선택적 REM 수면 박탈 방법 - REM 잊기 위한 선택적 코 튕기(SNiFFer)

Summary

우리는 설치류에서 빠른 안구운동(REM) 수면을 선택적으로 차단하기 위한 새로운 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

수면은 빠르게 안구 운동(REM)과 비REM 단계로 크게 분류되며, 이러한 기능을 연구하기 위해 다양한 수면 박탈 기법이 개발되었습니다. 기계적 자극이나 REM 수면 중 동물을 떨어뜨리는 것과 같은 전통적인 방법은 빠른 습관화와 의도치 않은 스트레스 효과를 초래하여 해석을 어렵게 만듭니다. 여기서는 설치류의 REM 수면 박탈을 위한 새롭고 온화하며 부드러운 방법을 소개합니다: SNiFFer. 설치류는 코 자극에 매우 민감한 것으로 알려져 있습니다. 이 방법에서는 부드러운 붓으로 REM 수면 중 동물의 코를 부드럽게 쓰다듬어 안정적으로 흥분을 유발합니다. REM 수면 중 이 기법을 선택적으로 적용하기 위해, 우리는 AI 기반 실시간 뇌파검사(EEG) 수면 단계 분류 시스템을 활용했습니다. 중재는 REM 에피소드 중에만 트리거되었으며, 수면 상태와 관계없이 동일한 자극 패턴을 받는 요크드 대조군이 포함되었습니다. 우리는 또한 SNiFFer를 흔적 두려움 조건화 패러다임에 적용하여 학습 후 6시간 이내의 REM 수면 박탈이 기억 공고화에 방해가 되는지 검증하였습니다. 노크드 대조군과 비교했을 때, SNiFFer 처리된 동물들은 총 REM 에피소드와 REM 에피소드 지속 시간이 유의미하게 감소하여 이 방법의 특이성과 효능을 시사하였습니다. 결론적으로, SNiFFer 기법은 쥐에서 REM 수면 박탈을 위한 매우 선택적이고 최소 침습적인 촉각 접근법을 제공합니다. 이 방법은 실험 조건을 정밀하게 제어할 수 있게 하며, 기억과 인지에서 REM 수면의 역할을 조사할 새로운 가능성을 열어줍니다—간지러운 반전을 더해서요.

Introduction

급속 안구 운동(REM) 수면은 기억 공고화와 같은 인지 과정에서 중요한 역할을 합니다 ^1,2. 뇌에서 REM 수면의 기능적 중요성을 조사하기 위해 REM 수면 박탈은 일반적으로 실험적 접근법으로 사용됩니다. 현재 설치류에서 REM 수면 박탈을 유도하는 데 널리 사용되는 네 가지 주요 방법이 있습니다: 회전 디스크 방법¹, 화분 방법³, 공기 부풀림 방법⁴, 그리고 물리적 자극 기법 ^5,6. 회전 원반과 화분 방법은 REM 수면을 제거하는 데 매우 효과적이지만, 종종 물 노출이나 신체적 피로와 같은 상당한 스트레스를 동물에게 초^{래하여 행동} 및 생리적 결과 해석을 혼란스럽게 할 수 있습니다. 마찬가지로, 에어 퍼프와 기존의 물리적 자극 방법은 신체에 넓고 비특이적인 자극을 전달하여 자극 강도에 변동성이 있고 대조군 선택이 제한적이다 ^4,8.

우리는 60년이 넘는 REM 수면 박탈 연구를 포괄적으로 비교했으며, 이는 보충 파일 1 과 보충 표 1에 제공되어 있습니다. 우리는 Jouvet, Rechtschaffen, Bergmann, Tufik, Andersen, Borbély 등 주요 연구 분야에서 기초적인 역사적, 기전적, 신경화학적, 호르몬학, 행동 연구를 통합했습니다. 보충 표 1은 주요 논문을 연대순으로 정리하고 있습니다. REM 수면 박탈 기법의 방법론적 진화를 추적하며, 주요 생물학적, 신경화학적, 호르몬적, 면역, 체온 조절 및 행동적 발견을 요약합니다. 본 원고는 포괄적인 역사 검토가 아닌 방법론 논문으로 구성되어 있으므로, 이 내용은 보조 정보로 추가되었습니다.

