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방법 논문

생체 내 애벌레 제브라피쉬에서 시상하부 펩티더성 뉴런의 전체 세포 패치 클램프 기록

780 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68943

⸱

2025년 8월 22일

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Shanghai University, 2Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 기사에서는 온전한 유충 제브라피쉬에서 전체 세포 패치 클램프 전기생리학을 사용하여 시상하부 펩티더성 뉴런의 전기적 활동을 생체 내 기록하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

시상하부는 수면과 각성, 식욕, 에너지 항상성, 불안, 우울증, 사회적 상호 작용 등 생리학과 행동의 다양한 측면을 조절하는 고대 뇌 영역입니다. 시상하부의 특정 신경 집단은 신경 전달 물질과 신경펩타이드의 방출 을 통해 효과를 발휘합니다. 전체 세포 패치 클램프 기록은 시냅스 전달 및 뇌 기능에서 이러한 요인의 역할을 연구하는 데 없어서는 안 될 접근 방식입니다. 그러나 뇌 깊숙한 위치에 있기 때문에 온전한 포유류의 전기생리학적 기록을 위해 시상하부 뉴런에 접근하는 것은 어렵습니다. 결과적으로 시상하부 뉴런의 내재적 특성과 생리적 기능에 대한 우리의 이해는 제한적입니다. 유충 제브라피쉬는 투명하고 작지만 잘 보존된 척추동물 뇌로 인해 시상하부 뉴런을 연구하는 데 유용한 대체 모델입니다. 여기에서 우리는 온전한 유충 제브라피쉬에서 시상하부 뉴런의 생체 내 전체 세포 패치 클램프 기록을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술을 사용하여 시상하부의 펩티더성 뉴런을 기록하고, 감각 자극에 대한 이러한 뉴런의 반응을 조사하고, 다운스트림 뉴런에 미치는 영향을 탐색할 수 있습니다. 따라서 이 실험 기술은 온전한 동물에서 시상하부 신경펩티더성 뉴런의 생리적 기능을 연구하는 데 유용한 접근 방식을 제공합니다.

서론

인기 있는 척추동물 모델인 제브라피쉬(Danio rerio)는 신경과학 연구에 널리 사용되며 몇 가지 장점이 있습니다1. 유전자와 뇌 구조의 보완은 포유류에서 고도로 보존되어 있으며 풍부한 행동 레퍼토리를 가지고 있어 수면, 불안, 우울증 및 사회적 상호 작용과 같은 행동의 기초가 되는 유전 및 신경 메커니즘을 연구하는 데 유용합니다 2,3,4,5,6 . 크기가 작고 유지 관리 비용이 낮기 때문에 신경정신 질환 치료를 목표로 하는 유전자 또는 약물의 고처리량 스크리닝에 이상적입니다 7,8. 마지막으로, 고급 라이트 시트 현미경 기술과 결합된 유충 제브라피쉬의 광학적 투명성과 여러 형광 리포터의 가용성은 전체 뇌 9,10,11에 걸쳐 세포 해상도로 신경 및 성상 신경교세포 활동을 모니터링하는 데 특히 적합합니다.

복부 간뇌 깊숙한 곳에 위치한 제브라피쉬 시상하부는 해부학적, 분자적으로 포유류 시상하부와 보존되어 있지만 2-3배 더 작아 시상하부 기능을 연구하는 더 간단한 시스템을 제공합니다12. 시상하부 뉴런은 시상, 뇌간, 뇌하수체 및 종뇌를 포함한 여러 뇌 영역과 광범위한 시냅스 연결을 형성하여 생리적 항상성, 신경내분비 신호 전달 및 자율신경 행동을 조절합니다13,14. 이러한 행동 및 생리학의 조절은 주로 G-단백질 결합 수용체(GPCR)에 결합하여 작용하는 단쇄 아미노산인 신경펩타이드에 의존합니다15. 시냅스에서 빠르게 작용하는 아미노산 신경 전달 물질 방출과 달리 신경펩타이드는 부피 전달을 통해 더 먼 거리로 확산될 수 있으며 시냅스 전달 및 신경 흥분성에 대한 느린 조절 효과를 매개할 수 있습니다16.

