천연 해양 해수 접종물과 폐쇄 루프 호흡계를 사용한 재료의 호기성 생분해 테스트

요약

이 프로토콜은 천연 해수 접종물과 자동화된 폐쇄 루프 호흡 측정 시스템을 사용하여 호기성 조건에서 합성 및 천연 재료 모두에서 잠재적으로 생분해성 물질을 테스트하기 위한 표준 운영 절차를 설명합니다.

초록

생분해성 물질의 적절한 평가는 표준 테스트 방법의 광범위한 채택에 달려 있습니다. 이러한 방법이 존재하지만 테스트 용량은 여전히 제한되어 있으며 비용과 새로운 실험실을 설립하기 위한 시작 시간으로 인해 제한됩니다. 이 수정된 스크리닝 프로토콜은 정의된 미생물 컨소시엄 또는 천연 해수 접종물에 의해 해양 환경에서 플라스틱 재료의 호기성 생분해를 결정하기 위한 ASTM International D6691-24a, 표준 테스트 방법을 기반으로 합니다. 해양 환경에서 물질의 생분해를 평가하여 결과를 양성 및 음성 대조군과 비교하고 영양분 제한을 방지하기 위해 암모늄과 인산염이 보충된 천연 해수 접종물을 사용합니다. 재료는 영양이 풍부한 이 해수에 노출되고 30°C에서 배양됩니다. Micro-Oxymax 호흡계는 시간 경과에 따른 바이오가스(이산화탄소, CO₂) 생성을 측정합니다. 광물화 정도(생분해)는 바이오가스-탄소로 전환된 물질 유래 탄소의 비율을 계산하여 결정됩니다. 측정된 탄소 함량 또는 이론적 탄소 함량의 일부로 표시되는 CO₂ 생성률은 시간의 함수로 보고됩니다. 폐쇄 루프 호흡 측정 시스템은 각 물질에 대해 세 번 준비된 다양한 반응기 용기, 음성 대조군(해수 접종물만 해당) 및 양성 대조군(박층 크로마토그래피 셀룰로오스)을 수용합니다. 이 방법은 해양 환경의 물질을 평가하는 데 중요하며 전 세계 오염 방지를 다룹니다.

서론

플라스틱 폐기물은 해양 생태계와 인간 건강에 위협이 됩니다¹. 바다의 모든 물질에서 발생하는 해양 쓰레기와 함께 플라스틱 오염에 대한 우려가 커지면서 수명이 다한 폐기물 관리 개선, 해양 환경에서 쉽게 생분해되는 생분해성 물질 등 지속 가능한 솔루션의 필요성이 강조되고 있습니다. 수십 년에서 수백 년 동안 지속되고 먹이 그물에 축적되는 미세 플라스틱을 생성하는 전통적인 합성 플라스틱과 달리 ^2,3,4, 탄소의 유기 성분인 생분해성 물질은 CO₂ 및 메탄(CH₄)으로 대사되거나 미생물 바이오매스로 동화될 수 있습니다⁵. 따라서 해수 내 물질의 생분해를 이해하는 것은 해양 쓰레기가 환경에 미치는 영향을 정량화하고 완화하는 데 중요합니다.

해양 환경에서의 생분해는 빛 및 영양분 가용성, 압력, 온도, 미생물 종 구성, 폴리머의 물리화학적 특성 및 구조를 포함한 시공간 변수의 상호 작용에 의해 제어되며, 이 모든 것이 분해 속도, 정도 및 메커니즘을 결정합니다⁶. 이러한 변수는 해양 환경을 시뮬레이션하는 실험실 기반 생분해 연구에 중요한 과제를 제시합니다. 이 표준 운영 절차(SOP)는 천연 해수를 접종물로 사용하여 존재하는 현장 미생물 군집을 포착하고 해수 용존 영양소, 미립자 탄소 및 질소, 엽록소, 염도, pH 및 온도를 포함한 관련 변수를 기록합니다. 이 통제된 실험실 기반 접근 방식은 광물화 촉진을 위한 조건을 최적화하고 현장에서 실현 불가능한 직접적인 생분해 측정을 가능하게 합니다. ASTM International D6691-24a, 정의된 미생물 컨소시엄 또는 천연 해수 접종물에 의한 해양 환경에서 플라스틱 재료의 호기성 생분해를 결정하기 위한 표준 시험 방법(이하 ASTM D6691) 및 이 SOP는 재료의 생분해성을 평가하기 위한 신속하고 신뢰할 수 있는 스크리닝 도구로 개발되었습니다 7,8,9,10.

고유의 폴리머 생분해성에 대한 스크리닝 테스트인 ASTM D6691에 따라 이 프로토콜은 최적의 조건, 30°C, 분쇄된 샘플의 최대 표면적 및 과도한 무기 영양소(질소, 130mg/L, 인, 23mg/L)⁹에서 재료의 생분해를 평가하여 광물화를 촉진하고 영양소 제한을 방지합니다. 선별 테스트는 귀중한 초기 통찰력을 제공하지만, 자연 해양 조건에서 포괄적인 평가를 위해서는 시간의 함수로 체중 감소를 측정하는 연안 및 심해 계류와 같은 추가 테스트가 필요할 수 있습니다. 이러한 연안 및 심해 계류 테스트는 시간의 함수로서 체중 감소를 기반으로 생분해를 추정하기 때문에^10,11, 연구자들은 더 비싼 현장 연안 및 심해 계류 실험을 진행하기 전에 먼저 미생물 대사를 직접 측정하는 이 선별 테스트를 수행해야 합니다.