이러한 한계를 해결하기 위해 우리는 REM 수면 박탈에 대해 높은 선택성을 제공하는 새로운 방법을 개발했습니다. 이 기술은 설치류에게 REM 수면을 정밀하게 통제하여 선택적으로 차단하도록 설계되었습니다. 이 접근법에서는 자극을 설치류에서 가장 민감한 코 중 하나인 동물의 코로 제한^합니다. 또한, 우리는 AI의 실시간 수면 단계 분류 시스템을 사용하여 시간적 특이성을 가진 REM 수면 에피소드를 감지하고 중단^합니다. 이 AI 시스템은 단일 채널에서 최근 4초 동안 EEG 신호를 참조하여 현재 마우스의 수면 단계를 평가합니다. 이 구조는 또한 요크드 컨트롤 그룹의 구현을 가능하게 하여 시간적으로 매칭된 개입을 가능하게 합니다. 물리적 자극 기반 REM 수면 박탈 기법으로 분류되지만, 저희 프로토콜은 기존 방법과는 다릅니다. 첫째, AI를 이용한 실시간 수면 단계 분석을 적용하여 정확하고 일관된 REM 특이적 개입을 수행하였습니다. 둘째, 자극 영역을 마우스⁶에서 가장 민감한 코 윗부분으로 제한하여 자극 지속 시간과 강도에 변화가 최소화됩니다. 마지막으로, 교란 요인에 대해 통제군과 동일한 자극량을 받은 대조군을 새로 설정했습니다. 이 프로토콜은 REM 수면에 특화된 기능을 조사하는 방법을 제안합니다.

이 방법의 유용성을 평가하기 위해, 우리는 흔적적 공포 기억 통합에서 REM 수면의 역할을 조사하는 데 적용했습니다. 이전 연구들은 REM 수면 박탈이 해마 의존적 두려움 기억 공화, 특히 지연된 두려움 기억을 저해한다고 보고했습니다^11,12. 그러나 REM 수면 박탈이 분산되고 복잡한 뇌 회로를 관여하는 기억 과정에 미치는 영향에 대해서는 상반된 증거가 존재한다 ^5,13. 흔적의 공포 기억 공고화는 발충격(무조건 자극), 청각 신호(조건 자극), 그리고 그 사이의 흔적 간격을 연관시키는 것을 필요로 하며, 이 과정은 해마, 내측 전전두엽 피질, 편도체¹⁴ 등 여러 뇌 영역을 동원하는 것으로 알려져 있다. 따라서 우리는 쥐들에게 기억 공포 조건화¹⁵ 직후 6시간 동안 REM 수면을 박탈했는데, 이 시간 창은 기억 통합에 중요한 것으로 알려져^{있습니다.} 이 프로토콜을 사용하여 우리는 REM 수면 박탈이 분산 신경 시스템의 조정된 활동에 의존하는 기억 흔적의 통합에 미치는 영향을 평가했습니다. 이 글에서는 그 효과를 시험하는 상세한 실험 프로토콜을 설명하는 새로운 방법을 제시합니다.

Protocol

모든 동물 실험은 츠쿠바 대학교 기관 동물 관리 및 이용 위원회의 승인을 받았습니다. 이 연구에는 수컷과 암컷 C57BL/6J 마우스(11–13주, 20–35g)가 사용되었습니다. 이 연구에 사용된 재료와 기기의 전체 목록은 재료표에 제공되어 있습니다.