제브라피쉬에 대한 최근 연구에서는 전뇌 칼슘 이미징, 단일 세포 RNA 시퀀싱, 고처리량 행동 분석 및 신경 회로 매핑과 같은 다학제적 접근을 통해 시상하부 신경펩타이드의 다양한 기능을 밝혔습니다 4,12,17,18. 이러한 새로운 기술은 대규모로 세포 다양성을 특성화하고, 분자 메커니즘을 회로 수준 신경펩티드 기능과 연결하고, 특정 행동의 기초가 되는 신경 회로를 매핑하는 능력을 변화시켰습니다19,20. 그러나 이러한 접근법은 신경펩티드 기능의 기초가 되는 빠른 생리학적 역학과 정확한 시냅스 메커니즘을 해결하는 능력이 제한되어 있습니다.

Neher와 Sakmann이 개발한 패치 클램프 기술은 비교할 수 없는 시간적 분해능과 생물물리학적 정밀도로 인해 신경 생리학을 조사하기 위한 황금 표준으로 남아 있어 막 전위 변동, 시냅스 전류 및 이온 채널 역학을 직접 측정할 수 있습니다21,22. 이 기술은 특징적인 파열 패턴과 신경 조절 영향으로 인해 행동 및 항상성에서의 역할을 완전히 이해하기 위해 직접적인 전기생리학적 측정이 필요한 신경펩티드성 세포를 연구하는 데 특히 매우 중요합니다 15,16,23.

여기에서 우리는 이러한 뉴런의 깊은 해부학적 위치로 인한 기술적 문제에도 불구하고 유충 제브라피쉬 시상하부 펩티더성 뉴런의 신뢰할 수 있는 전체 세포 패치 클램프 기록을 가능하게 하는 최적화된 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법론은 이러한 세포의 전기적 활동에 대한 직접적인 접근을 제공하여 시각 및 청각 자극에 대한 반응에 대한 자세한 조사를 가능하게 합니다(그림 1). 패치 클램프 전기생리학과 광유전학을 통합함으로써 시상하부 회로와 다운스트림 뉴런 사이의 기능적 연결성을 정확하게 특성화할 수 있으며(그림 2 및 그림 3) 생리학적 항상성 및 행동 제어에서 신경펩타이드 연구를 용이하게 합니다. 이 접근 방식은 신경과학 연구의 중요한 격차를 해소하여 생물물리학적, 세포 및 회로 수준에서 시상하부 뉴런 기능을 동시에 기계론적으로 탐색할 수 있도록 합니다.

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프로토콜

모든 실험은 상하이 대학의 기관 관리 및 사용 위원회(IACUC)(동물 프로토콜 YS 2025-169)와 캘리포니아 공과대학의 IACUC(동물 프로토콜 1836)의 승인을 받았습니다. 수정 후 5일에서 7일(dpf)의 제브라피쉬에게 윤충을 먹여 실험에 사용했습니다. 이 발달 단계에서는 성별이 결정되지 않습니다. 진주층 [mitfa(w2/w2)] 배경24 의 성체 제브라피쉬를 번식에 사용했습니다.