ASTM D6691 표준 테스트 방법은 해양 환경에서 부유하지 않는 플라스틱 재료의 호기성 생분해를 평가하는 절차를 간략하게 설명합니다. 이 표준은 ASTM D7081(해양 환경에서 부유하지 않는 생분해성 플라스틱에 대한 표준 사양, 현재 ASTM에서 철회되어 재투표 중인 수성 매질의 생분해성에 중점을 두음)과 같은 사양 표준과 함께 실험용 폴리머를 해양 생분해성으로 인증하기 위한 프레임워크를 제공합니다 ^9,12. 일반적으로 사양은 재료, 제품 또는 시스템이 충족해야 하는 요구 사항을 설정하는 ASTM International의 합의 표준입니다. 이는 해양 환경에서 생분해되도록 설계된 재료가 허용 가능한 기간 내에 생분해되고 염료나 가소제와 같은 잠재적으로 독성이 있는 첨가제를 방출하지 않도록 보장합니다.

ASTM D6691을 기반으로 하는 이 프로토콜은 천연 해수에서 물질(실험 기질)의 호기성 생분해 속도와 정도를 정량화하고 역사적으로 해양 환경에서 생분해성이 있는 것으로 나타난 양성 물질 대조군(예: 셀룰로오스, 크라프트지, 키틴/키토산)을 확장합니다 ^7,9,10. 이 방법의 목표는 최적화된 조건에서 재료를 선별하여 재료가 해양 환경에서 생분해되는지 확인하는 것입니다. 접종물은 ASTM에 설명된 특정 지침에 따라 수집된 바닷물에 존재하는 천연 미생물 군집을 활용합니다. 이 지침은 하수, 화학 물질 투기 또는 기름 유출과 같은 오염 물질이 없는 장소에서 수집된 염도가 약 32인 해수를 사용하는 것을 강조합니다. 이 테스트는 30°C로 유지되는 250mL 반응기 용기가 있는 자동 폐쇄 루프 호흡계를 사용하며, 각각 75mL의 해수와 ~20mg의 실험 또는 대조 기질을 포함합니다⁸. 광물화(생분해)는 추가된 초기 탄소 질량에 비해 생성된 순 탄소 바이오가스(CO_2-C)의 백분율로 표현됩니다. 이 방법은 미생물 바이오매스로의 탄소 동화를 고려하지 않습니다.

프로토콜

1. 해수의 수집 및 특성화

1. 폐수, 화학 물질, 유막 또는 강한 담수 영향의 영향을 받지 않는 해수 수집 장소를 식별합니다.
2. 채취 장소에서 출처(위치, 위도 및 경도, 채취 깊이, 총 깊이 및 온도), 샘플 수집 날짜 및 관찰된 수질 상태를 기록합니다.
3. 다양한 수심, 현장 위치 및 샘플링 이벤트에서 해수 샘플을 수집하고 결합하여 다양한 미생물 군집 구성을 촉진합니다.
4. 20L 산성 침출 카보이에서 큰 Niskin 병을 사용하여 10L에서 20L의 바닷물을 수집하고 실험실로 다시 운반합니다.
5. 카보이에서 전체 해수 하위 샘플 1L를 산성 침출 1L 호박색 고밀도 폴리에틸렌(HDPE) 병으로 옮겨 초기 해수 조건에 대한 미립자 탄소 및 질소의 실험실 분석을 수행합니다. 1L 샘플에서 여과(0.2μm, 저질소 셀룰로오스 아세테이트)하고 용존 무기 및 유기 질소(N) 및 인(P) 성분을 분석하기 위해 산성 침출 폴리에틸렌 병에 60mL 하위 샘플을 수집합니다.
6. 프로젝트 이름, 샘플 ID 및 날짜로 하위 샘플에 레이블을 지정합니다. 인도페놀 방법(4500-NH3)^13,14을 사용하여 NH₄⁺ 농도를 측정하고 단일 용액 방법(4500-P E)^13,15을 사용하여 PO₄^3- 수준을 측정합니다. 원소 분석 방법¹⁶을 사용하여 미립자 질소 및 탄소를 정량화합니다. Parsons et ^al.17(10150 A, 10150 C)¹³에 의해 설명된 프로토콜에 따라 엽록소-a 농도를 측정합니다.
   참고: 영양 관련 수질 분석은 선택 사항입니다. 이 프로토콜은 분석이 외부 실험실에서 수행된다고 가정합니다.
7. 호기성 조건을 유지하기 위해 카보이 개구부를 느슨하게 덮고 바닷물을 30°C에서 어둠 속에서 최대 7일 동안 보관합니다.
   알림: 바닷물은 공기 펌프와 버블러 시스템을 사용하여 폭기될 수도 있습니다.

