방법 논문

죽상동맥경화성 심혈관 질환과 관련된 지단백질 하위 분획 분석에 폴리아크릴아미드 겔 전기영동의 적용

DOI:

10.3791/68996

⸱

2025년 10월 24일

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1Laboratory Medicine, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 심혈관 질환 위험 평가를 위한 중요한 진단 기반을 제공하는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 기반으로 하는 지단백질 하위 분획 분석 방법을 정교화하는 것을 목표로 합니다. LDL을 7개의 하위 분획으로 나눌 수 있습니다. LDL1과 LDL2는 큰 입자로 특징지어지는 반면, LDL3에서 LDL7은 작은 입자로 특징지어집니다.

초록

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저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL-C)은 죽상동맥경화성 심혈관 질환(ASCVD) 발병의 핵심 요인입니다. LDL-C 수치 상승은 죽상동맥경화반 형성 및 심혈관 사건의 위험과 밀접한 관련이 있습니다. 그러나 LDL의 이질성은 죽상동맥경화증을 촉진하는 능력에 큰 영향을 미칩니다. 연구에 따르면 저밀도 지단백(LDL) 입자는 작은 밀도 LDL(sdLDL)과 큰 부력 LDL(lbLDL)으로 더 분류될 수 있습니다. 이 중 sdLDL은 혈관 내피를 관통할 가능성이 더 높으며 특히 ASCVD와 관련된 산화 변형 활성이 더 강합니다. 대사 증후군, 당뇨병 및 고중성지방혈증 환자의 경우 LDL-C 수치는 정상일 수 있지만 sdLDL의 비율이 높아져 심혈관 위험이 과소평가됩니다. 따라서 LDL 하위 분획을 정확하게 감지하는 것은 ASCVD 위험을 계층화하고 개입 전략을 최적화하는 데 중요합니다.

Friedewald 공식 및 직접 측정과 같은 전통적인 LDL-C 검출 방법은 총 콜레스테롤 수치만 반영하며 하위 분획을 구별할 수 없습니다. LDL-C 하위 분획을 검출하는 방법에는 초원심분리(UC), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 핵자기공명(NMR) 기술이 포함됩니다. 그러나 이러한 방법은 높은 기술 요구 사항, 복잡한 작업 또는 고가의 장비를 갖추고 있어 광범위한 임상 사용에는 실용적이지 않습니다.

폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 기술은 분자체 효과와 전하 차이를 통해 지단백질 입자를 분리합니다. 이 기술은 수단 블랙과 같은 특정 염색과 결합된 비변성 그래디언트 젤 시스템을 사용하여 고해상도, 강력한 재현성 및 작동 용이성을 제공합니다. PAGE 기술을 사용한 지단백질 타이핑은 환자의 지단백질 수치에 대한 보다 포괄적이고 정확한 평가를 제공하여 임상 치료 결정에 도움을 줄 수 있습니다. 이 기사에서는 다섯 가지 대표적인 결과를 제시했습니다. 샘플 A, B, C, D, E의 평균 LDL 입자 크기는 275.3 Å, 266.6 Å, 258.2 Å, 257.4 Å 및 252.9 Å이며, 이는 각각 이상지질혈증으로 인한 심혈관 질환의 낮음, 한계, 경증, 중등도 및 중증 위험을 나타냅니다.

서론

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2021년 세계보건기구(WHO) 보고서에 따르면 심혈관 질환(CVD)은 여전히 인간 질병 중 주요 사망 원인입니다. 보고서에 따르면 2019년 전 세계적으로 1,790만 명이 CVD로 사망했으며 이는 전 세계 사망자의 거의 1/3을 차지합니다1. CVD의 일종인 ASCVD는 중국 도시 및 농촌 거주자의 주요 사망 원인으로 전체 사망의 40% 이상을 차지합니다2. 죽상동맥경화증은 전통적인 위험 요인과 비전통적인 위험 요인 모두에 의해 유발되는 만성 염증성 혈관 질환입니다3. 동맥벽4의 지질 침착, 섬유 조직 증식 및 석회화를 특징으로 하며, 궁극적으로 혈관벽이 두꺼워지고 탄력이 감소하며 내강이 좁아집니다. 이상지질혈증은 ASCVD의 가장 중요한 위험 인자이며, LDL-C는 ASCVD의 병원성 위험 인자이며 ASCVD 발병에 중요한 역할을 합니다5. 수많은 역학 연구, 멘델 무작위 연구 및 무작위 대조 시험에서 혈장 LDL-C 수치가 ASCVD 위험과 양의 상관관계가 있음을 일관되게 보여주었습니다. LDL-C 수치를 낮추면 ASCVD6의 위험을 낮출 수 있습니다.

