하체 동맥경화증 환자 당뇨병 쥐 모델의 확립 및 평가

요약

하지 동맥경화증은 당뇨병의 흔한 합병증입니다. 여기서는 혈관에 에탄올을 주입해 혈관 구조를 교란시켜 죽상동맥경화성 폐쇄성 질환의 진행을 시뮬레이션하는 새로운 동물 모델링 방법을 제시하여, 이를 통해 혈관 질환 치료에 새로운 플랫폼을 제공합니다.

초록

이 연구는 당뇨병 쥐에서 하체 동맥경화증(ASO)의 새로운 쥐 모델을 확립하고 검증하는 것을 목표로 했습니다. 전통적인 대퇴동맥 결찰술과 달리, 우리는 외장골동맥에 95% 에탄올(0.1mL)을 주입했습니다. 수술 후 1, 3, 7, 14일차에 도플러 초음파, 열화상, 습식 근육량 측정을 통해 동맥 폐색과 후지 허혈을 평가하였다. 혈관과 근육 조직의 조직학적 분석이 수행되어 모델의 성공률과 안정성을 평가하였습니다. 고농도의 에탄올(95%)은 혈관 내피 세포 손상을 유발하여 대퇴동맥 폐색을 초래합니다. 대조군과 비교했을 때, 도플러 초음파 검사에서 영향을 받은 사지의 동맥 직경이 점진적으로 감소하고 혈류가 증가하는 것이 확인되었습니다. 열화상 촬영에서는 사지 온도 감소가 확인되었고, 근육량 측정에서는 동측 근육량이 유의미하게 감소한 것으로 나타났습니다. 조직병리학적 분석 결과 동맥 내강 폐색, 미세혈관 밀도 감소, 시간이 지남에 따라 병변 악화가 진행됨이 확인되었습니다. 결론적으로, 95% 에탄올을 장골동맥에 주입하면 하체 동맥 폐색의 병태생리학적 특성을 효과적으로 재현하여, 당뇨병 쥐에서 폐쇄된 동맥경화증을 연구하는 새로운 모델을 제시합니다.

서론

당뇨병 하체 동맥 폐색(DLEAO)은 당뇨병 환자의 장애와 사망의 주요 원인으로, 삶의 질을 심각하게 저하시키고 상당한 사회경제적 부담을 가합니다¹. 당뇨병성 동맥질환의 병인기전은 고혈당, 지질이상, 만성 염증, 혈관 기능 장애 간의 복잡한 상호작용을 포함합니다². 동물 모델은 이러한 메커니즘을 밝히는 데 중요한 역할을 했으며, 치료 개발에 중요한 통찰을 제공해 왔습니다. 동물 모델은 인간 당뇨병 환자의 말초 동맥질환(PAD)의 병태생리를 시뮬레이션하는 데 유용한 도구로 활용됩니다. 이 모델들은 질병 진행을 조사하고 기저 메커니즘을 밝히는 고처리량 재현 연구를 가능하게 합니다. 더불어, 동물 모델을 이용한 전임상 시험은 약리학적 약물, 유전자 치료, 재생 의학 접근법(예: 줄기세포 ^치료)을 포함한 새로운 치료제에 필수적인 데이터를 제공합니다3. 이러한 기초 연구는 이후 임상시험에 정보를 제공하고 중개 의학을 발전시키는 데 매우 중요합니다.

현재 대퇴동맥 결찰(FAL) 방법은 실험실에서 후지 허혈의 쥐 모델을 구축하는 데 널리 사용되고^{있습니다.} 이 방법은 하지에서 허혈 증상을 빠르게 유발합니다⁵; 그러나 이로 인한 동맥 혈전증은 하체 동맥질환(LEAD) 환자에서 관찰되는 병태생리학적 진행과는 다르며, LEAD는 내피 손상, 염증 인자 축적, 평활근 세포 증식을 포함합니다 ^2,6. 또한 FAL은 신생혈관형성과 측부 혈관 형성을 촉진하여 모델링 직후 저유량 관류를 회복^{시킵니다.} 이는 당뇨병 LEAD의 만성 진행과는 대조적입니다. 따라서 인간 동맥경화의 병태생리학적 기전을 보다 정확하게 재현하는 동물 모델 개발이 필요합니다.