1. 솔루션 및 레시피

  1. 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 및 0.33 mM MgSO4를 포함하는 E3 배지를 준비합니다. NaOH로 용액을 pH 7.2로 조정합니다. 1개월 이내에 사용할 수 있도록 실온에서 보관하십시오.
  2. 134mM NaCl, 2.9mM KCl, 2.1mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2, 10 mM HEPES 및 10 mM 포도당을 포함하는 세포외 용액을 준비합니다. 세포외 용액의 삼투압은 ~290mOsmol L-1입니다. NaOH로 용액을 pH 7.8로 조정합니다. 1개월 이내에 사용하려면 4°C에서 보관하십시오.
  3. 100mM K-글루콘산염, 10mM KCl, 2mM CaCl2, 2mM Mg-ATP, 0.3mM Na-GFP, 10mM HEPES 및 10mM EGTA를 포함하는 세포내 용액을 준비합니다. 세포내 용액의 삼투압은 ~280 mOsmol L-1입니다. KOH로 용액을 pH 7.4로 조정합니다. 내부 용액 100μL를 미세분리기 튜브에 분취하고 1년 이내에 사용할 수 있도록 -20°C에서 보관합니다.
    참고: 장기간 안정적인 기록을 위해 Mg-ATP 및 Na-GTP를 추가하는 것이 좋습니다. 세포내 용액은 밀봉 형성을 손상시키거나 피펫 막힘을 유발할 수 있는 미립자 및 미생물 오염 물질을 제거하는 0.22μm 멤브레인을 통해 여과해야 합니다.
  4. α-방가로톡신: 1mg의 α-방가로톡신을 1mL의 E3 배지에 최종 농도 1mg/mL로 녹입니다. 용액 20μL를 미세분리기 튜브에 분취하고 1년 이내에 사용하기 위해 -20°C에서 보관합니다.
  5. 저융점 아가로스: 유리병에 담긴 E3 배지 50mL에 아가로스 0.75g을 최종 농도 1.5%로 용해시킵니다. 아가로스가 녹고 용액이 투명하고 균질하게 나타날 때까지 혼합물을 전자레인지에 가열합니다. 녹인 아가로스를 수조에서 42-45°C로 유지하여 1개월 이내에 사용하십시오.