LDL은 체내에서 내인성 콜레스테롤을 운반하는 역할을 하는 주요 지단백질입니다7. 혈장 LDL은 크기, 밀도 및 화학 성분이 다른 다양한 입자로 구성된 이질적입니다8. LbLDL 입자는 밀도가 낮고 크기가 큰 반면, sdLDL 입자는 밀도가 높고 크기가 작습니다. LDL 이질성은 다양한 생물학적 효과의 기초가 됩니다9. LbLDL 입자는 직경이 더 크고(≥ 25.5nm), 밀도가 낮고(1.02g/mL에 가까움) 형태가 느슨하며 LDL1과 LDL2로 구성됩니다. LbLDL 입자에는 더 많은 양의 콜레스테롤 에스테르가 포함되어 있습니다. 산화되거나 혈관 내피에 침투할 가능성이 적어 상대적으로 안전합니다. 대조적으로, sdLDL 입자는 더 작은 직경(< 25.5 nm)10, 더 높은 밀도(1.06g/mL에 가까움) 및 LDL3에서 LDL7로 구성된 조밀한 구조를 갖습니다. SdLDL 입자는 lbLDL에 비해 콜레스테롤 에스테르의 양은 적지만 중성지방 및 아포지단백 B(ApoB) 수치는 높습니다. 이들의 물리적 특성으로 인해 동맥 내피 장벽을 관통할 가능성이 더 높습니다. 내피하에서 sdLDL 입자는 활성 산소종(ROS)에 의해 산화되어 산화된 LDL(ox-LDL)11을 형성합니다. Ox-LDL은 내피 산화질소 합성효소(eNOS) 활성을 억제하고 NO 생성을 감소시키며 내피 세포가 VCAM-1/MCP-1을 발현하도록 유도하여 단핵구 접착 및 이동을 촉진합니다12. 이동하는 내피 단핵 세포는 대식세포로 분화하여 청소부 수용체를 통해 제한 없이 ox-LDL을 흡수합니다. 세포내 콜레스테롤 에스테르의 축적은 죽상동맥경화성 지질 줄무늬의 핵심 구성 요소인 거품 세포로 변형됩니다. 거품 세포는 IL-1β 및 TNF-α와 같은 염증 인자를 분비하여 산화 스트레스 및 내피 손상을 더욱 확장하여 긍정적인 피드백 루프를 형성합니다13. 내피 세포 염증을 활성화하고 거품 세포 형성을 촉진하며 플라크 진행을 가속화할 수 있습니다. 두 개의 대규모 코호트 연구에서 sdLDL-C는 ASCVD14-15의 잠재적 위험을 예측하고 평가하는 데 LDL-C보다 더 큰 임상 참조 가치를 갖는 것으로 나타났습니다. 그러나 기존의 LDL-C 검출 방법은 방법의 한계로 인해 지단백질 하위 분획을 테스트할 수 없습니다.