2. 실험 기판의 준비

1. 펠릿, 파편 및 형성된 조각 형태일 수 있는 실험 기질(즉, 천연 다당류, 목재, 섬유판, 폴리머) 10-15g을 20mm 강철 볼이 있는 50mL 스테인리스 스틸 밀링 용기에 첨가합니다. 테스트를 시작하기 전에 실험 기판을 균일한 입자 크기(0.10-0.25mm)로 밀링합니다.
2. 밀링 용기를 액체 질소에 담그고 액체 질소가 끓지 않을 때까지 15분 동안 취성시킵니다.
   주의 : 액체 질소는 화상, 부상 또는 동상을 유발할 수 있는 극저온 액체입니다. 사용하기 전에 모든 안전 보건 자료를 읽고 따르십시오. 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.
3. 밀링 용기를 볼 밀 부착물에 고정하고 기기 매개변수를 30Hz 및 2:30분으로 설정한 다음 시작을 누릅니다. 시험 사이에 액체 질소에서 30초 동안 냉각하면서 4회 반복합니다. 재료가 유리 전이 온도가 낮은 폴리머인 경우 균일한 입자 크기 분포를 생성하기 위해 필요에 따라 추가 밀링 사이클을 수행합니다.
4. ASTM D1921-96¹⁸에 설명된 대로 체 분석을 통해 크기 균일성을 확인하고 입자 크기 분포를 특성화합니다. 예상 입자 크기 범위에 걸쳐 표준 체를 조립하고 바닥에 가장 작은 메쉬 크기를 배치합니다. 분쇄된 샘플을 상단 체에 놓고 체 스택을 기계식 셰이커에 고정합니다. 파티클이 메시를 통과할 때까지 교반합니다. 각 체에서 잔류된 재료를 수집하고 무게를 측정하여 입자 크기 분포를 계산합니다. 비교 가능성을 유지하기 위해 처리 전반에 걸쳐 동일한 체 세트를 사용하십시오. 데이터 시트에 분포를 기록합니다.
5. 원소 분석에 의해 분쇄된 실험 기판의 하위 샘플 건조 중량당 탄소 함량을 결정합니다¹⁶.
   참고: 이 프로토콜은 원소 분석이 외부 실험실에서 수행된다고 가정합니다.

3. 해수에 대한 추가 영양소의 준비

1. 2L 또는 4L 부피 플라스크에 바닷물을 반쯤 채웁니다. 필요한 총 부피는 실험에 사용할 반응기 용기의 수에 따라 다릅니다. 각 원자로 용기에는 75mL의 해수가 들어 있습니다. 해수 공급원에 고농도의 미립자 유기물이 포함되어 있는 경우 20μm 메쉬를 통해 해수를 체질하여 큰 미립자에 의한 이질적인 오염을 제거합니다.
2. 0.001 g에 민감한 정밀 저울을 사용하여 계량 팬을 용기하고 0.5 g/L 염화암모늄(NH₄Cl)을 계량한 다음 2 L 또는 4 L의 해수를 기준으로 0.1 g/L 인산칼륨 일염기(KH₂PO₄)을 계량합니다.
   주의: 염화암모늄은 눈 손상이나 자극을 유발할 수 있습니다. 사용하기 전에 모든 안전 보건 자료를 읽고 따르고 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.
   참고: 염화암모늄 및 인산칼륨 일염기성 폐기물은 제도적 절차 및 현지 규정에 따라 전용 유해 폐기물 용기에 폐기하십시오. 소량의 희석된(<1%) NH₄Cl 및 KH₂PO₄ 용액은 기관 및 지역 폐수 당국에서 허용하는 경우 다량의 물로 희석한 후 배수구 처리가 가능할 수 있습니다.
3. 무기 영양소를 2L 또는 4L 부피 플라스크에 넣고 바닷물로 부피를 만들고 교반 막대를 넣고 모든 염이 녹을 때까지 교반판에 저어줍니다. 용액은 눈에 보이는 미립자 없이 투명해야 합니다.
4. pH 및 염도 측정을 위해 영양이 보충된 해수 20-30mL를 서브샘플링합니다. 1.5단계의 표준 방법에 따라 용존 무기 N 및 P 분석을 위해 0.2μm 저질소 셀룰로오스 아세테이트 필터를 통해 추가 60mL를 산 침출 폴리에틸렌 병에 여과합니다.
5. 제조업체의 지침에 따라 탁상용 측정기에서 pH와 염도를 측정하십시오. 영양 보충제의 산도로 인해 최대 강도의 해수에 대해 약 1단위의 pH 감소가 예상됩니다.

