이 프로토콜은 레이저 반점 조영 영상 및 침습적 혈압 측정을 사용하여 마취된 쥐의 피부에서 폐색 후 반응성 충혈의 매개변수를 평가하는 방법을 제시합니다.
방법 논문
* These authors contributed equally
이 프로토콜은 레이저 반점 조영 영상 및 침습적 혈압 측정을 사용하여 마취된 쥐의 피부에서 폐색 후 반응성 충혈의 매개변수를 평가하는 방법을 제시합니다.
LSCI(Laser Speckle Contrast Imaging)는 인간과 실험 동물의 미세혈관 관류를 평가하기 위한 현대적인 비침습적 기술입니다. LSCI와 침습적 혈압(BP) 측정 및 혈관 폐색 검사의 조합은 폐색 후 반응성 충혈(PORH)을 연구하여 미세혈관 혈류 예비력 및 혈관 반응성을 평가할 수 있도록 합니다. 이 기사에서는 LSCI를 사용하여 전신 마취 하에 쥐의 뒷발에서 PORH를 기록하고 시각화하는 기술을 보여줍니다. 특수 공압 커프를 팽창시켜 경골 수준에서 일시적인(180초) 혈관 폐색을 생성합니다. 후속 PORH(최대 충혈 및 동역학 지수)의 평가는 연구 중인 병리학적 과정(순환 쇼크, 심부전, 고혈압 등)의 메커니즘 및 중증도에 대한 추가 정보를 제공하거나 휴식 시 관류를 평가할 때 명백하지 않은 신약의 혈관 효과를 식별할 수 있습니다. 침습적 혈압 모니터링을 통해 피부 혈관 전도도를 계산하고 전신 혈역학의 변화를 고려할 수 있으며, 이는 중대한 질병의 실험 모델에서 특히 중요합니다. 출혈성 쇼크의 쥐 모델에서 미세혈관 기능 장애를 식별하기 위해 이 접근법을 사용하는 것도 시연될 것입니다.
미세혈관 기능 장애는 많은 심혈관, 내분비 및 기타 질병의 병인에 관여하여 조직 관류 및 산소 공급을 손상시키고 전신 혈역학의 혈관 운동 조절 메커니즘을 방해합니다(예: 고혈압)1. 미세순환 장애는 또한 외상, 패혈증 및 다양한 유형의 쇼크(출혈성, 패혈성, 심인성 등)가 있는 중환자의 장기 기능 장애 메커니즘에서 병태생리학적 중요성이 큽니다.2.
현재 조직 관류 및 미세혈관 기능의 비침습적 평가를 위한 임상 및 전임상 연구에는 레이저 도플러 유량계(LDF), 레이저 도플러 영상(LDI/LDPI) 및 레이저 반점 조영 영상(LSCI)과 같은 여러 레이저 기반 방법이 사용됩니다. 그 중 LSCI는 클리닉에서 피부 관류의 비침습적 평가에 가장 유망합니다. 이 방법은 실행에 적용하기 쉽고 높은 공간 및 시간 해상도로 전체 조사 영역의 시각화를 제공하기 때문에 LDF 및 LDI/LDPI에 비해 분명한 이점이 있습니다3. LSCI는 레이저 광을 사용하여 반점 패턴을 생성한 다음 이를 분석하여 혈류 역학을 시각화하는 기술입니다. 임상 및 실험 환경 모두에서 신경과학4, 복부 수술5, 피부과6 및 기타 혈관 연구 7,8과 같은 다양한 연구 분야에 필수적인 미세 순환에 대한 실시간 고해상도 평가가 제공됩니다.
휴식 시 피부 관류 값에 대한 간단한 평가는 종종 미세혈관 장애를 식별하는 데 유익하지 않습니다. 이는 피부 순환의 본질적인 기능적 특성(높은 변동성, 온도에 대한 의존성, 스트레스 및 기타 요인)과 신체의 보상 반응 중 "잘못 정상적인" 조직 관류(예: 패혈성 쇼크 초기 단계에서 심박출량 증가) 때문입니다. 표준 기능적 부하를 추가로 사용하면 미세 순환을 더 잘 평가하고 휴식 조건에서 숨겨진 미세혈관 기능 장애를 식별할 수 있습니다1. LSCI는 약리학적 자극9 하에서 피부 미세순환을 평가하는 데 유용한 것으로 알려져 있습니다.