LDL 입자(LDL-P)는 혈액 단위 부피당 LDL 입자의 수를 반영하며 각각 하나의 ApoB 분자와 여러 콜레스테롤 분자를 포함하는 LDL 분자의 운반체 역할을 합니다. LDL-C는 이러한 입자가 운반하는 콜레스테롤의 총 질량을 나타냅니다. LDL-C 수치는 LDL 입자 수와 콜레스테롤 밀도의 영향을 받으며, 이는 실제 위험을 완전히 반영하지 못할 수 있습니다16. 예를 들어, 대사 증후군, 당뇨병 또는 고중성지방혈증이 있는 환자는 LDL-C 수치는 정상이지만 LDL-P가 비정상적으로 상승할 수 있습니다(입자가 작고 콜레스테롤 함량이 낮기 때문에). LDL-C 수치가 목표를 충족하더라도 높은 LDL-P는 여전히 잔류 심혈관 위험을 증가시킬 수 있습니다. 연구에 따르면 LDL-P는 LDL17과 관련된 다른 매개변수보다 예측력이 더 높습니다. 지단백질 하위 분획의 분석은 ASCVD의 병인을 이해하고, 잔류 위험을 평가하고, 정밀 치료를 안내하는 데 중요합니다. 최근 몇 년 동안 국내 지침에서는 ASCVD 위험 평가 또는 치료 모니터링을 위한 지표로 LDL 하위 분획을 권장했습니다18.

ASCVD는 전 세계적으로 주요 사망 원인입니다. 그 예방 및 통제 전략은 지질 관리에 크게 의존합니다. 현재 임상 실습에서 이상지질혈증 환자의 선별검사는 주로 트리글리세리드(TG), 총 콜레스테롤(TC), 고밀도 지단백 콜레스테롤(HDL-C) 및 LDL-C를 포함한 전통적인 4가지 지질 검사에 의존합니다. 또한 지단백(a), 아포지단백 A1(ApoA1), ApoB와 같은 다른 지질 마커는 주로 당뇨병 환자, 고혈압 환자, 흡연자 또는 LDL-C 수치가 조절되었지만 여전히 위험이 높은 사람들과 같은 ASCVD19의 고위험군에 사용됩니다.

연구가 진행됨에 따라 전통적인 지질 검사의 한계, 특히 조기 경고 효과와 잔류 위험 설명에서 점점 더 분명해졌습니다. 상당수의 ASCVD 환자는 초기에 정상적인 지질 수치로 진단되어 LDL-C가 1차 경고에 효과가 없습니다. 역학 데이터에 따르면 급성 관상동맥 증후군 환자의 약 20%가 입원 시 LDL-C 수치가 정상 범위(<3.4mmol/L) 내에 있는 것으로 나타났으며, 이는 전통적인 지질 검사가 고위험군을 놓칠 수 있음을 시사합니다. 더욱이, LDL-C 목표를 달성한 후에도 ASCVD 환자는 여전히 높은 잔류 심혈관 위험에 직면할 수 있습니다. 이 환자들에서 대부분의 잔여 관상동맥 사건은 LDL-C 수치의 감소로 설명할 수 없습니다. 따라서 일상적인 지질 검사로는 lbLDL-C와 sdLDL-C를 구별할 수 없기 때문에 단순한 LDL-C 검사로는 ASCVD 진단 및 치료에 대한 임상적 요구를 완전히 충족하지 못할 수 있습니다.

여러 연구에서 지단백질 하위 분획과 ASCVD 사이의 명확한 상관관계가 확인되었습니다. 지단백 하위 분획 검사의 비정상적인 결과는 정상적인 지질 수치를 가진 개인의 ASCVD의 일차 예방에 대한 경고 역할을 할 수 있으며, 숨겨진 고위험군을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. LDL-C 수치가 이미 목표 범위 내에 있는 ASCVD의 2차 예방을 위해 지단백질 하위 분획 검사는 잔류 위험을 평가하고 추가 치료를 안내하는 데 도움이 될 수 있습니다20. 따라서 새로운 LDL 하위 분획의 검출은 기존 지질 검사에 비해 이상지질혈증 및 ASCVD의 예방 및 치료를 위한 새로운 표적을 제공할 것으로 기대됩니다.