2. 제브라피쉬 준비 및 해부

  1. 원하는 이식유전자, 예를 들어 Tg(hcrt:RFP) 물고기25를 포함하는 단일 수컷 및 암컷 성체 물고기를 짝짓기 탱크에 넣고 밤새 투명한 칸막이로 분리합니다. 둘째 날 아침에는 물고기가 번식할 수 있도록 칸막이를 제거합니다. 수조 바닥에서 수정된 배아를 수집하고 이른 오후까지 성체 물고기를 집 수조로 돌려보냅니다.
  2. 0.0005% 메틸렌 블루를 포함하는 E3 배지와 함께 직경 9cm의 페트리 접시에서 배아를 키웁니다. 배아를 28.5°C의 인큐베이터에 14:10시간의 밝음:암흑 주기로 넣습니다. E3 솔루션을 매일 변경하십시오.
    참고: E3 배지의 메틸렌 블루는 수정 후 3일(dpf)까지 곰팡이 성장을 방지하는 데 사용되지만, 메틸렌 블루는 발달 후반 단계에서 세포 대사 및 미토콘드리아 기능에 영향을 미칠 수 있기 때문에 3dpf에서 E3 배지 단독으로 대체됩니다26.
  3. 약 3dpf에서 시작하는 최대 배율(~115x)으로 epi-fluorescence 입체 현미경으로 유충 물고기를 선별합니다. 분류를 용이하게 하기 위해 개별 물고기를 물방울(몸 크기보다 큼)에 넣으십시오. 3dpf 이상의 물고기의 경우 자발적인 운동 활동을 억제하기 위해 0.01% 트리카인을 함유한 E3 배지 3mL를 사용하여 물고기를 마취합니다. 시상하부에서 밝은 형광단 발현을 가진 유충을 수집합니다.
    알림: 트리카인을 다룰 때는 니트릴 장갑, 보안경, 실험실 가운을 착용하십시오. 과도한 트리카인은 동물 프로토콜에 따라 화학 폐기물로 폐기해야 합니다.
  4. 스크리닝 후, 즉시 E3 배지를 사용하여 트리카인을 씻어내고 이 유충을 인큐베이터에 다시 넣습니다. 실험 당일까지 5dpf에서 시작하여 페트리 접시에 윤충류가 포함된 ~5mL의 공급 용액을 추가합니다. E3 용액을 바꾸고 매일 물고기에게 윤충을 먹입니다.
  5. 5-7 dpf에서 건강해 보이고 활발한 이동을 보이는 유충 물고기를 수집합니다. 유리 피펫을 사용하여 작은 페트리 접시(직경 3.5cm)에 옮깁니다.
  6. 물고기 주변의 물을 제거하고 20μL의 1mg/mL α-bungarotoxin을 생선에 ~30초 동안 첨가합니다. 그런 다음 페트리 접시에 ~3mL의 E3 배지를 첨가하여 약물을 씻어냅니다.
    알림: α-방가로톡신을 취급할 때는 니트릴 장갑, 보안경 및 실험실 가운을 착용하십시오. 과도한 α-방가로톡신은 동물 프로토콜에 따라 화학 폐기물로 폐기해야 합니다.
  7. 페트리 접시를 알루미늄 호일로 덮어 생선을 어둠 속에 두었다가 점차 마비됩니다.
    참고: α-방가로톡신은 신경근 접합부에 특이적으로 작용하여 신경계에 영향을 주지 않고 물고기를 마비시키는 아세틸콜린 수용체 차단제입니다. 물고기는 마비 후에도 여전히 환경 자극을 감지할 수 있으며 뇌 기능은 정상입니다 9,27.
  8. ~15분 후 실체현미경을 사용하여 마비 여부를 확인하고 정상적인 심장 박동과 뇌와 신체의 강력한 혈액 순환을 보이는 마비된 물고기를 선택합니다.
  9. 물고기를 중앙에 직경 10mm의 구멍이 있고 구멍을 덮기 위해 바닥에 접착된 35mm 페트리 접시인 맞춤형 기록 챔버로 옮깁니다. 물을 제거하고 ~200μL의 1.5% 저융점 아가로스를 첨가합니다.
  10. 집게를 사용하여 아가로스에 물고기 등쪽을 위로 향하게 배치합니다(Dumont #5). 아가로스가 완전히 응고되면 세포외 용액을 첨가하여 아가로스를 덮습니다. 아가로스가 완전히 응고되는 데 5-10분이 걸립니다.
  11. 마이크로 나이프를 사용하여 물고기 머리 위의 아가로스를 자르고 제거합니다. 그런 다음 다음 단계에서 피펫이 뇌로 전진할 수 있도록 ~1μm 팁 개구부가 있는 유리 마이크로피펫을 사용하여 시신경 관상과 소뇌 사이의 뇌실 위 피부에 작은 절개를 합니다.
  12. 깨진 유리 피펫을 사용하여 해부 구멍 주변의 조직 파편이나 혈전을 제거합니다.

