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방법 논문

무세포 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스에 의한 새로운 용해 감염의 확립 및 정량화

1.2K 조회수

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DOI:

10.3791/68959

⸱

2025년 8월 15일

 ,  ,  , 
1Program in Molecular and Cellular Oncogenesis, The Wistar Institute, 2Section of Infection and Immunity, Herman Ostrow School of Dentistry, University of Southern California

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 BAC16 유래 비리온을 사용하여 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스의 새로운 용해 감염을 모델링하는 시험관 내 시스템을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 초기 바이러스 복제 및 전파를 조사할 수 있습니다. 감염성 바이러스 생산은 GFP 기반 감염 단위 분석 및 캡슐화된 바이러스 게놈의 실시간 PCR에 의해 정량화됩니다.

초록

여러 인간 악성 종양과 관련된 감마헤르페스 바이러스인 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스(KSHV)는 바이러스 전파, 면역 회피 및 질병 발병에 기여하는 과정인 1차 감염 중에 용해 복제를 겪을 수 있습니다. 그러나 새로운 용해 감염을 위한 강력한 시험관 내 시스템이 부족하여 초기 감염 사건에 대한 통찰력이 제한적입니다. 여기에서, 우리는 KSHV 박테리아 인공 염색체 16(BAC16)-재활성화 iSLK 생산자 세포에서 파생된 무세포 비리온에 의한 감염의 표적으로 인간 대장암 HCT 116 세포를 사용하는 다루기 쉬운 프로토콜을 제시합니다. 이 모델은 바이러스 진입, 게놈 전달, 용해 유전자 발현 및 자손 생산을 포함한 1차 감염의 주요 단계를 요약합니다. 감염은 spinoculation을 통해 동기화되고 일시적으로 모니터링됩니다. 바이러스 생산은 녹색 형광 단백질(GFP) 기반 감염 단위(IU) 분석과 캡슐화된 바이러스 DNA의 qPCR로 구성된 이중 판독 시스템을 사용하여 정량화됩니다. 이러한 접근법을 통해 바이러스 복제 동역학에 대한 자세한 분석이 가능합니다. 현재 프로토콜은 후기 단계 사건의 감지에 중점을 두고 있지만 시스템은 수정된 샘플링 시점을 통해 감염의 초기 단계를 연구하는 데 적응할 수 있습니다. 생산적인 새로운 감염을 위한 재현 가능하고 확장 가능한 플랫폼을 제공함으로써 이 시스템은 KSHV 연구의 방법론적 격차를 해소하고 헤르페스바이러스-숙주 상호 작용 및 항바이러스 전략에 대한 기계론적 연구를 지원합니다.

서론

카포시 육종 관련 헤르페스바이러스(KSHV)는 카포시 육종(KS), 원발성 삼출성 림프종(PEL), 다발성 캐슬만병(MCD) 및 KSHV 염증성 사이토카인 증후군과 병인학적으로 관련된 인간 감마헤르페스 바이러스입니다 1,2. 모든 헤르페스바이러스와 마찬가지로 KSHV는 잠복기와 용해기 사이를 번갈아 가며 숙주에서 평생 지속성을 확립합니다. 잠복기는 대부분의 감염된 세포에서 우세하지만, 하위 집합은 1차(de novo) 감염 동안 또는 잠복기에서 재활성화를 통해 용해 주기에 들어갈 수 있습니다3. 용해 복제는 바이러스 유전자 발현의 질서 있는 캐스케이드를 포함하며, 게놈 복제, 비리온 조립 및 자손 방출로 절정에 이릅니다. 이 과정은 바이러스 전파 및 질병 진행에 매우 중요합니다 4,5. KSHV 용해 복제에 대한 초기 연구는 종종 이종 시스템에서 개별 바이러스 유전자의 이소성 발현에 의존했습니다. 유익하기는 하지만 이러한 접근법은 실제 감염 중에 존재하는 조정된 유전자 조절 및 바이러스-숙주 상호 작용을 포착하지 못했습니다. 전장 KSHV 게놈을 운반하는 재조합 박테리아 인공 염색체(BAC)인 BAC-16의 개발은 복제 및 감염성 비리온 생산에 대한 능력을 유지하는 유전적으로 조작 가능한 바이러스의 생산을 가능하게 했습니다6. 이 시스템은 전체 게놈의 맥락에서 바이러스 유전자의 표적 돌연변이 유발 및 기능 분석을 용이하게 합니다. BAC-16 또는 KSHV로 잠복적으로 감염된 iSLK 또는 BCBL-1 세포를 사용하는 재활성화 모델은 이후 KSHV 용해 복제를 연구하기 위한 표준이 되었습니다. 이 시스템은 독시사이클린(Dox) 및 부티르산나트륨 7,8과 같은 제제를 사용하여 용해 주기의 동기화된 유도를 허용합니다. 그러나 재활성화 모델은 바이러스 침입, 세포 내 트래피킹, 잠복기와 용해 복제 사이의 초기 결정을 포함한 초기 감염 단계를 우회하기 때문에 1차 감염 역학을 완전히 요약할 수 없습니다.