우리 실험실의 검출 및 분석 시스템은 주로 PAGE를 사용하여 크기와 전하에 따라 지단백질 하위 분획을 분리합니다. 지단백질 입자는 PAGE에 의한 폴리아크릴아미드 매트릭스의 분자 체질로 인해 주로 크기에 따라 분리됩니다. 작은 분자는 빠르게 이동하는 반면 큰 분자는 입체 장애에 의해 방해를 받고 천천히 이동합니다. 그리고 분자가 더 많은 전하를 운반할수록 더 빨리 이동합니다. 이 방법은 지단백질을 12개의 하위 분획으로 빠르게 나눌 수 있습니다. LDL은 LDL1에서 LDL7로 표시된 7개의 하위 분획으로 나뉩니다. 그들은 모두 뚜렷한 크기, 밀도, 물리화학적 특성, 대사 행동 및 죽상동맥경화 가능성을 가지고 있습니다. LDL1과 LDL2는 lbLDL로 분류되는 반면, LDL3에서 LDL7은 sdLDL로 분류됩니다. 지단백질 하위 분획 검출 기술에는 UC, HPLC 및 NMR이 포함됩니다. 그러나 높은 장비 요구 사항, 복잡한 작동 및 시간 소모로 인해 임상 적용은 상대적으로 제한적입니다21. PAGE 방법은 LDL의 다양한 하위 분획을 효율적으로 분리하여 다른 기술에 비해 사용자 친화적입니다. 사용된 장비는 비용 효율적이고 휴대가 간편하여 일상적인 임상 실험실에서 널리 사용하기에 더 적합합니다. 이 연구는 임상 의사 결정을 지원하기 위해 혈청 샘플에서 LDL 하위 분획 분석을 위한 신속하고 비용 효율적인 방법으로 PAGE를 검증하는 것을 목표로 합니다.

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프로토콜

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본 연구의 모든 샘플은 광동성 인민병원 윤리심의위원회(승인번호: KY2025-435-01)의 평가 및 승인을 받았습니다. 모든 참가자는 실험 전에 서면 동의서에 서명했습니다.

