방법 논문

이식 전 손상된 폐 이식편의 재활을 위한 체외 폐 관류 중 열 전처리

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DOI:

10.3791/69084

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2025년 10월 31일

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1Service of Thoracic Surgery, Department of Surgery and Anesthesiology Services, Lausanne University Hospital and Faculty of Biology and Medicine, Lausanne University, 2Service of Adult Intensive Care Medicine, Department of Interdisciplinary Centers and Logistics, Lausanne University Hospital and Faculty of Biology and Medicine, Lausanne University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 보정된 열 스트레스에 대한 일시적인 노출을 통합하는 쥐 생체 외 폐 관류 모델을 제시하여 손상된 폐 이식편의 치료적 재조정을 위한 내인성 보호 메커니즘을 촉진합니다. 이 접근 방식은 확장 가능하고 재현 가능하며 폐 이식 성공을 개선하기 위한 비약물 치료법 개발을 지원합니다.

초록

체외 폐 관류(EVLP)는 폐 이식의 획기적인 발전으로 등장하여 기증자 폐의 기능적 평가와 변연 이식편을 재활하기 위한 치료 개입을 모두 가능하게 합니다. 재조정 전략에는 약리학적 및 비약리학적 접근이 포함됩니다. 후자 중에서 우리는 일시적이고 제어된 열 스트레스("열 전처리", TP)가 내인성 보호 열 충격 반응을 유도하여 손상된 폐를 복원하는 효과적인 수단임을 입증했습니다. 여기에서는 순환기 사망(DCD) 후 기증을 시뮬레이션하여 온열 허혈에 노출된 폐를 재조정하기 위해 TP를 통합하는 쥐 EVLP 모델에 대한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 프로토콜은 폐 준비, 캐뉼라 삽입, 관류 및 열 충격 반응 유도에 대해 자세히 설명합니다. TP는 EVLP 초기에 관류액 온도를 41.5°C로 30분 증가시킨 후 나머지 관류 동안 37°C로 빠르게 복귀하는 것으로 구성됩니다. 6시간 EVLP 모델에서 TP 처리된 폐(n = 30)는 대조군(n = 30)에 비해 열 충격 단백질 70 발현 증가, 정적 폐 순응도 개선, 부종 감소, 폰 빌레브란트 인자(내피 손상 바이오마커)의 방출 감소 및 조직학적 손상 감소를 보였습니다(n = 30). 이 프로토콜은 혈관 저항, 기도압, 폐 순응도 및 산소 공급을 실시간으로 모니터링할 수 있으며 관류액과 조직 모두에서 분자 및 형태학적 분석을 지원합니다. 이 재현 가능하고 확장 가능한 프로토콜은 더 큰 동물 또는 인간 EVLP 시스템에 적용할 수 있어 이식 결과 개선을 목표로 하는 비약물적 개입을 연구하기 위한 실용적인 중개 플랫폼을 제공합니다.

서론

체외 폐 관류(EVLP)는 폐 이식 분야에서 큰 발전을 이뤘습니다. 가장 큰 영향은 변연 폐의 기능 평가를 가능하게 하여 이식을 위해 폐기될 장기를 사용할 수 있도록 함으로써 사용 가능한 기증자 폐 이식편의 풀을 확장하는 데 있습니다 1,2. 변연(또는 확장 기준) 기증자 폐는 다음 기준 중 하나 이상을 나타냅니다: 기증자 연령 55세 이상, PaO2/FiO2 300 미만, 허혈 시간 6시간 이상, 가래 미생물학 양성, 비정상적인 방사선 촬영3. 생리학적 평가 외에도 EVLP는 이식 전 이식편 품질 개선을 목표로 하는 다양한 치료 개입을 적용하기 위한 플랫폼 역할을 할 수 있습니다(치료 재조정의 개념)4. 따라서 EVLP는 손상된(변연) 폐를 재활하고 폐 이식 후 초기 및 장기 결과를 모두 손상시키는 주요 합병증인 원발성 이식편 기능 장애(PGD)의 위험을 줄일 수 있는 독특한 기회를 제공합니다 5,6. PGD는 허혈-재관류 손상(IRI) 과정의 임상적 발현으로, 병태생리학은 산화 스트레스, 염증, 보체 및 응고 캐스케이드의 활성화, 세포 사멸 과정의 유도에 의존합니다 7,8,9. 궁극적으로 이러한 메커니즘은 폐 내피와 상피의 정상적인 기능을 방해하여 PGD 6,10,11,12의 두 가지 주요 특징인 산소 공급 능력이 감소한 비심인성 폐부종을 유발합니다.