새로운 감염 모델은 이러한 격차를 해결하기 위한 보완적인 프레임워크를 제공합니다. 인간 내피 및 치은 상피 세포와 같은 여러 일차 세포 모델은 KSHV de novo 감염 후 용해 복제를 지원하는 것으로 나타났습니다 3,9,10,11. 그러나 제한된 수명, 높은 비용 및 유전자 조작에 대한 적합성이 낮기 때문에 기계론적 연구에 대한 재현성과 확장성이 제한됩니다. 이 프로토콜에서 우리는 HCT 116 인간 대장 암종 세포주를 사용하여 KSHV de novo 용해 감염의 다루기 쉽고 확장 가능한 모델을 설명합니다. KSHV의 자연적인 표적은 아니지만 HCT116 세포는 감염에 대한 강력한 허용성을 나타내며 기계론적 연구 및 고처리량 응용 분야에 적합한 안정적이고 비용 효율적인 플랫폼을 제공합니다. KSHV의 배양 중 제한된 플라크 형성 능력을 감안할 때 GFP 리포터를 통합한 BAC16 시스템을 활용하여 감염을 위한 무세포 바이러스를 생성합니다. 이를 통해 감염된 세포를 직접 시각화하고 GFP 기반 감염 단위(IU) 분석을 통해 감염 역가를 정량화할 수 있습니다12. 이를 보완하기 위해 DNase 처리 후 정량적 실시간 PCR(qPCR)으로 비리온 관련 DNA를 측정하여 캡슐화된 바이러스 게놈을 검출하는 민감한 방법을 제공합니다. 함께, 이러한 분석은 1차 감염 동안 용해 복제 역학에 대한 시간적으로 해결된 정량적 분석을 허용합니다.

이 프로토콜은 시험관 내에서 KSHV de novo 용해 감염을 모델링하기 위한 안정적이고 유연한 플랫폼을 제공하여 바이러스 수명 주기의 초기 사건 해부를 용이하게 하며 유전자 기능 및 항바이러스 활성을 평가할 수 있습니다.

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프로토콜

KSHV는 생물안전성 레벨 2(BSL-2) 인간 병원체로 분류됩니다. 인증된 BSL-2 생물안전 캐비닛에서 감염성 물질과 관련된 모든 절차를 수행합니다. 각 시술 전후에 70% 에탄올로 작업 표면의 오염을 제거합니다. 모든 폐기물은 기관 생물 안전 규정 및 WHO BSL-2 지침에 따라 폐기하십시오. 전체 워크플로우의 개략적 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 이 절차에는 재활성화된 iSLK 세포에서 무세포 BAC16 유래 KSHV 생성, HCT 116 세포의 새로운 감염, 감염 단위(IU) 분석에 의한 바이러스 역가의 정량화, 비리온 관련 바이러스 DNA의 qPCR 분석이 포함됩니다. 사용된 시약과 장비는 재료표에 나와 있습니다.