1. 키트 준비

  1. 겔 완충액의 제조
    1. 30% 아크릴아미드(ACR)의 제조: 아크릴아미드 30g의 무게를 달고 탈이온수 80mL를 넣고 저어서 녹인 후 100mL로 조절합니다. 사용할 때까지 4°C에서 어두운 곳에 보관하십시오.
    2. 1% 비아크릴아미드(BIS)의 제조: 비사크릴아미드 1g의 무게를 달고 탈이온수 80mL를 넣고 저어주어 녹인 후 100mL로 조절합니다. 사용할 때까지 4°C에서 어두운 곳에 보관하십시오.
    3. 25% 자당의 제조: 자당 25g의 무게를 달고 탈이온수 70mL를 넣고 저어주어 녹인 다음 100mL로 조절하여 4°C에서 보관합니다.
    4. 10% 과황산암모늄(APS)의 제조: 과황산암모늄 0.1g을 탈이온수 1mL에 녹여 즉시 사용하십시오.
    5. 1M 트리스(pH=6.8)의 제조: 트리스하이드록시메틸아미노메탄 121.14g의 무게를 달고 탈이온수 800mL를 넣고 저어주어 녹인 후 pH 값을 6.8로 조절한 후 최대 1000mL까지 만든다.
    6. 1M 트리스(pH=8.6)의 제조: 트리스하이드록시메틸아미노메탄 121.14g의 무게를 달고 탈이온수 800mL를 넣고 저어주어 녹인 후 pH 값을 8.6으로 조절한 후 최대 1000mL까지 만든다.
      알림: 아크릴아마이드를 취급할 때는 부틸 고무 장갑, 보안경, 보호복을 착용하고 연기 후드에서 작업하십시오. 피부에 닿은 경우 즉시 비누와 물로 씻은 후 의사의 진료를 받으십시오. 흡입의 경우 신선한 공기로 이동하십시오.
  2. 분리겔의 제조
    1. 깨끗한 유리관을 가져다가 밀봉 필름으로 하층을 밀봉합니다.
    2. 30% ACR 8.29mL, 1% BIS 17.76mL, 25% 자당 10mL, 10% APS 1mL, 1M Tris(pH = 8.6) 10mL, 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED) 0.1mL, 탈이온수 32.85mL를 깨끗한 비커에 순차적으로 첨가합니다. 잘 섞어 모액 80mL(폴리아크릴아미드 농도 3.3%)를 얻고 뿌리당 1.2mL로 유리관에 첨가합니다. 실온에서 60분 동안 중합하고 액체를 정제수로 밀봉하여 평평한 액체 표면을 보장합니다.
  3. 농축 접착제의 준비
    1. 30% ACR 4.07 mL, 1% BIS 3.05 mL, 25% 자당 5 mL, 10% APS 0.5 mL, 1M Tris(pH = 6.8) 5 mL, TEMED 0.05 mL 및 탈이온수 32.33 mL를 깨끗한 비커에 순차적으로 첨가하고, 잘 혼합하여 모액 50 mL(폴리아크릴아미드 농도 3.05%)를 얻고, 뿌리당 0.2mL로 유리관에 첨가합니다. 실온에서 60분 동안 중합하고 액체를 정제수로 밀봉하여 평평한 액체 표면을 보장합니다.
  4. 보존액의 준비
    1. 트리스 6.4g, 자당 75g, 글리세린 2.5mL, PC-300(항균 방부제) 0.3mL를 계량하고 탈이온수 800mL를 넣고 저어주어 녹인 후 PH값을 6.8로 조절한 후 마지막으로 1000mL로 희석한다. Tris-HCl의 농도는 약 52mM입니다.
  5. 수단 블랙 염색 용액의 준비
    1. 수단 블랙 0.03g의 무게를 달고 에틸렌 글리콜 2mL, 무수 에탄올 6mL, 디메틸 설폭사이드 2mL의 혼합물에 녹입니다. 여과 후 바이알당 1mL로 나눕니다.
      알림: 수단 블랙 및 디메틸 설폭사이드를 다룰 때는 직접적인 접촉을 방지하기 위해 니트릴 장갑과 보호 고글을 착용하십시오. 작업은 환기가 잘 되는 환경에서 수행되어야 합니다. 노출 후 즉시 피부와 눈을 물로 헹구고 필요한 경우 의사의 진료를 받으십시오.
  6. 내부 포장
    1. 키트 구성 요구 사항에 따라 포장을 완료합니다.

2. 키트 구성

  1. 제품에 조립식 기둥, 방부제 용액 및 수단 블랙 염색 용액이 포함되어 있는지 확인하십시오. 조립식 기둥에는 아크릴아미드, 비사크릴아미드, 자당, 과황산암모늄, 트리스 및 테트라메틸에틸렌디아민이 포함되어야 합니다. 조립식 기둥의 길이는 75 ± 0.5mm, 내경은 5.5 ± 0.02mm, 외경은 7.0 ± 0.02mm입니다. 방부제 용액에는 트리스, 자당, 글리세린 및 방부제가 포함되어야 합니다. 수단 블랙 염색 용액에는 수단 블랙, 에틸렌 글리콜, 무수 에탄올 및 디메틸 설폭사이드가 포함되어야 합니다. 포장 사양이 조립식 기둥의 수량에 따라 다른지 확인하십시오. 시약 1인분에는 조립식 컬럼이 하나 있어야 합니다. 서로 다른 배치의 시약 키트를 결합하면 실험 결과에 영향을 미칠 수 있으므로 결합하지 마십시오.