LSCI와 혈관 폐색 검사의 조합은 미세순환의 중요한 기능적 매개변수, 특히 혈류 예비력 및 미세혈관 구조의 반응성을 반영하는 폐색 후 반응성 충혈(PORH) 현상을 비침습적으로 평가할 수 있습니다10. 이 접근법은 기준선 관류 측정에서 명백하지 않은 기능적 미세순환 이상을 식별하기 위한 임상 연구에서 널리 사용되지만11 PORH 평가는 전임상 동물 연구에서 드뭅니다12,13. 임상 연구와 비교하여 생체 내 실험에서 혈관 폐색 테스트를 사용하면 연구자에게 PORH의 메커니즘, 중증 질환의 병인 및 혈관활성 약물의 약력학을 평가할 수 있는 추가 기회를 제공합니다. 물론 이러한 기회는 동물에 대한 인도적인 대우에 대한 현대 생명윤리 기준의 한계 내에 있어야 합니다.
이 프로토콜은 LSCI 및 침습적 혈압 측정을 사용하여 마취된 쥐의 피부에서 PORH 매개변수를 평가하는 방법을 제시합니다. 후자는 쥐의 경동맥 카테터 삽입을 포함하며 평균 동맥압(MAP) 및 맥박수를 측정할 수 있습니다. 또한 실험실 테스트(예: 동맥혈 가스 분석). 이 프로토콜은 주로 실험 절차(예: 치명적인 질병 모델링)가 완료된 후 동물을 마취에서 깨우는 것을 포함하지 않는 급성 실험을 지향한다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 쥐의 미세순환을 평가하기 위해 우리가 제안하는 방법은 비교적 간단하며 내피 기능 장애 평가를 포함한 비교 혈관 생리학 및 병태생리학 연구와 새로운 혈관작용제의 전임상 테스트에 특히 유용할 것입니다.
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아래에 설명된 절차는 중환자실 의학 및 재활학의 연방 연구 및 임상 센터의 윤리 검토 위원회에서 승인한 프로토콜의 일부로 수행되었습니다.
1. 혈관 폐색을 위한 공압 커프의 준비
2. 동맥 카테터, 워크스테이션 및 수술 기구의 준비
3. 마취 및 수술 전 처리
참고: 모든 마취제는 호흡과 순환을 억제할 수 있습니다. 치명적인 과다 복용을 방지하려면 동물 종, 균주, 연령 및 건강 상태에 따라 적절한 투여가 중요합니다. 직원은 동물 마취 및 활력 징후 모니터링에 대한 교육을 받아야 합니다. 절차는 관련 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC) 또는 이에 상응하는 윤리 기관의 승인을 받아야 합니다. 바늘, 메스 및 기타 날카로운 도구를 다룰 때는 주의해야 합니다. 즉시 폐기하려면 항상 날카로운 용기를 사용하십시오. 바늘을 다시 캡핑하지 마십시오. 인수공통전염병을 전염시키거나 신체적 외상을 유발할 수 있는 바늘 찔림 부상의 위험에 유의하십시오.
4. 좌경동맥 카테터 삽입
5. 침습적 혈압 측정
6. LSCI를 이용한 피부 관류 측정
7. 혈관 폐색 검사 및 PORH 평가
(1)
(2)
(3)8. 실험 절차 및 반복 측정
9. 실험 종료
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위에서 설명한 미세혈관 기능 평가 방법은 체중 250-300g의 Wistar 수컷 쥐에서 출혈성 쇼크(계산된 혈액량의 35%의 실혈)를 모델링하는 일련의 실험에 적용되었습니다. 출혈이 있는 동물 그룹(HS, n = 13)에서 출혈 완료 후 30분 후에 침습성 혈압의 동시 모니터링과 함께 PORH 매개변수 평가를 수행했습니다. 가짜 수술 동물(가짜, n = 10)의 대조군에서는 출혈이 유도되지 않았지만 비슷한 기간 동안 동일한 측정이 수행되었습니다. 그룹 간 차이는 Mann-Whitney U 테스트를 사용하여 분석되었습니다. 결과는 중앙값과 사분위수 범위로 표현됩니다.
