서 널리 사용 가능한 장비를 사용하여 심장 기능을 신뢰할 수 있는 평가를 가능하게 하는 방법론적 접근 방식에 대한 필요성이 커지고 있습니다. 기존 문헌에는 수동 또는 반자동 측정과 결합된 명시야 또는 광학 현미경 기반 이미징을 포함하여 이러한 단순화된 방법의 예가 포함되어 있습니다13,14. 그러나 이러한 기술이 항상 표준화되는 것은 아니며 프로토콜, 타이밍 및 이미지 분석 매개변수 측면에서 연구 그룹마다 다른 경우가 많습니다. 이러한 가변성은 재현성을 방해하고 연구 전반에 걸쳐 비교 가치를 제한하며, 특히 정량적 심혈관 종점이 발달 안전성의 지표로 점점 더 많이 사용되는 배아 독성학, 약리학 또는 생태독성학과 같은 분야에서 더욱 그렇습니다15.

이러한 맥락에서 제브라피쉬는 생체 내에서 발달 심장 독성을 스크리닝하기 위한 귀중한 모델을 제공합니다. 규제 기관과 과학 컨소시엄은 특히 구조적 기형이나 치사율에 선행할 수 있는 심장 기능의 미묘한 변화를 감지할 수 있는 능력을 고려할 때 이 분야에서 제브라피쉬의 관련성을 점점 더 인식하고 있습니다14. 투명한 배아를 사용하면 박동하는 심장을 직접 시각화할 수 있어 침습적 시술 없이도 심장 성능을 실시간으로 평가할 수 있습니다. 또한, 제브라피쉬 심장 해부학의 단순성은 기본 이미징 기술15를 사용하여 챔버 치수 및 뇌졸중 매개변수를 포함한 심방 및 심실 역학의 정량화를 용이하게 합니다.

이 기사에 설명된 방법의 가장 중요한 목표는 표준 광학 현미경을 사용하여 제브라피쉬 배아 심장 성능의 형태 기능 평가를 위한 접근 가능하고 재현 가능한 접근 방식을 제공하는 것입니다. 간단한 비디오 획득과 사후 이미지 분석에 초점을 맞춤으로써 이 기술은 고해상도 이미징과 정성적 관찰 채점 사이의 방법론적 격차를 메우는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 다양한 실험실 환경과 자원 수준에 적용할 수 있으며 특히 심장 기능 평가에 초점을 맞춘 독성학적, 약리학적 또는 유전 연구에 적용할 수 있습니다.

실용적인 이점 외에도 이 프로토콜은 일반적으로 사용되는 기술을 재현 가능한 단일 파이프라인으로 결합하는 통합된 단계별 워크플로를 제공함으로써 현장에 기여합니다. 유사한 접근 방식이 문헌에 존재하지만 시각적 문서와 이러한 수준의 통합을 제공하는 것은 거의 없으며, 이는 더 광범위한 채택 및 표준화를 지원할 수 있습니다.

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프로토콜

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제브라피쉬 배아와 관련된 모든 절차는 지역 윤리 위원회가 승인한 기관 동물 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었습니다. 제브라피쉬 사육 및 배아 조작은 과학적 목적으로 사용되는 동물 보호에 관한 유럽 지침 2010/63/EU에 따라 수행되었습니다. 본 연구에 사용된 시약과 장비는 재료표에 나와 있습니다.