3. 샘플 준비

  1. 환자 준비: 혈액 샘플을 채취하는 동안 환자가 공복에 있는지 확인하십시오.
  2. 혈청 분리 젤 샘플링 튜브를 사용하고 표준 운영 절차에 따라 샘플 수집을 수행합니다. 용혈을 피하기 위해 채혈 후 가능한 한 빨리 혈액을 분리해야 합니다.
  3. 실온에서 가능한 한 빨리 분리 후 혈청 샘플을 테스트하십시오. 즉각적인 테스트가 불가능한 경우 샘플을 2-8°C에서 최대 7일 동안 또는 -20°C에서 최대 30일 동안 보관하십시오.
  4. 샘플을 실온으로 복원하고 사용하기 전에 완전히 혼합하십시오, 특히 냉동 및 해동된 샘플의 경우 반복적인 동결-해동은 시료 무결성을 손상시킬 수 있으므로 허용되지 않습니다. 지방혈증과 용혈 샘플 모두 검사 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 경미한 지방혈증이나 용혈 시료인 경우 실온에서 14,462 x g 에서 15분 동안 고속 원심분리를 수행하는 것이 좋습니다. 지방혈증 샘플의 경우 피펫을 사용하여 바닥에서 전체 투명층을 흡인합니다. 용혈 샘플의 경우 상청액을 수집합니다. 그런 다음 새 원심분리기 튜브로 옮기고 염색합니다. 그러나 지방혈증이나 용혈이 매우 심한 경우 다시 채혈하는 것이 좋습니다.

4. 작업 단계

  1. 준비
    1. 테스트할 조립식 기둥과 샘플을 꺼냅니다. 피펫을 사용하여 조립식 컬럼의 샘플 포트에서 잔류 보존액을 흡인합니다. 조립식 컬럼과 샘플을 실온으로 균형을 맞추고 14.3g의 전기영동 완충 분말을 800mL의 탈이온수와 용해시킵니다.
  2. 염료
    1. 깨끗한 원심분리기 튜브를 가져다가 번호를 매깁니다. 튜브의 수는 채혈 튜브의 순서와 일치합니다. 50μL 샘플과 10μL 수단 흑색 염색 용액의 비율로 원심분리 튜브를 넣고 잘 섞은 다음 실온에서 30분 동안 그대로 두어 염색합니다.
      참고: 수단 블랙의 염색 원리는 친유성 특성을 기반으로 합니다. 세포 내에서 중성 지방, 인지질, 스테로이드와 같은 지질 물질과 특정 발색 반응을 유도하여 갈색을 띤 검정색 또는 짙은 검은색 입자를 생성할 수 있습니다. 이 시스템에서는 다음 프로토콜과 함께 단일 요인 실험 설계를 사용하여 염색 시간과 용량을 최적화했습니다. 3개의 LDL-C 혈청 샘플(고농도, 중농도, 저농도)을 선택하며, 해당 염색량은 각각 5μl, 10μl, 15μl 및 20μl입니다. 염색 시간은 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 35분, 45분 및 60분으로 설정됩니다. 전기영동 실험을 실시한 후 전기영동 밴드의 그레이스케일 분석을 실시하여 염색 효과를 검증합니다. 최적의 조건은 30분 ± 5분의 염색 기간으로 10μl 염색 부피로 결정됩니다. 염색량과 지속 시간이 낮을수록 지단백 콜레스테롤이 희미하게 염색됩니다. 최적의 조건이 균형을 이루었지만 더 높은 염색량과 지속 시간은 필요하지 않습니다.