그림 4는 동물의 대조군과 비교하여 급성 실혈에 의해 유발된 PORH(혈관 폐색 180초 후)의 변화를 보여줍니다. 실혈 후 출혈...
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여기에서 우리는 설치류의 생체 내 실험에서 피부 미세 순환 및 혈관 반응성을 평가하기 위한 현대화된 기술을 설명합니다. 생리학적 및 약리학적 연구에서 이 방법을 성공적이고 표준화하여 사용하려면 몇 가지 추가 고려 사항을 고려해야 합니다. 위의 프로토콜에서 쥐는 틸레타민 + 졸라제팜 + 자일라진의 조합으로 마취되며, 이는 주로 실험 동물 작업에 대한 현지 표준과 부프레노르핀, 케타민 및 기타 일반적으로 사용되는 주사 가능한 진통제 및 마취제에 대한 접근이 제한되어 있습니다. 경미한 수술과 관련된 약리학적 연구의 경우 적절한 장비를 사용할 수 있는 경우 이소플루란/세보플루란 단일 마취가 선호됩니다. 서로 다른 마취 요법이 혈역학적 매개변수에 영향을 미칠 수 있지만 이 연구에서는 주사 마취와 흡입 마취 사이의 직접적인 비교가 수행되지 않았습니다. 모든 실험 그룹에서 동일한 주사 프로토콜을 사용하여 일관성이 유지되었습니다."
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저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
이 작업은 프로젝트 24-25-00310에 따라 러시아 과학 재단의 지원을 받았습니다.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 외과용 봉합사 나일론이 있는 무외상 바늘, 4C-0.5x16-4/0-N | Medtekhnika, 러시아 | 해당 사항 없음 | 파랑. 길이 75cm. USP 4/0(MP1.5). 수술 상처 봉합용 |
| 뭉툭한 끝 주사기 바늘이 있는 쥐 경동맥용 카테터 22G | SciCat, 러시아 | 해당 사항 없음 | PE-50, 길이 12cm, OD=0.9mm, ID=0.6mm. 고정 링 1개 포함 |
| Deltran 일회용 압력 변환기 | 유타 메디컬 프로덕츠, US | 6069 | 12인치 케이블 |
| 주입 요법 및 모니터링을 위한 DiscofixC 3방향 마개 | B. 브라운, 독일 | 16494C | |
| 덤플링을 | 벨메드프레파라티, 벨로루시 | 해당 사항 없음 | 헤파린 나트륨 5000 IU/ml, 앰플 5 mL |
| 리도카인 | Velpharm, 러시아 | 해당 사항 없음 | 주사용 용액 20 mg/mL, 앰플 2 mL |
| 공압 커프 "수축기" | 뉴로보틱스, 러시아 | 해당 사항 없음 | 설치류를 위한 비침습적 혈압 측정의 일부. 유형 5-10mm 꼬리 (쥐) |
| 소금 | Pharmasyntez, 러시아 | 해당 사항 없음 | 주입 용액 0,9%, 250mL |
| 소프트웨어 실험실차트8 | ADInstruments, 오스트레일리아 | 해당 사항 없음 | 버전 8.1.13 |
| 소프트웨어 MATLAB | MathWorks Inc., 미국 | 해당 없음 | 버전 R2019b |
| 일회용 멸균 주사기, 1 mL, 3액형 | Huaian City Hengchun Medical Product Co. Ltd., 중국 | 해당 없음 | 27G 바늘 |
| 일회용 멸균 주사기, 2 (2.5) mL, 3액형 | Vogt Medical Vertrieb GmbH, 독일 | 1310524 | 23G 바늘 |
| 봉합사 SILK-S | 폴리테크메드, 러시아 | 해당 사항 없음 | 비흡수성, 꼰, 실리콘 코팅이 된 천연 실크로 제작되었으며 카세트에 검은색이 있습니다. USP 4/0(MP1.5). 길이 100m. 혈관 결찰용 |
| 자일라 | Interchemie, 네덜란드 | 해당 없음 | 자일라진 20 mg/mL, 50 mL |
| 졸레틸 100 | Virbac, 프랑스 | 해당 없음 | 틸레타민 HCl 50 mg/mL, 졸라제팜 HCl 50 mg/mL, 5 mL |
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