4. 반응기 용기 배양 준비

1. 샘플용 반응기 용기 250mL와 10% 염산(HCl)에 75mL 체적 피펫을 포함한 모든 유리 제품을 24시간 동안 산적으로 침출하고 탈이온수로 3회 헹굽니다.
   주의 : HCl은 심각한 화상과 눈 손상을 일으킬 수 있습니다. 사용하기 전에 모든 안전 보건 자료를 읽고 따르십시오. 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.
   참고: 10% HCl 폐기물은 폐기 전에 중탄산나트륨으로 중화하여 중성 용액을 형성할 수 있습니다. 기관의 유해 폐기물 절차 및 해당 지역 규정에 따라 중화를 수행합니다.
2. 산으로 침출된 250mL 빈 반응기 용기, 포트가 있는 뚜껑, 실리콘 씰 O-링 및 스크류 캡을 실험일 전 15분 동안 121°C의 오토클레이브에 오토클레이브합니다.
3. 샘플 바이알에 샘플 또는 대조 물질을 받는 용기에 해당하는 채널 번호/ID로 라벨을 붙입니다.
4. 분석 저울을 사용하여 바이알(캡 포함)을 용기하고 실험 또는 대조군 20mg(± 0.1mg)의 무게를 측정하고 전체 판독 중량을 기록하고 따로 보관합니다. 모든 실험 및 대조 반복에 대해 반복합니다.
   알림: 무게가 정확한지 확인하십시오. 같은 날에 같은 사람이 모든 기판의 무게를 측정하는 것이 좋습니다.
5. 용기를 추가하기 전날 인큐베이터를 켜고 온도를 30°C로 설정합니다. 제조업체 지침에 따라 시스템 진단 및 센서 교정을 실행하기 최소 2시간 전에 호흡계를 켜십시오.
   참고: 반응기 용기 준비는 인큐베이터 온도가 30 ± 2°C에 도달하고 유지되면 진행할 수 있습니다.
6. 샘플 ID/반복실험 및 해당 채널 번호를 기록하여 데이터 시트를 준비합니다. 반응기 용기와 캡 어셈블리(포트가 있는 뚜껑/O-링)를 채널 번호/ID 순서대로 구성합니다(각 용기에 명확하게 라벨이 붙어 있는지 확인). O-링과 뚜껑/포트가 깨끗하고 건조하며 손상되지 않았는지 확인하십시오.

5. 반응기 용기 설정

1. 산 침출 75mL 체적 피펫과 전동 피펫 컨트롤러를 사용하여 75mL의 영양 보충 해수를 각 반응기 용기에 분배합니다.
2. 각 용기에서 일회용 피펫 1개 분량의 해수(~3mL)를 제거하고 옆의 깨끗한 표면에 놓습니다. 이 해수는 용감 약병에서 분쇄된 실험 및 제어 기질을 헹구는 데 사용됩니다(그림 1).
3. 기질을 적절한 용기로 옮깁니다.
4. 원자로 용기 림에 O-링을 놓은 다음 O-링 위에 직접 2포트 뚜껑을 놓습니다. 나사 캡으로 O-링과 뚜껑을 제자리에 고정합니다.
5. 반응기 용기를 해당 가스/응축 라인과 일치시킵니다. 가스 라인을 용기 뚜껑의 적절한 입구/출구 포트에 단단히 삽입합니다.
6. 셰이커 플랫폼을 0.05 x g (연속 모드)으로 켭니다. 육안 점검을 수행하여 모든 용기가 안전한지 확인한 다음 인큐베이터 도어를 닫습니다.
7. 기압계를 사용하여 인큐베이터 온도(판독 및 서미스터 프로브)와 대기압을 기록합니다.

그림 1: 용기 설정 및 준비. (A) 해수를 추가하고, (B) 샘플을 추가하고, (C) O-링, 금속 뚜껑 및 나사 캡을 추가합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. 호흡계 시스템 시작

1. 연결된 컴퓨터에서 소프트웨어를 실행합니다. 시스템이 RS-232 연결을 통해 하드웨어를 감지하는지 확인합니다. 하드웨어를 찾을 수 없는 경우 장치가 연결되지 않았음을 나타내는 알림이 표시되며 프로그램을 다시 시작해야 합니다.
2. 소프트웨어 기본 메뉴에서 도구 > 진단 > 기본 작업을 선택합니다. 로그 파일 저장을 클릭합니다. 밸브 및 센서를 클릭합니다. 소프트웨어는 각 테스트에 대해 PASS 또는 FAIL을 표시합니다. 두 테스트를 모두 통과한 경우에만 CO₂ 센서의 2점 교정을 진행합니다.

7. CO₂ 센서 교정

1. 소다석회 컬럼을 시료 펌프 후면 패널의 질소 포트에 연결하여 제로 교정을 위해 주변 CO₂ 를 제거합니다. 소다석회가 백악질처럼 흰색이고 변색되지 않았는지 확인하십시오(예: 분홍색 또는 보라색).
2. 도구 > 보정을 선택합니다. 오른쪽 하단 모서리에 있는 보정 시작을 클릭합니다. 메시지가 표시되면 전면 패널 샘플 펌프 제어를 사용하여 샘플 흐름을 0.5 L/min으로 조정합니다. 확인을 클릭합니다.
3. 타이머가 0에 도달하면 CO₂ 센서의 위 및 아래 오프셋 버튼을 눌러 화면의 판독값을 0.000(또는 가능한 한 가깝게)으로 조정합니다. 값이 허용 범위 내에 있을 때 녹색으로 바뀝니다. 다음 가스를 클릭합니다.
4. 메시지가 표시되면 교정 가스 실린더를 샘플 펌프 후면 패널의 교정 포트에 연결합니다. 교정 가스 출구 압력을 5 PSIG로 조정하십시오. 확인을 클릭하기 전에 사용자가 피팅 근처에서 가스를 듣고 느낄 수 있도록 T 피팅을 통해 과도한 가스가 흐르는지 확인하십시오.
5. 타이머가 0에 도달하면 CO₂ 센서의 위 및 아래 스팬 버튼을 눌러 화면의 판독값을 2.700(또는 가능한 한 가깝게)으로 조정합니다. 값이 허용 범위 내에 있을 때 녹색으로 바뀝니다. 다음 가스를 클릭하여 캘리브레이션을 완료합니다.
   알림: 스팬 가스 농도는 공급업체의 분석 인증서에 문서화된 대로 인증된 1차 표준 가스 혼합물에 의해 결정됩니다.