전임상 및 임상 모두에서 점점 더 많은 실험 연구가 폐 이식 중 IRI를 완화하기 위한 다양한 체외 치료 전략의 효능을 입증했습니다. 예를 들면 산화제 및 자유 라디칼을 표적으로 하는 약리학적 제제, 세포 사멸 경로, 염증 매개체, 세포 기반 및 유전자 요법 등이 있습니다. 13,14,15,16,17,18,19,20. 이러한 치료적 접근법 외에도 EVLP는 생리적 스트레스를 폐 이식편에 직접 적용하여 후속 병태생리학적 손상에 대한 적응 내성을 제공하는 내재적 보호 메커니즘을 유도하기 위한 플랫폼 역할을 할 수도 있습니다. 그러한 전략 중 하나는 EVLP 동안 폐 이식편에 일시적이고 치명적이지 않은 열 스트레스를 적용하는 것입니다. 실제로, 열 스트레스 조건이 분자 샤페론으로 작용하고 다양한 스트레스 자극에 대한 추가 노출에 대한 저항성을 부여하는 일련의 열 충격 단백질(HSP)의 발현으로 인해 적응 열 충격 반응을 촉진한다는 것은 오랫동안 알려져 왔습니다21. HSP 유도 외에도, 열 노출 후 (a) NF-E2 관련 인자 2(NRF2) 항산화제 및 세포 보호 경로를 포함하여 몇 가지 추가 세포 적응이 확인되었으며, 열 스트레스에 대한 활성화는 세포 보호 유전자 헴 옥시게나제22,23; (b) 소포체(ER 스트레스)에서 단백질독성 스트레스를 다루고, 열에 의한 활성화가 열 스트레스의 강도에 따라 보호적이거나 해로울 수 있는 풀린 단백질 반응(UPR) 24,25,26; (c) 자가포식, 손상된 소기관 및 거대분자의 리소좀 분해를 촉진하는 세포 보호 과정으로, 온도 및 시간 의존적 방식으로 열에 의해 활성화되거나 억제될 수 있습니다27,28.

우리는 이러한 "열 전처리"가 산화 스트레스, 염증, 세포 사멸 및 내피 기능 장애 감소 측면에서 주요 이점을 제공하여 폐 IRI에 대한 상당한 보호로 이어진다는 것을 입증했습니다. 따라서 우리는 열 전처리가 이식 전 손상된 폐 이식편의 생체 외 치료 재활을 위한 새로운 비약리학적 방법을 나타낼 수 있다고 제안했습니다 29,30,31. 열 전처리는 기존의 약리학적 및 비약리학적 전략에 비해 몇 가지 이점을 제공할 수 있습니다. 통합된 세포 내인성 반응을 유도함으로써 IRI와 관련된 뚜렷한 병태생리학적 경로에 대한 보호를 동시에 제공할 수 있는 반면, 다른 전략은 일반적으로 단일 경로를 표적으로 합니다. 또한 약리학적 화합물의 사용과 관련된 잠재적인 부작용의 위험을 피합니다. 본 기사의 목적은 손상된 쥐 폐의 생체 외 폐 관류 중 열 전처리의 자세한 단계별 프로토콜을 제시하는 것이며, 이는 다양한 환경, 특히 연구 목적으로 더 큰 동물 모델 또는 인간 폐에 적용될 수 있습니다.