1. EEG 전극의 외과적 이식¹⁷

1. 마취 및 동물 준비
   1. 3분 동안 4% 이소플루란을 공기와 섞어 마취를 유도하세요. 발 철수 반사와 근육 긴장도의 부재, 그리고 안정적인 호흡 패턴으로 적절한 마취가 확인되었습니다.
   2. 전기 면도기를 사용해 목덜미에서 눈 사이까지 등 머리와 목 부위를 면도하세요. 쥐가 수염이 움직이는 등 각성을 나타내면 다시 마취를 유도하세요.
2. 머리 고정과 두개골 노출
   1. 동물을 입체흡입 프레임에 고정하여 코와 두개골의 정렬을 보장합니다. 이 시점부터 전체 수술 종료 시점까지 마취는 이소플루란 증기 펌프 시스템을 통해 지속적으로 유지되었습니다.
   2. 각막 건조를 막기 위해 양쪽 눈에 안과 연고를 바르세요. 남은 머리카락은 제모 크림으로 제거하세요.
   3. 두피 중앙선에 절개를 하고 피부를 부드럽게 젖혀 뒤쪽 귀선에서 앞눈 눈 쪽까지 두개골을 노출시키세요. 점막 조직을 면봉으로 제거하세요.
3. 랜드마크 식별 및 평탄화
   1. 브레그마와 람다를 식별한다; 입체 유도 암을 조정하여 이 점들이 ±0.05 mm 이내로 수평이 되도록 합니다. 브레그마에서 3.0 mm 떨어진 측면 좌표± 또한 평평한(±0.05 mm) 있는지 확인하세요.
4. 드릴링과 나사 설치
   1. 브레그마에 대해 다음 좌표를 표시하세요. 이 좌표로 파일럿 홀 네 개를 뚫으세요. 앞뒤 / 내측–외측: +1.5 mm / ±1.5 mm, –3.0 mm / ±1.7 mm.
   2. 각 구멍에 EEG 기록용 나사를 삽입하고 시아노아크릴레이트 기반 젤 접착제로 고정하세요. 노출된 두개골과 머리를 얇은 치과 시멘트로 감싼 뒤 덮으세요.
5. 수술 후 관리
   1. 5% 포도당 용액 0.5mL와 이부프로펜(또는 동등한 진통제) 0.13 mL를 투여합니다.
   2. 쥐를 본래의 우리로 돌려놓으세요. 이 우리에는 원통형 플렉시글라스 우리(직경 21.9cm, 높이 31.6cm)가 단열된 챔버(45.7 x 50.8 x 85.4 cm)에 배치되어 있습니다. 챔버는 23.5 ± 2.0 °C의 온도, 상대 습도는 50.0% ± 10.0%, 12시간의 빛과 어둠 주기(빛 주기: 오전 9시부터 오후 9시까지)로 유지됩니다.
   3. 동물을 따뜻한 회복 케이지에 넣으세요. 쥐가 깨어날 때까지 우리 앞에서 기다리세요. 수술 후에는 동물들을 개별 사육지에 보관하고 실험 기간 동안 집단 사육지로 돌려보내지 않았습니다.