당뇨병 동물 모델에서 풍선 카테터나 화학적 유도(예: 염화철 자극)를 통한 대퇴동맥 내막 기계적 손상은 내피 탈출, 염증 세포 침윤, 평활근 세포 이동/증식 등 병리학적 변화를 효과적으로 유발합니다⁸. 이 접근법은 인간 죽상경화증의 특징적인 병리학적 특징을 더 잘 재현합니다. 전통적인 FAL 모델과 비교할 때, 에탄올 유도 방법의 핵심 장점은 당뇨병 LEAD의 복잡한 병태생리학적 과정을 보다 정확하게 시뮬레이션할 수 있다는 점에 있습니다. 에탄올은 혈관 내피를 직접 파괴하여 혈소판 응집과 혈전증을 활성화하여 당뇨병 LEAD⁹의 초기 반응을 모방합니다. 더 중요한 것은, 혈관 미세구조를 점진적으로 파괴함으로써 에탄올이 FAL 모델에서 흔히 볼 수 있는 빠른 측부 순환 보상을 효과적으로 피하여, 당뇨병 LEAD¹⁰의 전형적인 만성 저관류 상태를 성공적으로 재현한다는 점입니다. 반면, 대퇴동맥 결찰 유도 허혈 모델은 주목할 만한 한계가 있습니다: 설치류(예: 쥐, 쥐)는 잘 발달된 측부 순환 덕분에 급성 허혈을 빠르게 보상하여 허혈 중증도가 일관되지 않고 인간 임계 사지 허혈(CLI)의 재현이 불안정합니다^11,12. 더불어, 인간 말초 동맥질환(PAD)은 주로 동맥경화증의 만성 진행에서 비롯된 반면, 대퇴동맥 결찰 모델은 급성 허혈성 사건을 나타내며, 근본적으로 구별되는 병태생리학적 기전을^{나타냅니다.} 본 연구의 주요 목적은 환자의 질병 진행을 정확히 모방하는 안정적이고 장기적인 당뇨병 하체 동맥경화증(LEAOD)의 실험 모델을 확립하고 특성화하는 것이었습니다. 에탄올 유도 폐색은 수술적으로 간단하며, 최소 침습 주사만으로 기술적 장벽과 동물 사망률을 줄여줍니다. 주요 매개변수는 쉽게 표준화되어 높은 재현성을 보장합니다. 더불어 이 방법은 비용 효율적이며, 전문 장비의 필요성을 없애고, 실험실 간 전환이 용이합니다. 현재로서는 새로운 치료 중재를 검증할 수 있는 지속 가능한 동물 모델이 부족합니다.

프로토콜

이 연구는 옌타이 위황딩 병원 동물윤리위원회가 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 이 연구는 12시간 빛/어둠 주기 하에 사육된 40마리의 수컷 스프래그-도울리 쥐(체중: 250-300g, 나이: 6주)를 사용했습니다. 생후 7주부터 고지방, 고자당 식단¹⁴^,¹⁵ 자유롭 게 먹였으며, 8주간 자유롭게 물을 마실 수 있었습니다. 식단 시작 4주에 스트렙토조신(STZ) 주사¹⁶로 당뇨병이 유도되었습니다. 8주 후, 당뇨병 모델의 성공적인 확립이 확인된 후 후속 실험을 진행하였습니다. 아래에 설명된 14주 된 쥐를 대상으로 하지동맥 폐색 수술이 시행되었습니다.