8. 소프트웨어에서 실험 설정

1. 실험 > 설정을 선택합니다. 점유된 채널을 기준으로 드롭다운 메뉴에서 시작 및 끝 채널 번호를 입력합니다.
   1. 새로 고침 임계값(%)을 0.50으로, 새로 고침 간격을 N.A.로, 새로 고침 창(초)을 자동으로 설정합니다.
   2. 기타 설정에서 센서 제거 확인란을 선택합니다. 자동 부피 측정, O₂ 소비 양수 및 개방 흐름 모드 활성화가 선택되어 있지 않은지 확인합니다.
   3. 샘플 간격(시간)을 8.00으로 설정하고 실험 기간(시간)을 NA로 설정합니다. 필요에 따라 가스 및 시간 단위를 설정합니다.
   4. 배양 온도 보정을 위해 1차 온도 프로브를 사용하는 경우 Manually Enter Chamber Temps가 선택되어 있지 않은지 확인하십시오. 환기 모드 확인란을 선택하고 드레인 모드가 선택되어 있지 않은지 확인합니다.
   5. 혐기성 환기 모드가 선택되어 있지 않은지 확인하십시오.
2. 챔버 설정을 선택합니다. 설명이 포함된 채널 레이블(예: NegCtrl_1, PosCtrl_2, Test_PHA_3)을 입력합니다.
3. 유틸리티를 클릭합니다. 점유된 채널에 대해서만 EN 열에서 셀을 클릭합니다. 제한을 클릭합니다. 소프트웨어는 각 채널에 대해 PASS 또는 FAIL을 표시합니다. 모든 제한 테스트를 통과한 경우에만 진행합니다.
4. 볼륨을 클릭하여 헤드스페이스 볼륨을 측정합니다.
   알림: 헤드스페이스 부피는 샘플 반응기 용기 및 폐쇄 루프 튜브 내의 공기량과 같습니다. 용기 크기와 튜브 길이에 맞는 양을 확인합니다.
5. 누출을 클릭합니다. 소프트웨어는 헤드스페이스 볼륨을 기반으로 각 채널에 대해 PASS 또는 FAIL을 표시합니다. 채널에 장애가 발생하면 다음 단계를 수행하십시오.
   1. O-링이 깨끗하고 입자와 섬유가 없고 용기 테두리와 금속 뚜껑 사이에 제대로 장착되었는지 확인하십시오.
   2. 나사 캡을 조입니다. IN/OUT 포트 및 피팅의 연결 및 튜브를 확인하십시오. 마모되거나 변형된 튜브 끝을 날카로운 칼날로 다듬어 깨끗하고 직선적인 절단을 보장합니다.
   3. 채널이 계속 고장나면 O-링을 제조업체에서 지정한 호환되는 새 링으로 교체하십시오.
6. 볼륨을 클릭하여 헤드스페이스 볼륨을 다시 측정합니다. 종료를 클릭합니다. Chamber Setup 탭의 Volume 열이 점유된 모든 채널에 대해 채워져 있는지 확인합니다.
7. 기본 메뉴에서 도구 > 서비스 메뉴를 선택합니다. 인큐베이터 온도를 측정하는 1차 온도 프로브가 30°C ± 2°C이고 안정적인지 확인합니다.
8. 실행을 클릭합니다. 날짜가 포함된 설명이 포함된 이름을 사용하여 파일을 저장합니다(예: 030325PositiveControlValidation). 데이터 시트에 파일 이름을 기록합니다.
9. 실험 > 보기 > 그래프 표시 를 선택하여 실시간 플롯을 봅니다. 바이오가스 생산은 양의 CO₂ 생산률로 나타납니다. 음성 대조군은 약 0으로 변동할 수 있습니다. 그러나 평균 비율은 0이거나 양수여야 합니다.
10. 시스템에 응축 공기 건조기가 포함된 경우 튜브에 눈에 보이는 응결에 대한 일일 로그를 유지하십시오. 필요한 경우 튜브를 부드럽게 저어주어 막힘을 방해하고 배수를 허용합니다.
11. 각 샘플링 간격이 끝날 때 데이터 파일(ASCII 텍스트 파일)을 업데이트합니다. 온도, 가스 % (가스 조성), 속도 및 축적을 포함한 데이터는 실험 중 또는 실험 종료 시 다양한 다른 소프트웨어 패키지에 다운로드 할 수 있습니다.
    1. 스프레드시트에서 .dat 파일을 열려면 Excel을 실행하고 파일 > 열기를 선택합니다. .dat 파일이 포함된 폴더로 이동합니다. 파일 형식 드롭다운 메뉴에서 모든 파일을 선택하고 원하는 파일을 선택합니다.
    2. 텍스트 가져오기 마법사에서 메시지가 표시되면 파일 유형으로 구분됨 을 선택하고 다음을 클릭합니다.
    3. 구분 기호에서 쉼표 확인란을 선택합니다. 다른 구분 기호가 선택되어 있지 않은지 확인합니다. 미리보기 창에는 열로 구분된 데이터가 표시되어야 합니다. 마침을 클릭하여 스프레드시트에 데이터를 로드합니다.
    4. 추가 분석 및 보관을 위해 파일을 .xlsx 또는 .csv 형식으로 저장합니다.
12. 주기적으로 데이터를 분석하여 치료 반복이 일관성이 있는지 확인합니다. 치료 반복의 표준 오차는 평균 누적 CO₂ 생산량의 5% 미만이어야 합니다. 이 임계값에 실패하는 테스트를 반복합니다.
13. 인큐베이션이 완료되면 중지를 클릭합니다.
    1. 배양은 10-90일 동안 지속될 수 있습니다. 테스트 재료가 생분해성이 높은 경우 누적 CO₂ 생산량이 정체되면 배양을 종료하거나 90일 후에도 분해가 관찰되지 않으면 연장합니다.
    2. 대조 용기와 테스트 용기 모두에서 최소 5일 동안 순 가스 생산이 관찰되지 않으면 실험을 종료합니다. 순 생산량은 5일 동안 생분해율의 변화가 1% 미만인 것으로 정의됩니다.
14. 시스템을 종료하거나 다음 실험을 준비합니다.