  3. 이온포리 분리
    1. 전기 영동 탱크의 고무 소켓에 미리 균형 잡힌 컬럼을 삽입합니다. 겔 컬럼의 샘플 포트는 고무 마개에서 약 2cm 떨어져 있습니다. 단단히 닫혀 있고 누출이 발생하지 않는지 확인하십시오. 샘플 젤 컬럼의 수가 가득 차지 않으면 구멍이 없는 고무 플러그로 빈 공간을 채웁니다.
    2. 그런 다음 전기 영동 완충액을 상부 및 하부 탱크에 붓습니다. 조립식 기둥의 입구에 있는 기포를 제거하십시오. 25μL의 염색된 샘플을 조립식 컬럼의 샘플 포트에 추가합니다.
    3. 뚜껑을 덮고 전원 스위치를 연결한 후 전기영동 분리를 위한 전압(U=100V), 전류(I=3mA/튜브), 전력(P=120W), 시간(T=70분)의 매개변수를 설정합니다.
      알림: 전압, 전력 및 시간은 고정된 매개변수입니다. 전류는 테스트 샘플의 수에 따라 설정해야 합니다(예: 샘플 튜브 10개, I = 3mA x 튜브 10개 = 30mA).
    4. 전기영동이 완료되면 전원을 끄고 뚜껑을 열고 전기영동 장치 상부에 전기영동 완충액을 붓습니다. 겔 컬럼을 차례로 꺼내 고정 프레임에 놓고 윗면에 여분의 전기영동 완충액을 붓고 스캐닝 분석 시스템에서 분석합니다.
  4. 스캐닝 분석
    참고: 분석기 유형은 DY-03이고 스캔 소프트웨어는 KBL 3.3.9 GD입니다.
    1. 스캐닝 분석기의 전원 스위치를 켜고 데스크탑 시스템 소프트웨어를 두 번 클릭한 다음 컬렉션을 클릭하여 소프트웨어 인터페이스로 들어갑니다. 소프트웨어 인터페이스에서 Export Sample Tray 를 클릭하고 샘플링 끝이 장치 내부를 향하도록 샘플 선거 선에 젤 컬럼을 놓습니다. 젤 컬럼이 해당 번호가 매겨진 위치에 배치되었는지 확인합니다. 위치 25 및 26은 품질 관리 테스트 전용으로 지정됩니다.
    2. 소프트웨어 인터페이스에서 샘플 트레이 가져오기 를 클릭하여 샘플 트레이를 장치로 가져옵니다. 스캔을 클릭하여 샘플 스캔 이미지를 가져옵니다. 이 장치에는 자동 초점 시스템이 내장되어 있습니다. 스캐닝 모듈과 젤 튜브 사이의 초점을 자동으로 조정하여 선명한 이미징을 보장합니다. 소프트웨어는 전기 포로그램의 초기 위치(VLDL)와 종료 위치(HDL)를 자동으로 식별합니다. 이러한 위치에서 명백한 피크가 감지되면 소프트웨어는 스펙트럼 분석을 위해 지정된 분석 영역을 잠급니다.
    3. 환자 정보를 입력하고 바코드를 스캔한 후 소프트웨어 인터페이스에서 분석 및 처리 를 클릭하면 시스템이 자동으로 테스트 보고서를 분석하고 생성합니다. LIS 업로드를 클릭하여 테스트 보고서를 LIS 시스템으로 전송합니다.
    4. 스캔 및 분석 후 조립식 기둥을 꺼내 의료 폐기물 사양에 따라 처리합니다.