1. 당뇨병 쥐에서 후지 동맥경화증의 외과적 유도

1. 재료표에 기재된 모든 수술 기구와 자재 를 준비하고 그림 1에 나타난 대로 준비하세요.
2. 마취기로 쥐를 마취시키고, 이소플루란(1.5-2.5%)과 산소(산소₂, 1-2 L/분)를 투여합니다. 자연 호흡을 유지하는 것이 중요합니다. 발가락 꼬집는 반사를 통해 마취의 깊이를 평가하여 외과적 마취 평면을 확보하세요.
3. 쥐를 구속 플랫폼 위에 누운 자세로 눕히세요. 제모 크림과 면도날을 사용해 복부에서 하체까지 털을 제거하세요.
4. 팔다리를 고정해. 뒷다리 피부를 알코올로 소독하세요. 굽은 겸자와 가위를 사용해 오른쪽 허벅지 내측에 2-3cm 절개를 하세요.
   참고: 모든 수술 절차는 동물 모델의 일관성과 재현성을 보장하기 위해 경험 많은 외과의사가 수행했습니다.
5. 현미경으로 주변 조직을 해부하여 외장골동맥/정맥과 대퇴신경을 노출시킵니다. 혈관과 신경을 분리하세요. 외장골동맥이 표면 동맥과 심부 대퇴동맥으로 분기되는 지점을 추적합니다.
6. 대퇴동맥 중간 구간과 대퇴동맥 심부를 혈관 클립으로 클램프하세요. 원위 외장골동맥에 95% 에탄올 0.1mL를 천천히 주입하세요. 60초 후에는 클립을 제거하고; 압박을 통해 지혈을 달성하세요. 상처를 한 겹씩 봉합하세요.
   참고: 주사 중 동맥이 즉시 하얗게 변하고 동측 발의 일시적 떨림이 관찰되어 에탄올 혈관 내 투여가 성공적으로 확인되었습니다.
7. 수술 후 영향을 받은 팔다리를 움직이지 마세요. 감염을 예방하기 위해 페니실린 나트륨 주사(400,000 IU)를 근육 주사로 투여하세요.
   참고: 이 단측 하체 동맥 폐색 모델에서는 반대쪽 다리가 대조군 역할을 합니다. 폐쇄 시간은 시술 후 24시간부터 계산됩니다.

2. 하체 온도 측정

1. 쥐를 마취하고 수술 플랫폼 위에 누운 자세로 눕히세요.
2. 뒷다리 양쪽을 면도하고 대칭적으로 배치하세요.
3. 적외선 열화상계를 사용해 양쪽 뒷다리의 온도를 측정하세요.

3. 동맥 직경과 혈류 속도

1. 쥐를 마취하세요.
2. 초음파 시스템과 탐침을 준비해.
   1. 초음파 기기를 켜려면 전면 패널의 전원 버튼을 눌러야 합니다.
   2. 고주파 선형 배열 프로브(예: 40 MHz)를 선택하여 시스템에 연결하세요.
   3. 프로브 표면에 충분한 양의 음향 결합 젤을 발라.
3. 얕은 대퇴동맥을 찾아.
   1. 체온을 유지하기 위해 쥐를 보온기 패드 위에 엎드려 눕히세요.
   2. 무릎 관절 위 약 1-2cm 지점에서 전동 클리퍼를 사용해 허벅지 안쪽 털을 양쪽으로 밀어주세요.
   3. 면도한 부위에 피부 표면에 수직으로 부드럽게 대세요.
   4. B-모드에서 프로브 위치를 조정하여 대퇴동맥을 맥동성 무울음 관 구조로 시각화하세요.
4. 동맥 직경을 측정하세요.
   1. 기계나 소프트웨어 인터페이스의 프리즈 버튼을 눌러 B-모드 이미지를 정지하세요.
   2. 화면 메뉴에서 측정 도구를 선택하세요.
   3. 캘리퍼 기능을 사용해 동맥의 가까운 벽에서 먼 쪽 벽까지 내경을 측정하세요.
   4. 같은 위치에서 세 번 측정을 반복하고 평균 값을 기록하세요.
5. 혈류 속도를 측정하세요.
   1. PW 도플러 아이콘을 클릭하여 펄스파 도플러 모드로 전환할 수 있습니다.
   2. 샘플 게이트를 동맥 내강 중심 위에 위치시킵니다.
   3. 각도 보정 도구를 사용해 도플러 각도를 ≤ 60°로 조정하세요.
   4. 업데이트 또는 캡처를 눌러 최소 3회 심장 주기 동안 속도 파형을 기록하세요.
   5. 소프트웨어의 자동 추적 기능을 사용해 수축기 최대 속도(PSV)와 이완기 말기 속도(EDV)를 계산하세요.
   6. 저장을 클릭하여 데이터를 저장한 후 결과를 스프레드시트(예: CSV, 엑셀) 파일로 내보내세요.