2. 취급과 습관

1. 실험 일정
   1. 수술 후 24–48시간 동안 가벼운 단계에 다루기 시작하세요. 4일 연속으로 계속 진행하세요.
2. 수술 절차
   1. 첫날에는 마우스를 2분간 손에 두면 2번 플레이하세요. 실험자의 열린 손바닥 위에 마우스를 올려놓고 손가락을 뻗고 손바닥이 위를 향하게 합니다. 쥐는 자연스럽게 높은 곳으로 올라가는 경향이 있으니, 손바닥을 팔뚝보다 약간 높게 위치시키세요. 쥐가 제약 없이 자유롭게 움직일 수 있게 하세요; 쥐가 팔뚝 위로 올라가려 하면, 꼬리 밑부분을 살짝 잡아 부드럽게 팔뚝을 손바닥으로 돌려주세요. 각 인터벌은 20분 이상입니다. 이 작업은 빛 위상 중에 수행되어야 합니다.
      참고: 쥐가 손에서 뛰어내리거나 물었을 때는 첫날에만 천이나 휴지로 손을 덮으세요. 옷은 재사용할 수 있으며 2주마다 세탁해야 합니다.
   2. 2일째부터 4일째까지는 쥐를 2분간 손에 두어 3회 연습하세요. 각 인터벌과 진행된 기간은 1일차와 동일합니다. 행동적으로 습관화 평가: 비익숙한 쥐는 보통 점프하거나 강하게 물어 도망치려 하지만, 익숙해진 쥐는 적극적으로 손바닥을 탐색하며 도망치려는 시도는 거의 없고 강하게 물지 않습니다.
   3. 최종 처리 세션이 끝나면 마우스를 EEG 기록 케이블에 연결하세요.
      참고: 베딩이 너무 많아 쥐 코가 잘 들어가지 않을 경우, 직접 일부를 따서 다루는 중이나 연결 시 제거하세요.

3. 기저 EEG 기록

1. 수술 후 5일차와 6일차부터 시작하세요. 매일 11시부터 17시까지 연속 뇌파 검사를 기록하세요. 침구가 쥐의 코 접근을 방해한다면, 과도한 침구를 점차 제거하여 코 접근이 깨끗하도록 하면서 동물의 추가 과정에 대한 방해를 최소화합니다.

4. 공포 조건화^18,19

1. 수술 후 7일차(또는 8일차)부터 10시부터 11시 사이에 시작하세요. 준비 과정으로, 투명한 아크릴 벽과 스테인리스 스틸 그리드 플로어(직경 2.0mm 막대가 6.0mm 간격으로 배치됨)로 구성된 조성 챔버(30 x 25 x 24 cm)에 70% 에탄올을 분사합니다.
2. 훈련 프로토콜 (총 세션 1,100초)
   1. 180초, 400초, 620초, 840초, 1060초에 5개의 청각 신호(20초 상승음, 5–20kHz 1.25Hz, 0.8초 지속)를 전달합니다. 각 사운드 큐는 218초, 438초, 658초, 878초, 1098초에서 전달되는 풋쇼크(1.0 mA, 2초)와 함께 사용하세요.

5. REM 수면 부족

1. REM 수면 박탈 그룹(RSD 그룹)
   1. 공포 조건화(ZT2-ZT8) 직후, AI 기반 수면 단계 분류 시스템을 활성화하여 REM 수면을 실시간으로 감지할 수 있도록 EEG를 모니터링합니다. REM 수면이 감지되면 부드러운 붓으로 동물의 코를 부드럽게 간지럽혀 다시 깨우게 하며, 자극 시작부터 각성까지의 평균 지연 시간은 0.89 ± 0.063초(평균 ± SEM)입니다.
   2. 실험 중 각성은 촉각 자극, 특히 자극 후 수염 움직임에 대한 행동 반응으로 정의되었습니다. 각 간지럼의 타임스탬프를 기록해 나중에 분석하세요.
      참고: 간지럼 동작은 고정된 방향 패턴(예: 앞뒤, 위, 원형) 없이 수행되었으며, 코 윗부분에 한정된 가벼운 촉각 자극을 유지했습니다. 코가 막혀 있다면, 보통 노출된 진동(수염) 부위를 향해 자극을 가하세요. 마우스가 붓에서 등을 돌리고 있다면, 코 부위에 방해받지 않도록 케이지를 회전시키세요. 뚜껑이 열린 케이지를 사용할 때는 위에서 자극을 가해 코나 진동 접근이 일관되도록 할 수도 있습니다.
2. 요키드 대조군 (요키드 그룹)
   1. 각 쥐를 REM 결핍 상태의 마우스와 짝지어 주세요. 게이크된 쥐에게 파트너의 REM 에피소드와 동기화하여 코 간지럼을 적용하며, 시작 시간과 지속 시간을 맞추세요. 각 마우스는 REM 수면 박탈 실험 내내 같은 전용 붓을 사용합니다. 사용 후에는 약한 산성 물로 브러시를 뿌리고 휴지로 닦아주세요. 세척된 붓이 완전히 마르도록 최소 24시간 간격을 두세요.