9. 실험 분석

1. 인큐베이터 온도를 기록합니다(서미스터 프로브 및 인큐베이터 판독). 호흡계에서 반응기 용기에서 튜브를 분리하고 정밀 저울을 사용하여 각 샘플 반응기 용기의 무게를 측정합니다. 체중을 기록하여 잠복기 동안 체중/수분 손실이 발생했는지 확인합니다.
2. 각 반응기 용기에서 20-30mL의 해수를 서브샘플링하여 pH 및 염도를 측정하고 이 값을 3.4단계에서 기록된 값과 비교하여 배양 중 안정성을 확인합니다. 1.5단계의 표준 방법에 따라 용존 무기 N 및 P 분석을 위해 0.2μm 저질소 셀룰로오스 아세테이트 필터를 통해 추가로 60mL를 산 침출 폴리에틸렌 병에 여과합니다.
   알림: 잔류 해수 샘플은 여과하여 남아 있는 플라스틱을 제거하고 희석하여 영양분 농도를 낮추고 기관 및 지역 규정에 따라 배수 배출로 폐기할 수 있습니다.
3. 용기, O-링, 금속 뚜껑 및 나사 캡을 수돗물로 헹굽니다. 유리 제품을 10% HCl 산 수조에 최소 24시간 동안 넣습니다. 오토클레이브하고 다음 배양을 위해 알루미늄 호일로 덮은 보관

10. 생분해율 계산

1. 다음과 같이 실험/대조 기판의 총 탄소를 계산합니다.
   
   여기서 % C(탄소 함량)는 원소 분석을 통해 결정됩니다.
   참고: 실험 및 대조 기질의 총 탄소는 호기성 배양 중에 다음과 같은 생화학적 변형을 겪을 수 있습니다.
   C + O₂ → CO₂
   실험/대조 기질의 각 mmole(12mg)의 유기 탄소는 1mmol의 기체 CO₂로 변환될 수 있습니다. 생성된 1mmole의 가스는 표준 온도 및 압력(STP)에서 22.4mL를 차지합니다.
2. 다음과 같이 생분해율을 계산합니다.
   
   여기서 C_g = 실험/대조군 기질 및 음성 대조군(해수 접종물만 해당)에서 생성된 기체 탄소의 양, mmoles, C _i = 실험 기질에 첨가된 탄소의 양, mmoles.
3. 다음과 같이 생분해 백분율의 표준 오차 s_e를 계산합니다.
   
   여기서 n1 및 n2 = 각각 반복 실험/대조 기질 및 음성 대조 반응기 용기의 수, s = 생성된 총 기체 탄소의 표준 편차.
4. 다음과 같이 95% 신뢰 한계(CL)를 계산합니다.
   
   여기서 t = 자유도가 (n1 + n2 − 2)인 95% 확률에 대한 t-분포 값이므로 n = 3 + 3 − 2 = 4입니다.

11. 프로토콜 종료

1. 계산 및 데이터 분석을 완료한 후 프로젝트 또는 기관 데이터 관리 계획에 따라 결과를 최종 보고서로 수집하거나 공유 데이터베이스에 입력합니다. 모든 재료가 기관의 유해 폐기물 지침에 따라 폐기되고 모든 장비가 청소 및 보관되었는지 확인하십시오.