1. 제브라피쉬 유지 관리 및 배아 채취

  1. 성체 제브라피쉬(Danio rerio)를 재순환 수족관 시스템에서 28°C± 14시간 빛/10시간 암흑 주기에서 유지합니다.
  2. 제브라피쉬에 적합한 고단백 상업용 플레이크 또는 과립 사료로 하루에 세 번 물고기에게 먹이를 주세요.
  3. 늦은 오후에 성체 제브라피쉬를 투명 메쉬가 장착된 번식 수조로 옮겨 수조 바닥에서 물고기를 분리합니다. 2:3의 남성 대 여성 비율을 사용하고 탈착식 칸막이로 밤새 분리합니다.
  4. 다음날 아침에 칸막이를 제거하고 50-100mL의 차가운 수족관 물을 추가하여 산란을 촉발합니다.
  5. 수정 후(30-60분 이내) 배아의 포식을 방지하기 위해 번식 수조에서 성체를 제거합니다.
  6. 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 배아를 수집하고 E3 배아 배지로 채워진 멸균 페트리 접시로 옮깁니다.
    참고: E3 배아 배지는 제브라피쉬 세포외액의 이온 조성을 모방하는 완충 염 용액입니다. 약 800 mL의 초순수 증류수에 580 mg의 NaCl, 27 mg의 KCl, 97 mg의 CaCl2·2H2O 및 163 mg의 MgCl2·6H2O를 용해시켜 E3 배지를 제조한다. 1N NaOH 또는 HCl을 사용하여 pH를 7.2로 조정합니다. pH가 조정되고 안정되면 증류수로 총 부피를 1,000mL로 만듭니다. 0.22μm 멤브레인 필터를 통해 용액을 여과하여 멸균합니다. 곰팡이 성장을 방지하기 위해 리터당 100μL의 1% 메틸렌 블루를 첨가합니다. 준비된 E3 배지를 4°C에 보관하고 사용하기 전에 실온으로 데우십시오.
  7. 제어된 빛/암흑 주기(14시간/10시간)로 인큐베이터에서 28.5°C에서 배아를 배양합니다.
    참고: 저산소증 및 발달 결함을 유발할 수 있는 과밀을 방지하기 위해 페트리 접시당 배아 수(예: 100mm 접시당 50개)를 제한하십시오.
  8. 최적의 발달 조건을 유지하기 위해 매일 E3 배지를 교체하십시오.

2. 형태학적으로 정상적인 배아의 선택

  1. 수정 후 약 6시간(hpf; 수정 후 경과 시간)에 수정된 배아를 신선한 E3 배지가 들어 있는 깨끗한 페트리 접시로 옮깁니다.
  2. 40배 배율의 실체 현미경으로 배아를 검사합니다.
  3. 다음을 포함하여 발달 이상의 징후를 보이는 배아는 모두 폐기하십시오.
    1. 응고된 배아: 불투명하거나 흰색의 외관, 입상 질감, 구별 가능한 내부 구조의 부재로 식별합니다. 응고는 생존 불능의 징후이며 일반적으로 수정 후 처음 몇 시간 이내에 발생합니다.
    2. 발달 지연: 예상되는 형태학적 단계(예: 외피 부족 또는 불규칙한 세포 배열)로 진행되지 않은 배아를 제외하여 생존 능력 장애를 시사합니다.
    3. 난황낭 이상: 발달 결함이나 삼투압 불균형을 나타낼 수 있는 파열, 불규칙 또는 비대칭 난황낭을 찾으십시오.
    4. 외부 기형: 몸축이 뒤틀리거나 세포 질량 분포가 불규칙하거나 융모막의 비정상적인 모양이 있는 배아를 제외합니다.
    5. 융모막 무결성 불량: 융모막이 무너지거나 쪼그라들거나 파열된 배아는 기계적 또는 삼투압 스트레스를 받을 수 있으므로 사용하지 마십시오.
  4. 다음 기준을 모두 충족하는 배아만 보유합니다: (1) 투명하고 대칭적인 체형, (2) 부드러운 세포 층층을 통한 균일한 epiboly 진행, (3) 명확하게 보이는 배반엽 및 온전한 구형 융모막.
    참고: 6 hpf에서 형태학적으로 정상적인 제브라피쉬 배아는 난황의 상단을 감싸고 명확하게 정의된 배반엽이 있는 돔 모양입니다. 세포질은 입상 얼룩 없이 고르게 분포되어야 하며 단편화나 응집의 징후 없어야 합니다.