6. 기억력 회상 검사

1. 맥락 회상 검사 (검사 A)
   1. 수면 부족 후 24시간(±3시간)부터 시작하세요. 쥐를 원래 컨디셔닝 챔버(에탄올 향 70% 있음)로 돌려보내세요. 5분간 얼어붙는 행동을 기록하세요.
2. 소리 신호 회상 테스트 (테스트 B)
   1. 시험 A에서 3시간 후에 세션을 진행하세요.
   2. 맥락 준비: 맥락 B(삼각기둥(높이 30cm)로 구성되어 있으며, 변 길이는 31cm, 24cm, 24cm입니다. 두 벽은 흰 종이로 덮여 있고, 세 번째 벽은 투명한 아크릴로 되어 배경에 파란색 직사각형이 보입니다. 이 구조물은 플라스틱 바닥과 투명한 아크릴 천장을 가지고 있습니다.
   3. 6분 동안 얼어붙는 행동을 기록하세요. 180초 훈련과 동일한 180초 청각 신호를 전달하세요.

7. 데이터 분석

1. 수면 단계 점수 (그림 1C-G)¹⁷
   1. 각 각성/NREM/REM마다 인간 전문가 점수 데이터를 바탕으로 총 수면량, 에피소드 수, 평균 지속 시간, 수면 전환 수를 계산하세요. 각 단계의 기준은 다음과 같습니다.
      웨이크: 저진폭, 고주파 (β/γ)
      NREM: 고진폭, 저주파 (δ)
      REM: 저진폭, 쎄타 우세
2. 박탈 품질 (그림 1B)
   1. 각 간지럼 자극이 적용되는 수면 단계를 평가하기 위해 인간 전문가가 주석을 단 EEG 데이터와 타임스탬프를 비교하세요.
3. 동결 동작 (그림 1H, J-K)
   1. FreezeFrame4(Actimetrics)를 사용해 공포 조건화 및 회상 테스트 중 호흡 제외의 움직임 제한을 정량화하세요.
      1. FreezeFrame 4 소프트웨어를 실행하고 Recorder 모드를 선택하세요. 파일 메뉴(왼쪽 상단)에서 녹음 파일을 저장할 목적지 폴더를 지정하세요. 왼쪽 패널의 네 개의 흰색 입력 필드에 각 마우스에 대응하는 고유 식별자를 입력하여 화면 오른쪽의 네 개 파일 표시 창과 정렬되도록 합니다.
      2. 인터페이스 하단의 프로토콜 패널을 클릭하여 총 녹음 시간과 실험 설계에 따른 청각 신호 및 발 충격 타이밍을 포함한 녹음 매개변수를 정의하세요.
      3. 화면 중앙의 참조 를 클릭하면 배경 참조 이미지를 얻을 수 있습니다. 마우스를 컨디셔닝 챔버에 넣고, 녹화를 시작하려면 '시작 '을 클릭하세요.
4. 식별 지수 분석 (그림 1L)
   1. 다음 공식으로 판별지수를 계산합니다:
      테스트 A에서 평균 5분 만에 얼어붙음 - 테스트 B에서 처음 3분 평균 얼음 / 테스트 A에서 평균 5분 이내에 최대 얼어붙음, 테스트 B에서 첫 3분 평균 얼음.
5. 충격 반응성 지수 분석 (그림 1I)
   1. 공포 조건화 세션에서 쇼크 시작 전후의 동물 2의 2차원 움직임을 측정하기 위해 트랙 바이 핸드를 사용하세요. 다음 공식으로 충격 반응성 지수를 계산합니다:
      충격 중 움직임 - 움직임 프리쇼크 / 쇼크 중 움직임 + 움직임 프리쇼크