우리는 EVLP를 위해 쥐 분리 관류 폐 시스템 IPL-2를 활용합니다. 설정은 그림 1에 설명되어 있으며 다음을 포함합니다. 관류액 저장소(그림 1-1); 관류액 순환(그림 1-2A) 및 관류액 샘플링(그림 1-2B)을 위한 2개의 롤러 펌프; 관류액 온도 유지를 위한 온도 조절 수조(그림 1-3); 유입 관류액을 탈산소화 및 카르복실화하기 위해 6%O2, 10%CO2 및 84%N2의 혼합물을 포함하는 가스 탱크(도시되지 않음)에 연결된 멤브레인 가스 교환기(도 1-4); 좌심방(LA) 및 폐동맥(PA) 압력을 모니터링하기 위한 2개의 압력 센서(그림 1-5)(PA 압력 센서는 그림에 표시되지 않음); PA, LA 및 기관 캐뉼라용 전용 연결부가 있는 심폐 블록을 수용하는 가열 및 밀봉 챔버(그림 1-6); 폐 환기 및 기도압 및 정적 폐 순응도 측정을 위해 기관 캐뉼라에 연결된 인공호흡기(그림 1-7); PA 유입 수준에서 관류액 온도를 표시하는 전자 온도계(그림 1-8). 요소가 그림 2에 자세히 표시된 연결 플랫폼(그림 1-9): PA(그림 2-1), LA(그림 2-2) 및 기관(그림 2-3) 캐뉼라에 대한 연결; 심폐 블록의 무게를 지속적으로 모니터링하기 위한 무게 모듈(그림 2-4)에 연결; PA 유입에서 관류액 온도를 모니터링하기 위한 온도 센서(그림 2-5). 회로에 대한 자세한 개략적 설명은 다른 곳에서 찾을 수 있습니다18.

프로토콜

참고: 이 연구에 성인 수컷 Sprague-Dawley 쥐를 사용했습니다(n = 60; 연령, 8-11주, 체중, 300-450g). 동물들은 지역 동물 시설에 수용되었으며(케이지당 쥐 2마리), 음식과 물을 무제한으로 이용할 수 있는 12시간의 빛/12시간의 어두움 주기로 유지되었습니다. 모든 동물은 "실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침"(NIH 간행물 번호 96-23)에 따라 치료되었으며, 모든 실험은 지역 동물 관리 위원회(Direction Générale de l'Agriculture, la Viticulture et Affaires Vétérinaires de l'Etat de Vaud(승인 3456a 및 3456x1))에서 승인한 실험 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 동물의 크기와 무게는 쥐 EVLP 모델에 대한 이전 연구와 해부학적 편의(폐 및 혈관의 크기)를 위해 선택되었습니다. Sprague-Dawley 균주는 다른 균주(특히 Wistar 쥐)가 관류 용액 1,32에 존재하는 덱스트란 용액에 대해 과민 반응을 나타낼 수 있다는 점을 감안할 때 선택되었습니다.

1. EVLP 회로에 대한 일반적인 설명

참고: 설정은 그림 1에 설명되어 있으며 연결 플랫폼의 요소(그림 1-9)는 그림 2에 자세히 표시됩니다. 회로에 대한 자세한 개략적 설명은 앞서설명되었습니다 18.

  1. 생체 외 관류를 위해 무세포 완충 세포외 용액을 사용하십시오. 관류액이 가스 교환기를 통해 저장소에서 흐르고 폐 관류를 위해 PA 캐뉼라를 통해 전달된 다음 LA 캐뉼라를 통해 저장소로 다시 빠져나가는지 확인합니다. 유입(PA) 및 유출(LA) 압력을 지속적으로 모니터링합니다.
  2. 모든 변환기(PA 압력, LA 압력, 폐 중량, 펌프 속도)를 아날로그/디지털 컨버터 박스에 연결합니다(그림 3). BDAS(Basic Data Acquisition Software)를 엽니다. 수주를 사용하여 2점 교정(0; 10cm H2O)을 사용하여 압력 신호를 교정합니다. 2점 교정(0g 및 1g)을 사용하여 분동 모듈을 교정합니다. 10 mL/min에서 1분 관류액 샘플링을 사용하여 펌프 속도를 보정합니다. 알려진 압력과 펌프 속도를 적용하고 결과의 적절성을 평가하여 신호의 품질을 제어합니다(신호 교정에 대한 자세한 프로토콜 및 비디오는 보충 자료에서 찾을 수 있음).
  3. 시스템 소프트웨어로 모든 주요 매개변수(PA, LA 압력, 폐중량 및 유량)를 실시간으로 기록하고 개인용 컴퓨터에서 시각적 디스플레이를 관찰합니다.
    참고: BDAS에 의해 기록된 생리학적 신호는 메뉴 표시줄의 파일 내보내기 명령을 사용하여 텍스트 파일로 내보내집니다. 선택한 시점(60분마다)에서 추출된 데이터는 스프레드시트로 전송된 다음 통계 분석을 위해 소프트웨어에 복사/붙여넣습니다.
  4. 방정식 (1)을 사용하여 폐혈관 저항(PVR)을 계산합니다.
    figure-protocol-1(1)
  5. 다양한 생물학적 마커 측정을 위한 전용 시점에서 관류액의 샘플(1-2mL)을 얻습니다.