1. 무세포 BAC16 유래 KSHV 생산

  1. 약 80% 컨플루언션에서 와이드형(WT) KSHV BAC 16(iSLK-BAC16)을 포함하는 Dox 유도성 iSLK 세포의 T75 플라스크 5개를 시드합니다. 가습된 5% CO 2 인큐베이터에서 37°C에서 24시간 동안 배양합니다.
  2. 각 플라스크에 1 μg/mL Dox 및 1 mM 부티르산나트륨을 첨가하여 용해 재활성화를 유도합니다. 72-96시간 동안 배양을 계속합니다.
  3. 위상차 현미경으로 매일 세포를 모니터링합니다. 세포의 >90%가 강력한 용해 반응을 나타내는 세포병증 효과(CPE)의 특징인 둥글림, 플라스크 표면으로부터의 분리 및/또는 눈에 보이는 용해를 나타내면 상청액을 수집합니다. 상청액 수집 후, 10% 표백제를 사용하여 용해적으로 유도된 iSLK-BAC16 세포를 오염을 제거하고 폐기합니다.
  4. 수집된 상청액을 4°C에서 10분 동안 1,500 x g 으로 원심분리하여 파편을 제거합니다. 펠릿을 방해하지 않고 0.45μm 폴리에테르설폰(PES) 멤브레인 필터를 통해 정화된 상청액을 여과합니다.
  5. 여과된 상청액을 초원심분리기 튜브로 옮깁니다. SW28 로터를 사용하여 4°C에서 3시간 동안 25,000 x g 에서 원심분리하여 바이러스 입자를 펠릿화합니다.
  6. 상청액을 10% 표백제에 조심스럽게 버립니다. 바이러스 펠릿을 1mL 무혈청 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에 재현탁합니다.
  7. 재현탁된 바이러스를 멸균된 스크류캡 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 분취합니다. 사용할 때까지 분취량을 -80°C에서 보관하십시오. SLK 세포에서 GFP 기반 감염 단위(IU) 분석을 사용하여 바이러스 스톡의 감염 역가를 결정합니다(3단계 참조).

2. HCT116 세포의 새로운 감염

참고: 높은 감염 다중도(MOI)는 새로운 KSHV 감염 후 HCT116 세포에서 용해 복제를 효율적으로 시작하는 데 중요합니다. 이 조건은 외인성 자극 없이도 강력한 바이러스 유전자 발현과 생산적인 복제를 가능하게 합니다. 비리온 생산에 대한 MOI 의존적 효과를 입증하는 대표적인 결과는 보충 그림 1A에 제공된다.

  1. 12웰 조직 배양 플레이트에 웰당 1 x 105 HCT116 세포를 시드합니다. 가습된 5% CO 2 인큐베이터에서 37°C에서 24시간 동안 배양합니다.
  2. 미리 예열된 무혈청 DMEM에서 농축된 바이러스 스톡을 최종 부피 250μL로 희석하여 감염 다중도(MOI)를 10으로 달성합니다.
  3. 각 웰에서 배양 배지를 흡인합니다. 250 μL의 희석된 바이러스를 세포에 직접 첨가합니다.
  4. 감염(spinoculation)을 동기화하기 위해 플레이트를 30°C에서 1시간 동안 1,500 x g 으로 원심분리합니다. 즉시 플레이트를 37°C 인큐베이터로 옮기고 추가로 1시간 동안 인큐베이션을 계속합니다.
  5. 접종물을 흡인하고 예열된 PBS로 세포를 세 번 세척하여 잔류 바이러스를 제거합니다. 각 웰에 1mL의 완전 DMEM을 추가합니다.
  6. 감염 후 36시간, 60시간 및 96시간에 형광 현미경으로 감염된 세포에서 GFP 발현을 모니터링합니다. 각 시점에서 각 웰에서 1mL의 배양 상청액을 수집합니다.
    참고: 상청액 수집 후, KSHV에 감염된 HCT116 세포는 실험 목적에 따라 RNA 추출, 단백질 분석, 면역형광 또는 유세포 분석과 같은 다운스트림 응용 분야를 위해 보존될 수 있습니다.
  7. 수집된 상청액을 4°C에서 10분 동안 1,500 x g 으로 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다. 정화된 상청액을 신선한 튜브로 옮깁니다. 액체 질소에서 급속 냉동하고 추가 분석을 위해 -80°C에서 보관합니다.

3. 감염 단위 분석(IU 분석)

참고: SLK 세포는 KSHV 진입을 허용하고 조기 용해 유전자 발현을 지원합니다. 이 분석은 연속적으로 희석된 바이러스 함유 상청액에 노출된 후 감염된 SLK 세포에서 GFP 발현을 기반으로 감염 단위를 정량화합니다.