Results

EEG 전극의 외과적 이식
쥐는 수술 중에는 완전히 마취되어야 합니다. 마취 실패의 징후, 예를 들어 몸부림치는 경우에는 프로토콜에서 제외되어야 합니다. 마찬가지로, 출혈이 10초 이상 지속되면 쥐의 뇌에 심각한 손상을 줄 수 있으므로 실험 중단이 권장됩니다. 수술 후 대부분의 쥐는 보통 1시간 이내에 깨어납니다. 그들의 걸음걸이와 눈 움직임은 수술 전 상태와 비슷하게 정상으로 돌아올 것입니다.

핸들링과 습관
쥐가 간질이나 다루는 과정에서 통증 징후를 보인다면 실험에서 제외해야 합니다. 습관화 과정에서는 쥐를 잡으면 보통 더 뻣뻣해집니다. 이 습관 기간은 보통 2^일 째 되는 날이나^3일째 초에 찾아옵니다. EEG 케이블을 연결할 때는 부드러운 천으로 마우스의 눈을 부드럽게 덮어 움직임을 줄이고 진정시키세요(

Discussion

이 프로토콜은 요크드 대조 쥐를 가진 쥐에서 선택적 REM 수면 박탈을 가능하게 합니다. 화분 및 회전 디스크 기법과 같은 전통적인 방법과 달리, 이 시스템은 동물들이 동일한 생체 시간에서 동일한 자극을 받는 미세하게 맞춰진 대조군을 구현할 수 있게 합니다. 더 나아가, 이 방법은 기존의 부드러운 조작법과 에어 퍼프 방식에서 흔히 발생하는 자극 위치의 변동성을 최소화합니다. 그 결과, 이 기술은 REM 수면 기능을 보다 정밀하게 분리할 수 있게 할 수 있습니다.

이 프로토콜에서 중요한 단계는 REM 수면 박탈 세션 중 코를 정확하고 부드럽게 자극하는 것입니다. 다른 신체 부위에 자극을 가하면 자극 효과에 변동성이 생길 수 있습니다. 더불어, 비특이적이거나 과도한 자극은 급성 스트레스를 유발하고 이후 행동 평가의 신뢰성을 저하시킬 수 있습니다.

추가로 고려해야 할 점은 바...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5% 포도당	오츠크바	35061410
6핀 헤더	히로세	172-0989
접착제	코니시	16351
마취기	시나노 세이사쿠쇼	SN-487-0T
크림프 하우징	히로세	688-9095
크림프 소켓	히로세	688-8982
프리즈플레임4	메드 어소시에이츠	리드:SCR_014429	버전 4.104
그래프패드 프리즘	그래프패드	RRID:SCR_002798	버전 10.5.0
이부프로펜	도쿄 화학 산업	I0415
이소플루란	비아트리스	901036504
록타이트454	헨켈	UFI:  MAK2-7WRP-G202-F235
마우스 (C57BL/6J)	잭슨 연구소	리드: IMSR_JAX:000664	11.0 - 13.0 주에 공포 조건화 세션
페인트브러시	나무라타이세이도	4943668000448	SDflat No.8, 팁 길이: 8.2 mm; 폭: 18.8 mm
프로비니체 액체	쇼푸	21400BZZ00451000	250 mL
프로비니스 파우더	쇼푸	21400BZZ00451000	250g
슬립사인레코더	키세이 컴텍	리드:SCR_018200	버전 1.2.10
스테인리스 스틸 나사	야마자키	해당 없음	φ 1.0 & 시간; 2.0
표준 입체 정체 기기	ALA 사이언티픽	68038
해바라기 기름	시그마-올드리치	S5007-250ML
화이트 페트롤라툼	타이요 제약	K09-TS