결과

해양 생분해 테스트 결과가 제시됩니다. 이산화탄소로 전환된 탄소의 비율을 측정하여 각 샘플에 대한 생분해를 평가했습니다. 누적, 속도 및 백분율 생분해 플롯은 일반적으로 지연 단계, 성장 단계, 결국 정체기를 나타냅니다. 이러한 단계의 시기와 크기는 시료 재료, 실험 조건 및 해수 접종물의 구성에 따라 다릅니다.

온대 만에서 일년 내내 수집된 해수는 수질 성분의 가변성을 나타냅니다. 예를 들어, 미생물 군집의 다양성과 풍부도는 계절별 시간 척도에 따라 다릅니다^19,20. 또한, 해수 접종물에 불안정한 유기 탄소가 존재하면 복제 간에 이산화탄소 생산의 이질성을 유발할 수 있습니다. 유기 탄소, 특히 느리게 분해되는 미립자 유기 탄소는 미생물 군집에 대한 탄소의 가용성에 영향을 미칠 수 있습니다

토론

양성 대조군 성능은 테스트 타당성을 결정합니다. 이론적 최대 가스 수율을 기준으로 쉽게 해양 생분해성 양성 대조군 기질(예: 분석 등급 셀룰로오스, 크래프트지 등)의 최소 70% 생분해가 필요합니다. 이 벤치마크는 배양 중 천연 해수에서 유리한 조건과 충분한 미생물 활동을 검증합니다. 이 임계값을 충족하지 못하면 복제 준비, 해수 접종 처리(즉, 미생물 군집 사멸) 또는 호흡 측정 시스템 기능에 잠재적인 문제가 있음을 나타내며 테스트 무효화가 필요합니다.