  1. 감염 24시간 전에 96웰 플레이트에서 웰당 1 x 104 SLK 세포를 시드합니다. 세포가 고르게 분포되어 감염 당일 ~60%-70% 합류에 도달하는지 확인하십시오.
  2. 연속 2배 희석을 위한 9개의 1.5 mL 미세 원심분리기 튜브에 라벨을 붙입니다: 튜브 1(희석되지 않은 1:1), 튜브 2(1:2), 튜브 3(1:4), 튜브 4(1:8), 튜브 5(1:16), 튜브 6(1:32), 튜브 7(1:64), 튜브 8(1:128) 및 튜브 9(1:256).
  3. 200 μL의 바이러스 상청액을 튜브 1에 첨가합니다. 100μL의 예열된 무혈청 DMEM을 튜브 2 내지 9의 각 튜브에 추가합니다. 희석 시리즈를 시작하려면 튜브 1에서 튜브 2로 100μL를 옮기고 위아래로 피펫팅하여 완전히 혼합합니다. 그런 다음 튜브 2에서 튜브 3으로 100μL를 옮기고 튜브 9를 통해 이 과정을 순차적으로 반복하면서 각 단계에서 완전히 혼합합니다.
    참고: 각 튜브에는 100μL의 최종 부피가 포함되어야 합니다. 모든 희석을 세 번으로 수행합니다.
  4. SLK 세포에서 배양 배지를 흡인합니다. 각 바이러스 희석액 100μL를 지정된 웰에 추가합니다. 총 27개의 웰을 사용합니다(1:1에서 1:256까지 희석당 3웰).
  5. 바이알 흡착을 촉진하기 위해 96웰 플레이트를 30°C에서 1,500 x g 에서 1시간 동안 원심분리합니다. 플레이트를 37°C CO2 인큐베이터에 추가로 1시간 동안 옮깁니다.
  6. 접종물을 제거하고 각 웰에 100μL의 완전 DMEM을 부드럽게 첨가합니다. 플레이트를 37°C에서 24시간 동안 배양합니다.
  7. 세포를 수확하고 유세포 분석법으로 GFP 발현을 분석합니다. 웰당 GFP 양성 세포의 수를 기록합니다.
  8. 다음 공식13을 사용하여 mL당 감염 단위(IU/mL)를 계산합니다.
    IU/mL = [(웰당 GFP 양성 세포 수)/ 접종량(mL)] x 희석 계수. 검출 가능한 GFP 양성 세포로 마지막 희석액을 사용하여 최종 바이러스 역가를 결정합니다.

4. qPCR에 의한 캡슐화된 바이러스 게놈의 정량화

  1. DNase I을 100 U/mL의 최종 농도에 400 μL의 정화된 상청액에 첨가합니다(상청액 정화 및 파편 제거에 대해서는 1단계 참조). 캡슐화되지 않은 바이러스 및 세포 DNA를 소화하기 위해 37°C에서 15분 동안 배양합니다. DNase 처리의 특이성 및 효과를 입증하는 대표적인 결과는 보충 그림 1B에 나와 있습니다.
  2. DNase 반응을 중지하기 위해 최종 농도 50mM에 EDTA를 첨가합니다. DNase I을 비활성화하기 위해 75°C에서 15분 동안 배양합니다.
  3. 제조업체의 프로토콜에 따라 DNA Mini Kit를 사용하여 DNase 처리된 상청액에서 바이러스 DNA를 추출합니다.
  4. 바이러스 DNA를 30 μL의 용출 완충액으로 용출합니다. 각 qPCR 반응에 용출된 DNA 5μL를 사용합니다.
  5. 다음 프라이머를 사용하여 KSHV 개방형 판독 프레임(73, ORF 73)을 증폭한다: 정방향: 5'-CCGAGGACGAAATGGAAGTG-3'; 역방향: 5'-GGTGATGTTCTGAGTACATAGCGG-3.
  6. SYBR Green Master SuperMix를 사용하여 qPCR 반응을 3부로 준비합니다. 다음과 같이 사이클링 조건을 설정합니다. 초기 변성: 95°C에서 3분; 증폭: 10초 동안 95°C, 30초 동안 52°C, 30초 동안 72°C의 40사이클; 용융 곡선 분석: 앰플리콘 특이성을 위한 표준 램프.
  7. 반응당 109 내지 101 카피 범위의 BAC-16 유래 바이러스 DNA의 10배 연속 희석을 사용하여 표준 곡선을 생성합니다. 분석 선형성을 평가하기 위해 입력 복제 수의 로그10에 대해 Ct 값을 플로팅합니다. 대표적인 표준 곡선은 보충 그림 1C에 나와 있습니다.
  8. Ct 값을 표준 곡선과 비교하여 바이러스 게놈 복제 수를 결정합니다. 상청액 mL당 바이러스 DNA 사본으로 결과를 정규화하고 보고합니다.