3. 광학 현미경을 이용한 심장 영상

  1. 96hpf에서 E3 배지로 채워진 35mm 유리 바닥 페트리 접시에 배아를 개별적으로 장착합니다.
  2. E3 배지에서 1.2% 저융점 아가로스를 준비하고 37-38°C로 예열합니다. 열 블록이나 수조를 사용하여 온도를 유지하십시오.
  3. 각 배아를 아가로스에 매립하고 아가로스가 응고되기 전에 미세한 집게를 사용하여 측면으로 부드럽게 방향을 잡습니다.
    알림: 심방과 심실이 동일한 초점면에 있는 상태에서 심장이 명확하게 보이고 측면을 향하고 있는지 확인하십시오.
  4. 디지털 카메라가 장착된 도광현미경을 사용하여 제브라피쉬 배아의 심장 부위에 특별히 초점을 맞춘 30초 고해상도 비디오를 녹화합니다. 40× 또는 100× 배율로 비디오를 캡처하여 심장 구조와 심장 박동을 명확하게 시각화합니다.
    1. 비압축 또는 최소 압축 형식(예: AVI 또는 MOV)으로 초당 30프레임(fps)의 프레임 속도로 비디오를 녹화하여 이미지 품질을 유지하고 심장 운동 역학을 정확하게 분석할 수 있습니다. 이 설정을 통해 심박수, 수축 리듬 및 챔버 형태와 같은 기능적 매개변수를 자세히 평가할 수 있습니다.

4. 심장 기능의 영상 분석 및 측정

  1. ImageJ의 수동 측정
    1. 비디오 가져오기. 파일 > 가져오기 > AVI를 사용하여 ImageJ에서 비디오를 엽니다. 필요한 경우 이미지 > 스택 > 이미지를 스택으로 변환을 통해 비디오를 이미지 스택으로 변환합니다.
    2. 측정 스케일을 보정합니다. 분석 > 스케일 설정을 사용하고, 알려진 필드 직경(예: 10× 대물렌즈의 경우 4mm)을 입력하고, 전역 옵션을 활성화하여 모든 측정에 스케일을 적용합니다.
    3. 관심 영역(ROI)을 정의합니다. ROI 도구(선, 다각형, 직사각형)를 사용하여 수축기말 및 이완기말 동안 긴 심실축과 짧은 심실축을 표시합니다(그림 1). Analyze > Tools > ROI Manager를 통해 ROI를 관리합니다.
  2. 기능 매개변수 계산을 위한 직경 및 면적 측정(보충 파일 1)
    1. 방정식 1을 사용하여 심실 표면적(타원 근사 사용)을 결정합니다.
      VA = ((D_L - D_S)/2) × π (1)
      여기서 DL = 긴 직경, DS = 짧은 직경.
    2. 타원체 부피 공식을 사용하여 ED 및 ES에서 심실 부피를 추정합니다(방정식 2).
      VV = (1/6) × π × D_L × D_S² (2)
    3. 방정식 3 및 방정식 4를 사용하여 분수 면적 변화(FAC) 및 분수 단축(FS)을 계산합니다.
      FAC(%) = ((VAD - VAS) / VAD) × 100 (3)
      FS (%) = ((D_L - D_S) / D_L) × 100 (4)
      여기서 VAD = 응급실의 심실 면적; VAS = ES의 심실 면적; DDL = ED의 장축; DSS = ES에서 단축.
    4. 방정식 5를 사용하여 박출량(SV)을 결정합니다.
      SV = VVD - VVS (5)
    5. 방정식 6을 사용하여 박출률(EF)을 계산합니다.
      EF(%) = (SV / VVD) × 100 (6)
  3. ZembryoAnalyzer의 자동 분석
    1. 캡처한 비디오를 실행하고 로드합니다. ZembryoAnalyzer (사용 가능: https://github.com/darkopuflovic/ZembryoAnalyser)를 열고 파일 > 비디오 열기 를 사용하여 원하는 비디오를 가져옵니다.
    2. 자동 심장 영역 감지를 수행합니다. 하트 감지 버튼을 클릭하면 소프트웨어가 비디오 프레임 전체의 밝기 변동을 기반으로 관심 영역(ROI)을 자동으로 찾을 수 있습니다. 필요한 경우 직사각형, 타원 또는 다각형 도구를 사용하여 ROI를 수동으로 조정합니다.
    3. 자동 심박수 추정을 수행합니다. 소프트웨어가 감지된 ROI 내에서 밝기 변화를 분석하도록 합니다. 심박수는 주기적인 강도 피크를 식별하여 계산됩니다. 이 알고리즘은 임계값 필터링을 적용하여 노이즈와 오탐을 제거하여 정확한 비트 감지를 보장합니다.
    4. 결과를 내보냅니다. PDF로 내보내기 또는 Excel> 내보내기 를 사용하여 심박수 데이터 및 해당 강도 플롯> 내보냅니다. 선택적으로 다운스트림 통계 처리를 위해 원시 데이터를 CSV 또는 JSON 형식으로 저장합니다.
  4. 방정식 7을 사용하여 심박출량(CO)을 계산합니다.
    CO = SV × HR (7)