3 전체 세포 패치 클램프 기록

  1. 실험 당일 붕규산 모세관을 사용하여 팁 개구부 ~1μm 및 저항 ~20MΩ을 가진 기록 마이크로피펫을 준비합니다. 당긴 마이크로피펫은 용기에 보관하고 당일 사용하여 오염을 방지하십시오.
  2. 컴퓨터, CCD 카메라, 모니터, 증폭기, 디지타이저, 마이크로 매니퓰레이터 및 관련 소프트웨어를 켭니다. 앰프 및 디지타이저는 소프트웨어를 열기 전에 켜야 합니다.
  3. 패치 클램프 실험이 수행될 전기생리학적 장비로 물고기를 조심스럽게 옮깁니다.
  4. 물고기의 건강과 세포 생존력을 유지하기 위해 연동 펌프를 사용하여 분당 ~2mL의 산소가 함유된 세포외 용액으로 물고기를 관류합니다.
  5. X-Y 변환기(맞춤형)를 사용하여 기록 챔버를 이동하여 정립 현미경 아래 4x 대물렌즈의 시야에 물고기를 중앙에 배치합니다.
  6. 60x 대물렌즈로 전환하고 변환기를 움직여 대상 시상하부 영역을 시각화합니다. 900nm 적외선으로 Nomarski 미분 간섭 대비(DIC)를 조정하여 세포를 가장 잘 시각화합니다.
  7. 형광 여기 광원(예: 수은 전구)을 켜고 시상하부의 형광 뉴런을 시각화하는 데 사용합니다. 밝은 형광을 나타내고 세포 경계가 명확한 건강한 뉴런을 찾아 이는 종종 양호한 세포 건강을 나타내고 고품질 전기생리학적 기록을 용이하게 합니다.
  8. 미세한 마이크로로더 팁을 사용하여 기록 마이크로피펫을 세포내 용액으로 천천히 다시 채웁니다.
  9. 전극을 헤드에 부착하십시오.tage 의 ampliifier의 손잡이를 조여 공기 누출을 방지합니다. 홀더에 연결된 튜브를 통해 마이크로피펫 내부에 약간의 양압(~150-200mBar)을 가하여 공기 용액 인터페이스의 오염 물질이 전극 팁으로 들어가는 것을 방지합니다.
  10. 마이크로피펫을 고속 모드에서 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 수조 용액에 넣고 마이크로피펫 팁을 4x 대물렌즈 아래의 해부된 구멍 위에 놓습니다.
  11. 마이크로 매니퓰레이터를 저속 모드로 전환하고 대물렌즈를 60x 모드로 변경합니다. 유리 피펫의 끝을 해부 구멍을 통해 두 개의 두근 반구 사이의 심실을 따라 천천히 전진시킵니다.
  12. 피펫 팁을 DIC와 형광을 모두 사용하여 본 표적 형광 세포를 향해 직교로 가져옵니다. 피펫 팁이 세포막에 닿으면 작은 움푹 들어간 곳이 형성됩니다.
    참고: 시상하부와 같은 심부 조직을 시각화하기 위해 900nm IR-DIC는 IR-DIC에 맞게 미세 조정된 편광판 및 분석기 필터와 함께 사용됩니다.
  13. 팁이 세포에 닿을 때 양압이 빠르게 해제되면 세포가 피펫과 밀봉을 형성할 수 있습니다. 동시에 홀더에 연결된 튜브를 통해 짧은 음압을 가합니다.
    알림: 소프트웨어의 저항 값은 > 1GΩ으로 빠르게 증가하여 고저항 밀봉이 형성되었음을 나타냅니다. 형광 시상하부 세포가 성공적으로 기록되면 기록 마이크로피펫의 끝 부분 내에 형광 세포막이 있어야 합니다.
  14. 셀을 -60mV로 클램핑하고 기준선과 접근 저항이 안정될 때까지 1-2분 동안 기다립니다. 짧은 전기 펄스 또는 입으로 부드럽게 흡입하여 마이크로피펫 팁 아래의 세포막을 파열시킵니다.
  15. 전기생리학적 소프트웨어 구성에서 용량성 전류 및 직렬 저항을 보상합니다. 직렬 저항이 100MΩ보다 크고 기록에서 20%> 변하는 경우 데이터를 폐기하십시오.
  16. 전압 모드에서 1초 -10mV 전압 펄스를 적용하여 실험 전후에 고유 멤브레인 저항을 모니터링합니다. 막 저항 또는 막 전위가 많이 변하는 경우 셀을 폐기하십시오.
  17. 셀이 음수 값으로 유지될 때 전압 클램프 (VC) 모드에서 첫 번째 기록. 안정적인 기록을 설정한 후 필요한 경우 전류 클램프 (IC) 모드로 전환합니다.
    참고: 기가씰은 파열 직후 안정적이지 않을 수 있으므로 실험 시작 시 몇 분 동안 VC 모드에서 셀을 -60mV로 클램핑하면 더 나은 셀룰러 상태를 제공할 수 있습니다.
  18. 실험이 완료된 후 MATLAB을 사용하여 전기생리학적 데이터 분석 및 스파이크 감지를 오프라인으로 처리합니다.
  19. 실험 후 1.5% 차아염소산나트륨(NaClO)을 사용하여 유충 물고기를 안락사시키고 기관 동물 관리 프로토콜에 따라 폐기합니다.