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결과

감염성 바이러스의 역가를 정량화하기 위해 iSLK-BAC16 세포의 용해 재활성화 후 72시간 후에 수확된 상청액을 2배 연속 희석하여 SLK 세포를 감염시키는 데 사용했습니다. 각 희석에서 GFP 양성 SLK 세포의 수는 그림 2A에 나와 있으며, mL당 해당 감염 단위(IU)를 계산하여 도 2B에 제시했습니다. 새로운 용해 복제의 효율성을 평가하기 위해 HCT 116 세포를 MOI 10에서 iSLK-BAC16 유래 비리온으로 감염시켰습니다(그림 2C). 감염 후 36, 60 및 96시간에 상청액을 수집하고 감염성 바이러스의 생산을 평가하기 위해 SLK 세포에 적용했습니다. GFP 형광 이미징(그림...

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토론

KSHV의 새로운 용해 감염 모델링은 대부분의 허용 세포 유형에서 잠복기를 설정하려는 바이러스의 강한 성향으로 인해 오랫동안 방해를 받아왔습니다. 내피 및 구강 상피 세포와 같은 특정 일차 세포는 새로운 감염 9,10 후 용해 복제를 지원하는 것으로 나타났지만, 제한된 수명, 높은 비용 및 배양 유지 관리의 기술적 어려움은 재현성과 확장성을 감소시킵니다. 최근 연구에 따르면 원발성 KSHV 감염의 결과는 세포 및 환경적 맥락에 크게 의존합니다. 예를 들어, 저산소증은 내피 세포에서 HIF-1α 축적을 통해 용해성 감염을 촉진하는 반면, FOXQ1 발현과 같은 상피 전사 인자는 구강 상피 세포에서 용해성 유전자 발현을 유발할 수 있습니다10,15

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공개 사항

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

감사의 글

저자는 재조합 KSHV를 생산하는 iSLK-BAC16 세포주를 공유해 주신 Jae U. Jung 박사(클리블랜드 클리닉)에게 감사의 말씀을 전하고 싶습니다. 그래픽 디자인은 저자가 라이선스를 보유하고 있는 BioRender.com 를 사용하여 만들어졌습니다. 이 작업은 NIH가 C. Liang(PI)에게 R21 DE028256, R01 CA140964 및 R01 CA262631, Q. Zhu에게 Wistar Science Accelerator Postdoctoral Award를 수여했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.45 & 마이크로; m 폴리에테르설팜(PES) 필터 VWR76479-020
바이오렌더바이오렌더해당 사항 없음그래픽 디자인은 저자가 라이선스를 보유하고 있는 BioRender.com
만들어졌습니다.
CFX Opus 96 Real-time PCR 시스템바이오 래드184-5072
DMEM 완료Dulbecco의 변형 Eagle's 배지(DMEM; Sigma-Aldrich)에 10%(v/v) 소 태아 혈청(FBS; Gibco), 2mM L-글루타민(Gibco) 및 100U/ml 페니실린-스트렙토마이신(Pen-Strep; GenClone)을 사용합니다.
DNase I뉴잉글랜드 바이오랩스M0303S
독시사이클린시그마-알드리치디9891
LSR II 18 유세포 분석기BD 생명과학해당 사항 없음
PerfeCTa SYBR 그린 마스터 슈퍼믹스콴타비오95054-02케이
QIAamp DNA 미니 키트키아겐56304
부티르산나트륨(NaB)시그마-알드리치B5887
울트라퓨어 0.5M EDTA, pH 8.0써모 피셔15575020

참고문헌

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