5. 품질 관리

  1. 매일 샘플 테스트 전에 두 단계의 품질 관리 테스트를 수행합니다. 품질 관리 테스트의 작업 단계는 샘플 테스트의 작업 단계와 동일합니다. 유형 A 기준은 268 Å보다 큰 평균 입자 직경입니다. 유형 B 기준은 265 Å 미만의 평균 입자 직경입니다.
    참고: 결과 분석: 유형 A, 평균 LDL 입자 크기는 > 268 Å, LDL1 및 LDL2가 더 많이 차지하여 CVD 위험이 낮음을 나타냅니다. TYPE INTERMEDIATE(TYPE INT)의 경우 평균 LDL-입자 크기는 265 내지 268 Å이며, 이는 LDL3 대 LDL7의 비율이 임계값 이상임을 나타냅니다. 유형 B, 평균 LDL 입자 크기는 < 265 Å이고 LDL3에서 LDL7이 더 많아 CVD 위험이 높음을 나타냅니다.

6. 기술적 개선

  1. 정확한 진단 결과를 보장하려면 다음과 같은 기술적 개선을 구현해야 합니다.
    1. 사전 검사: 채혈 전에 환자가 완전히 금식하고 있는지 확인하십시오. 헤파린 항응고제 혈장 대신 혈청 또는 EDTA 항응고제 혈장을 사용하십시오. 피펫의 흡수가 정확한지 확인하십시오. 심한 유미질 또는 용혈성 샘플을 피하십시오.
    2. 검사 중: 표준 프로토콜에 따라 전압(U = 100V), 전류(I = 3mA/튜브), 전력(P = 120W), 시간(T = 70분)의 전기영동 매개변수를 설정합니다. 사진 촬영 및 스캔 기능에 영향을 줄 수 있는 유리관의 오염을 방지하기 위해 멸균 장갑을 착용하십시오.
    3. 검사 후: 보고서를 발행할 때 잠재적인 간섭이 있는지 비정상적인 크로마토그램을 검토하고 잘못된 진단 결론을 제공하지 않도록 재분석을 수행합니다.
      1. 정상 크로마토그램: VLDL의 초기 위치와 HDL의 종료 위치에서 둘 다 뚜렷한 피크를 갖습니다(대표 결과 섹션 참조).
      2. 이상 크로마토그램: VLDL의 초기 위치 또는 HDL의 종단 위치에는 피크가 없거나 둘 이상입니다.

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결과

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이 연구는 PAGE를 사용하여 참가자의 혈청에서 지단백질 하위 분획을 검출하는 방법을 발명하는 것을 목표로 합니다. 목표는 LDL-C 하위 분획이 주로 큰 입자(LDL1 및 LDL2) 또는 작은 입자(LDL3 내지 LDL7)인지 확인하는 것입니다. 수단 흑색으로 염색한 후 샘플은 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동 장치에 의해 분리됩니다. 그런 다음 지단백질은 겔 튜브 내에서 별개의 밴드로 분리되고 스캐닝 분석 시스템을 사용하여 하위 분획 분석이 수행됩니다.

분석 장치는 전기 영동 스캐닝 그레이스케일 이미지에서 피크 모양 및 피크 면적을 계산합니다. 피크 이동 거리와 가중 피크 면적을 사용하여 각 샘플의 평균 LDL 입자 크기를 추정합니다. 우리 시스템은 각 지단백질 하위 분획의 상대적 백분율을 제공합니다. 실험실은 총 콜레스테롤 농도를 수동으로 입력하여 지단백질 하위 분획의 절대 함량을 얻을 수 있습니다. 우리 시스템에서 LDL 하위 분획은 머무름 계수(Rf)로 표시되는 이동 거리...

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토론

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죽상동맥경화증 발병에서 심혈관 위험 인자로서 sdLDL의 역할이 연구를 통해 확인되었지만 현재 LDL 하위 분획을 식별하는 확립된 방법은 없습니다. 지난 수십 년 동안 LDL 하위 분획에 대한 검출 방법 개발에 상당한 진전이 있었습니다. UC는 황금 표준으로 간주됩니다. 밀도 차이에 따라 LDL 하위 분획을 분리하여 고해상도로 sdLDL과 lbLDL을 구별할 수 있습니다. 그러나 이 방법은 값비싼 초원심분리기와 긴 원심분리 시간이 필요하므로 불안정한 입자 성분이 손상될 수 있습니다. LDL-P를 정량화할 수 없을 뿐만 아니라 UC의 정확도는 작업자의 기술에 따라 실험실마다 다릅니다22. HPLC는 지단백질 분리 후 HPLC 장치를 사용하여 LDL 하위 분획을 식별하고 검출할 수 있습니다23. HPLC 기술은 재현성이 뛰어나고 정확하며, 이는 대용량 샘플 볼륨을 분석하는 데 이상적인 선...

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 연구는 광동성 의학 과학 기술 연구 기금 프로젝트(A2024108)의 보조금으로 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
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전기영동 완충액 분말광시 캉볼라이 기술 회사25030401완충액 준비 및 전기영동 조건 제공
고부가가치 품질 관리 제품광시 캉볼라이 기술 회사25030301모니터링 정확도 및 정밀도
지단백질 시료 밀도 분리 용액(그래디언트 겔 전기영동)광시 캉볼라이 기술 회사LSS60-SB1-A1  25030301혈청 샘플에서 지단백질 아형 성분 분리용
저부가가치 품질 관리 제품광시 캉볼라이 기술 회사25030301모니터링 정확도 및 정밀도
수단 블랙 염색 용액광시 캉볼라이 기술 회사LSS60-SB1-A1  25030301샘플 염색용

참고문헌

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