5. 독성물질을 이용한 심장독성 시험의 프로토콜 적용 가능성 평가

  1. 염화카드뮴의 무게를 측정하고 최종 농도 3mg/L가 되도록 E3 배지에 직접 용해시켜 작업 용액을 준비합니다.
  2. 배아를 수정 후 24시간(hpf)에 카드뮴 용액을 포함하는 페트리 접시로 옮깁니다.
  3. 14시간의 빛/10시간의 암흑 주기로 28°C± 1°C에서 96hpf까지 카드뮴 용액에서 배아를 배양합니다.
  4. 일관된 노출을 유지하기 위해 카드뮴 용액을 매일 교체하십시오.
  5. 96hpf에서 심장 기능 매개변수의 후속 측정 및 분석을 위해 이전에 설명한 대로 배아의 고해상도 심장 비디오를 기록합니다.
    참고: 이전 연구16에서 설명한 바와 같이 이 카드뮴 노출 프로토콜을 사용하여 제브라피쉬 배아의 발달 심장 독성을 시뮬레이션합니다.

6. 데이터 관리 및 복제

  1. 구조화된 스프레드시트에 모든 측정값을 기록합니다. 배아 ID, 치료 그룹 및 계산된 모든 매개변수를 포함합니다.
  2. 통계적 신뢰성을 위해 그룹당 최소 20-30개의 배아를 분석하는지 확인하십시오.
    참고: 심장 부위의 비디오 녹화는 형태 측정 또는 기능 측정의 정확성을 손상시키지 않고 나중에 저장 및 분석할 수 있습니다. 내부 비교에서 즉시 및 지연 분석 결과는 주요 심장 매개변수 전반에 걸쳐 일관되어 지연된 비디오 기반 평가의 재현성을 뒷받침했습니다.

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결과

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이 프로토콜은 심실 크기, 수축성, 박출량 및 박출률과 같은 구조적 및 기능적 매개변수를 포함하여 수정 후 96시간(hpf)에 제브라피쉬 심장 발달의 정량적 분석을 허용합니다.

그림 2 는 이완기(ED) 및 수축기말(ES)에서 제브라피쉬 심실의 대표적인 명시야 이미지와 평균 심실 면적(VA) 및 부피(VV) 측정값(n = 30 배아)을 표시하는 해당 막대 그래프를 보여줍니다. 심실은 타원체 모양으로 나타나고 리드미컬한 수축을 나타내며 심장 기능을 정량화할 수 있는 ED와 ES 사이의 명확한 치수 차이가 있습니다. ED에서 평균 VA와 VV는 각각 0.017mm² ± 0.002mm² 및 0.0005mm² ± 0.0001mm³였습니다. ES에서 VA와 VV는 0.012mm²± 0.002mm² 및 0.0003mm³로 감소하여 정상적인 발달 조건에서 효과적인 심실 수축을 반...

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토론

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이 프로토콜의 중요한 단계 중 하나는 수정 후 6시간(hpf)에 형태학적으로 정상적인 배아를 정확하게 식별하고 선택하는 것입니다. 응고, 발달 지연 또는 구조적 이상의 징후를 보이는 배아는 심혈관 측정의 일관성과 해석 가능성을 크게 손상시킬 수 있습니다. 생존 불가능하거나 기형의 배아를 조기에 제거하면 심장 발달 및 기능을 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 기준선이 보장됩니다. 이미징 중 배아의 적절한 방향을 지정하고 심장이 명확하게 보이는 측면 위치를 보장하는 것은 재현 가능하고 해석 가능한 결과를 얻는 데에도 똑같이 중요합니다.