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결과

이 원고에서 우리는 온전한 제브라피쉬의 시상하부 뉴런을 조사하기 위한 개선된 생체 내 전체 세포 패치 클램프 기록 기술, 특히 히포크레틴(Hcrt) 뉴런에 초점을 맞춥니다.

그림 1에 제시된 바와 같이, 우리의 방법론은 온전한 동물의 뇌 깊숙한 곳에 있는 이러한 뉴런으로부터 직접적인 전기생리학적 기록을 가능하게 하며(그림 1A), 전통적인 시험관 내 절편 또는 해부된 뇌 준비의 한계를 극복합니다. Hcrt 뉴런은 복부 간뇌 깊숙한 곳에 위치하며 전뇌, 중뇌 및 후뇌로 광범위한 축삭 돌출이 있습니다(그림 1B). 생체 내 샘플을 사용하여 먼저 Hcrt 뉴런에 대한 몇 가지 전기생리학적 매개변수를 측정했습니다(5개 뉴런에 대한 평균 ± SEM, 휴식 막 전위: -53.26 ± ...

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토론

여기에 설명된 프로토콜은 접근하기 가장 깊고 기술적으로 가장 어려운 뇌 영역 중 하나인 유충 제브라피쉬 시상하부에서 펩티더성 뉴런의 패치 클램프 기록을 가능하게 합니다. 이 준비의 고유한 어려움으로 인해 성공적인 패치 클램프 기록을 위해서는 피펫 품질, 접근 기술, 용액 순도 및 조직 건강과 같은 몇 가지 중요한 매개변수에 세심한 주의가 필요합니다. 이러한 요소는 종합적으로 안정적인 기가씰 기록을 달성하고 유지할 가능성을 결정합니다. 첫째, 표적 세포와 피펫 팁의 명확한 시각화는 성공적인 피펫 세포 접촉 및 기가씰 형성에 매우 중요합니다. 이를 위해서는 현미경의 광학 경로를 콘덴서, 조리개 다이어프램 및 필드 다이어프램을 조정하여 미세하게 보정해야 합니다.

제브라피쉬 준비에서 해부 부위와 시상하부 표적 뉴런 사이의 거리가 길기 때문에 피펫 전진 중에 최적의 양압을 적용하면 공기-용액 계면에서 파편을 날려버릴 수 있을 뿐...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없으며 공개할 것이 없음을 선언합니다.

감사의 글

광유전학 실험을 위한 장치 설계에 도움을 준 Daniel Wagenaar 박사에게 감사의 말씀을 전하고 싶습니다. 이 작업은 국립보건원(National Institutes of Health)에서 DAP에 대한 보조금 R35 NS122172 및 R34 NS126800와 R.Z.에 대한 상하이 해외 인재 소개 프로그램의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
증폭기축 삭700비
붕규산 유리 모세관셔터BF100-58-10
CCD 카메라다게-MTIIR-1000
전기생리학적 기록을 위한 컴퓨터작은 골짜기정밀 3660
디지데이타축 삭1440ᅡ
패러데이 케이지맞춤 제작
집게에스티듀몽 #5
부 화기론로이GZP-150B
멤브레인 필터밀리포어 시그마SLGV004SL
마이크로 나이프에스티10318-14
목표올림푸스엠플랜 5X/0.1; UMPlanFI/IR 60X/0.9W
연동 펌프더 이상BT100-1L
피펫 홀더나리시게H-7해부용
끌어당기는 사람서터 악기피-97
형광 스크리닝 및 해부를 위한 실체현미경올림푸스SZX16 시리즈
자극A.M.P.I마스터8
3차원 마이크로매니퓰레이터서터 악기MPC-325
직립 적외선 DIC 현미경올림푸스BX51WI
진동 차단기 테이블TMC61-541-06
비디오 모니터선스포SP-717
수조이헝HWS-12
X-Y 번역기맞춤 제작

참고문헌

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