반복 준비와 관련된 변동성을 최소화하려면 모든 샘플 재료는 평균 입자 크기가 0.25mm 미만인 동일한 물리적 형태여야 합니다. 물리적 형태의 차이, 즉 미생물 공격에 사용할 수 있는 표면적의 변화는 광물화의 정도와 속도에 영향을 미칠 수 있습니다. 기판을 극저온으로 밀링하는 경우 입자 크기 분포가 일관되어야 하며 체질 장치 또는 입자 크기 분석기를 사용하여 확인해야 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.2 & 마이크로; M, 47mm 셀룰로오스 아세테이트 필터	지반공학 지오필터	83100056	여과 바닷물
100 mL 체피 피펫	써모 피셔 사이언티픽, 피셔브랜드	13-650-2U	A급; 산을 침출하고 탈이온수로 헹군
100-600mL 유리 비커	써모 피셔 사이언티픽, 피셔브랜드	50-194-5690	A급; 산을 침출하고 탈이온수로 헹군
20 mm 밀링 볼	레치	53680062	스테인리스 스틸. 폴리머의 극저온 제분을 위한 밀링 자와 함께 사용됩니다
50 mL 밀링 병	레치	14620216	스테인리스 스틸. 폴리머의 극저온 밀링을 위해 믹서 밀 400 및 20mm 밀링 볼과 함께 사용됩니다.
75 mL 부피 피펫	써모 피셔 사이언티픽, 피셔브랜드	13-650-2T	A급; 산을 침출하고 탈이온수로 헹군
공기 펌프와 버블러 시스템	테트라	77846	부화 전 평형 상태 동안 해수 공기 조절
알루미늄 호일	피셔브랜드	01-213-100	오토클레이빙 및 깨끗한 보관용 커버
염화암모늄 (NH4Cl)	써모피셔 사이언티픽, 피셔 케미컬	A661-500	해수 영양분 급증
분석 균형	메틀러	AT201	실험용 기질과 대조군 기질의 무게를 측정하기 위해
오토클레이브	투트나우어	MFI-TTN-3870EA	용기 및 뚜껑 조립체를 멸균하기 위해
기본 마이크로-옥시맥스 120VAC 싱글 채널	콜럼버스 인스트루먼트	0135-8000	양성 대조군과 폴리머 저장에 사용됩니다
교정 가스	에어가스	X03NI92P3000001	기본 표준 가스 혼합물; 이산화탄소 2.7%, 메탄 4.5%, 질소 균형
컴퓨터 모니터	델	210-BMKK	델 프로 24 플러스 USB-C 허브 모니터. 마이크로-옥시맥스 소프트웨어를 실행하기 위해 컴퓨터와 함께 사용됩니다
냉동 장갑	서모피셔 사이언티픽, 템쉴드, 크라이오 글러브	11-394-306	액체 질소 다루는 데 사용됩니다
다이얼 온도계	써모피셔 사이언티픽, H-B 기기 듀락	13-201-433	채취 시점의 해수 온도에 맞게 보정된 온도계
일회용 피펫	써모 피셔 사이언티픽, 피셔브랜드	13-711-7M	용기 측면을 헹구면 재료를 자유롭게 하세요
ENC52 온도 및 광 제어 인클로저	콜럼버스 인스트루먼트	4740-4054	온도와 빛 조건을 유지하세요
플라스크 집게들	써모 피셔 사이언티픽, 피셔브랜드	S07387	액체 질소에서 밀링 병을 다루는 데 사용됩니다
플라스크, 250 mL	DWK 생명과학	14395-250	샘플 원자로 용기
플러그 스타일 클로저가 있는 유리 쉘 바이알	써모 피셔 사이언티픽, 피셔브랜드	03-339-26D	샘플 저장
H22PX 휴대용 깊이 탐지	웨스트 마린, 노크로스 마린	6849368	해수 수집 지점 깊이 결정
휴대용 GPS 73	가민	10-01504-00	해수 수집 지점 위치 결정에 사용됨
HDPE 팬	서모 사이엔티픽, 날겐	13-359-26	유리 용기를 산성 침출하는 데 사용되었습니다. 10% HCl 용액
염산(산성 물 용액)	써모피셔 사이언티픽, 피셔 케미컬	A144-212	인증 ACS 플러스, 36.5%에서 38.0%. CO2 센서 점검 및 산성 침출 유리 제품
층류 후드	항공 과학	플로우-48-A	샘플 준비 중 공기 중 오염물질을 최소화하세요
라지 니스킨; 베타 플러스 병 전용 - 8.2L 수평, PVC	사이언스 퍼스트	3-1980-H65	부두나 보트에서 바닷물 수집을 위해
액체 질소 팬	써모 피셔 사이언티픽, 벨아트 매직 터치 2	11-999-063	액체 질소를 보관하세요;
액체 질소 이송 용기, 10 L	써모 사이언티픽	TY509X2	냉동 밀링을 위한 액체 질소를 저장하고 분배하세요
액체 질소, 산업용 등급, 22 PSI	에어가스	NI 180LT22	고분자 취성 및 밀링에 사용됨
기계식 체체 셰이커	험볼트, 그레인저	5DPL6	입자 크기 분포를 위한 체(si체 분석)
마이크로-옥시맥스	콜럼버스 인스트루먼트	7395-113-D64	실리콘 밀봉 오링, 금속 포트(3개 피팅), GL45 나사 캡 및 nbsp;
마이크로-옥시맥스 10채널 확장 인터페이스	콜럼버스 인스트루먼트	0135-8101	호흡계 구성 요소
마이크로-옥시맥스 호흡기 (3% CO2 센서)	콜럼버스 인스트루먼트	0135-8403	비분산성 적외선
믹서 밀 400	레치	207450001	믹서 밀 400. 고분자의 극저온 밀링에 사용
모터 피펫 컨트롤러	에펜도르프	4430000018	샘플 원자로 용기로 바닷물을 이송합니다
좁은 입 앰버 HDPE 실험실 품질 병, 1L	서모 사이엔티픽, 날겐	02-923-5	이산 전수 해수 샘플
나일론 메시 20 마이크론	ELKO 필터링 컴퍼니	41718	더 큰 이질적 입자를 제거하기 위해 원해수를 체로 체로 내는 데 사용됩니다
오픈 에어 오비탈 셰이커	써모피셔 사이언티브	SK4000	인큐베이션 동안 원자로 용기의 궤도 운동 유지
옵티플렉스 5090 소형 폼팩터 컴퓨터	델	C0SL03	Desktom 컴퓨터는 Micro-Oxymax 소프트웨어를 실행하곤 했습니다.
pH/온도계	메틀러 톨레도, 세븐엑세월 S470-베이직	30046252	초기 및 최종 해수 접종량을 측정하기 위한 벤치탑 pH/전도도 측정기
폴리에틸렌 병, 60 mL	코르팍	PLC-03564	분리된 여과 해수 샘플
인산칼륨 단염기성 (KH2(PO4))	써모피셔 사이언티픽, 피셔 바이오리시약	BP362-500	해수 영양분 급증
정밀 저울	사르토리우스	Practum2102-1S	용기의 공중량과 전체 중량을 무게 측정하기 위해
라운드 카보이, 20L	써모피셔 사이언티브	02961A	해수 저장을 위한 산성 침출
안전 고글	써모 피셔 사이언티픽, 피셔브랜드	19-181-513
스쿠풀라	써모피셔 사이언티픽, 피셔브랜드, 스쿠풀라	01-257-567	스테인리스 스틸 실험실 스쿠풀라
체(체)	아드반텍, 그레인저	40PR18-40PR55	스테인리스 체. 체의 수와 크기는 시험 대상 재료에 따라 달라집니다.
시그마셀 셀룰로오스, 타입 101	시그마-올드리치	435236-250G	분말, 양성 대조군 기질
중탄산나트륨	써모피셔 사이언티픽, 피셔 케미컬	S233-500	CO2 센서 점검
무수성 아황산나트륨, 98%	써모피셔 사이언티픽, 써모 사이언티컬 케미컬스	AAA1793336	CO2 센서 점검
온도계/서미스터 프로브	피셔브랜드	15-079-700	인큐베이터 온도 확인
추적 가능한 정밀 다이얼 기압계	피셔브랜드	14-648-51	실험 시작 시 대기압을 기록하세요
빅터 중형 수소, 메탄 2단계 조절기, CGA - 350	에어가스	VIC0781-3559	보정 가스 조절기
부피 플라스크, 2L	써모 피셔 사이언티픽, 피셔브랜드	FB4002000	A급; 산을 용출하고 탈이온수로 헹구는 것. 영양분이 첨가된 바닷물을 준비하는 데 사용된다.
저울대	써모피셔 사이언티브	02-202-101	폴리에틸렌