이 프로토콜은 심장 주기의 고대비, 고프레임 속도 이미징에 의존한 다음 Zembryo Analyzer16과 같이 무료로 사용할 수 있는 소프트웨어를 사용하여 이미지 기반 형태 측정 분석에 의존합니다. 이 플랫폼을 사용하면 심실 치수, 수축성 지수, 박출...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 작업은 2025년 연구 활동의 구현 및 자금 조달을 위해 베오그라드 대학교 의과대학과의 기관 자금 지원 계약을 통해 세르비아 공화국 과학기술개발혁신부의 자금 지원을 받았습니다. 2025년 기관 자금 조달 계약 등록 번호는 451-03-137/2025-03/200110입니다. 승인된 하위 프로젝트에서 발생하는 모든 출판물의 승인에 이 번호가 포함되기를 요청합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.22 & 마이크로; m 막 필터밀리포어SLGP033RS0.22 & 마이크로; m 막 필터
1 N HCl 용액시그마-올드리치320331pH 조절을 위한 염산 용액
1 N NaOH 용액시그마-올드리치72068pH 조절을 위한 수산화나트륨 용액
성체 제브라피시 (Danio rerio)지역 번식 시설해당 없음모델 유기체
메쉬가 있는 번식 수조//산란을 위한 성체 분리
CaCl?· 2H? O시그마-올드리치C5670염화칼슘 이하이드레이트, 시약 등급
염화카드뮴시그마-올드리치202908노출 시 3 mg/L 시 사용되는 독성 물질
상업용 제브라피시 사료미니 그랜, 누트리 펫, 고르니 밀라노박/제브라피시에 적합한 고단백 플레이크 또는 과립 사료
디지털 카메라 (현미경)하마마츠 포토닉스ORCA-플래시4.0 V330fps 비디오 녹화용 카메라
히트 블록에펜도르프5382000010온도 제어 난방 장치
ImageJ 소프트웨어NIHhttps://imagej.nih.gov/ij/오픈 소스 이미지 처리 소프트웨어
역광 현미경니콘Ti2-E디지털 카메라가 장착된 현미경, 40시간 이상; 그리고 100번; 목표
KCl시그마-올드리치P3911염화칼륨, 시약급
저녹는점 아가로스 (1.2%)써모피셔 사이언티브16520050배아를 삽입하기 위해
메틸렌 블루 (1%)시그마-올드리치M9140E3 배지에 첨가된 항진균제
MgCl?· 6H? O시그마-올드리치M9272염화마그네슘 육수화물, 시약 등급
나클시그마-올드리치S9888염화나트륨, 시약 등급
멸균 페트리 접시 (100 mm)코닝430167배아 배양용 플라스틱 페트리 접시
멸균 페트리 접시 (35mm)맷텍 코퍼레이션P35G-1.5-14-C배아 장착용 유리 바닥 페트리 접시
초순수 증류수밀리포어밀리-Q 참조용액 제제를 위한 물
ZembryoAnalyzer 소프트웨어GitHub (Darko Puflovic)https://github.com/darkopuflovic/ZembryoAnalyser심장 기능 분석 소프트웨어

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patton, E. E., Zon, L. I., Langenau, D. M. Zebrafish disease models in drug discovery: from preclinical modelling to clinical trials. Nat RevDrug Discov. 20 (8), 611-628 (2021).
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  7. Echeazarra, L., Hortigón-Vinagre, M. P., Casis, O., Gallego, M. Adult and developing zebrafish as suitable models for cardiac electrophysiology and pathology in research and industry. Front. Physiol. 11, 607860(2021).
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Formal Correction: Erratum: Functional Cardiac Imaging in Zebrafish Embryos Using Standard Microscopy and Video Analysis: Applications in Environmental and Biomedical Research
Posted by JoVE Editors on 2/09/2026. Citeable Link.

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