4. 근육 무게 측정

1. 심부 마취 후에는 경추 탈구로 쥐를 안락사시킨다.
2. 양쪽 뒷다리에서 비복근을 절단하여 아킬레스건을 보존하세요(그림 2).
3. 즉시 전자 저울에 근육을 올려 젖은 무게를 측정하세요.
4. 반대쪽 근육을 대조군으로 사용하세요.
5. 네 개의 시점에서 측정값을 비교하여 곡선 그래프로 제시하세요.

5. 조직병리학적 분석

1. 네 개의 시점 각각에서 한 그룹의 쥐를 빠르게 안락사시키세요.
2. 양측 표면 대퇴동맥을 즉시 채취하세요.
3. 동맥 조직을 4% 파라포름알데히드로 고정하세요.
4. 조직을 파라핀에 박고 두께 5μm로 절삭합니다.
5. 헤마톡실린과 에오신(H&E) 염색을 수행하여 조직병리학적 변화를 관찰합니다.

6. 통계 분석

1. 모든 데이터를 평균 표준편차(SD)± 표현하세요. p-값 <0.05에서 통계적으로 유의한 차이를 고려하세요.

결과

이 연구는 동맥 내 에탄올 주사를 이용해 당뇨병 SD 쥐에서 모델을 구축하였다(n = 40). 이 모델은 초음파로 주사 후 14일 이내에 반대쪽 동맥 직경과 혈류 속도가 감소한 것을 근거로 85%의 성공률(33/40)을 특징으로 하였습니다. 모델 관련 사망률은 8%(5/40)로 주로 초기 기간에 기록되었습니다. 에탄올의 세포독성은 괴저와 같은 비특이적 조직 손상 위험을 초래하지만, 면밀한 모니터링 결과 직경과 유량의 감소가 주요 의도 효과임이 확인되었습니다. 그룹 간 재현성(집단 간 변동성 < 15%)에도 불구하고, 이러한 변화의 규모에는 개인 간 변동성이 뚜렷하게 나타났다.

하부 온도 결과 분석
열상촬영 영상에서는 수술 후다리의 온도가 반대쪽에 비해 감소한 것으로 나타났습니다. 영향을 받은 팔다리와 그렇지 않은 팔다리 간의 체온 차이는 시간이 지남에 따라 점차 커졌고, 수술 쪽은 더 뚜렷한 감소를 보였다. 이 사지 온도 감소는 혈관 관류...

토론

요약하자면, 우리는 당뇨병 환자에서 관찰된 임상 증상과 매우 유사하게 진행성 동맥 폐색의 쥐 모델을 성공적으로 확립했습니다. 2주 이상 지속된 초음파 측정과 근육 습식 체중 평가를 통해 후지의 저관류 평가가 일관되게 이루어졌습니다. 대퇴동맥 결찰은 표면 혈관 폐색을 유도하면서도 온전한 심부정맥계를 통한 혈액 순환을 허용했다¹⁷. 근위 동맥이나 그 가지에서 결찰이 시행될 때는 측부 혈류가 감소하여 심각한 허혈성 증상을 초래합니다. 그러나 동일한 동맥이 동일한 위치에 연결되더라도, 측부 혈관 풍부도와 허혈 진행의 개인별 큰 차이로 인해 허혈성 손상의 정도가 다양합니다^18,19.

관찰된 급성 허혈은 환자의 임상적 진행 속도와 일치하지 않습니다. 대퇴동맥 결찰 후 허혈성 후지의 혈...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
그래프패드 버전 8.0.1			RRID:SCR_002798
휴대폰 기반 적외선 온도계	히크마이크로		HM-TJP10B-3AMF
스프래그-도울리 쥐	진남펑월 실험동물 육종 주식회사		250g
초음파 기계	베보 2100