2. 열 전처리 적용

  1. 온도 조절 수조(그림 4-1)를 연결하여 관류액 가열을 위한 일정하고 정확하며 조정 가능한 수온을 보장합니다. 수조 내부의 통합 모터 펌프를 사용하여 가열된 물을 순환시킵니다.
  2. 이중벽 유리 용기를 저장소로 사용하고(그림 4-2), 용기 벽 사이에 가열된 물을 순환시켜 관류액 온도를 유지합니다.
  3. 가열된 물 용기(그림 4-3) 내부에 구불구불한 튜브가 있는 가열 코일을 사용하여 관류액을 구동하여 생체 외 폐 제제에 들어가기 직전에 물에서 관류액으로 열교환을 허용합니다.
  4. 따뜻한 환경을 유지하기 위해 온도 조절 수조에서 순환하는 물로 채워진 이중벽 용기인 장기실(그림 4-4)에 심폐 블록을 보관합니다.
  5. 온도 센서 및 온도계(그림 2-5 및 그림 4-5)의 경우 폐동맥(PA)으로 들어가는 실제 관류액 온도를 지속적으로 모니터링하기 위해 유입 캐뉼라에 K형 비드 공기/표면 센서를 안전하고 견고하게 적용합니다. 온도는 디지털 온도계에 표시됩니다.
  6. 유입 온도를 37°C로 유지하려면 수조를 38-38.5°C로 설정하십시오.
    참고: 튜브의 경로를 따라 관류액으로 인한 열 손실을 보상하기 위해 유입 시 37°C를 유지하기 위해 수조 온도를 38-38.5°C로 설정해야 한다고 조건에서 결정했습니다. 관류액의 열 손실에 따라 유입 시 원하는 온도를 보장하기 위해 이러한 설정을 조정해야 할 수도 있습니다.
  7. EVLP 60분 후에 수조 온도를 최대 43°C까지 올려 5분에 걸쳐 얻고 30분 이상 유지하는 41.5°C의 유입 온도에 도달하여 생체 외 가열 프로토콜을 시작합니다.
    참고: 이전 작업29에서 그림 5에 표시된 바와 같이 40°C에서 43.5°C까지의 온도 범위와 3시간의 EVLP 프로토콜을 사용하여 열 전처리(TP)를 위한 최적의 온도를 결정했습니다. 유해한 영향 없이 최적의 보호를 제공하는 가열 온도(그림 5B에 요약된 대로)는 41.5°C로 나타났습니다. 따라서 이 온도는 EVLP 지속 시간이 최대 6시간29,30,31인 모든 후속 실험에 사용되었습니다.
  8. 이 일시적인 가열 후, 수조에 얼음을 추가하여 급속하게(5분 후에) 수조 온도를 다시 38°C로 낮추어 유입 캐뉼라의 관류액 온도를 다시 37°C로 되돌리고 EVLP 프로토콜이 끝날 때까지 이 온도를 유지합니다.
  9. 생리학적 변수(폐 순응도), 부종 형성 및 분자 종점(열 충격 단백질의 발현, 항산화 효소, 염증성 사이토카인 및 세포사멸, 자가포식, 소포체 스트레스 및 내피 세포 손상의 바이오마커)을 결정합니다.

3. 열 전처리를 위한 상세한 EVLP 프로토콜

  1. 동물 준비
    1. 캐뉼라 및 수술 기구를 포함하여 필요한 재료를 준비합니다(그림 6A,B 및 재료 표).
    2. 동물의 무게를 측정하여 모든 투여 물질, 관류액 흐름 및 환기 매개변수에 대한 적절한 복용량을 계산합니다.
    3. 마취제 혼합물을 준비합니다: 같은 주사기에 80mg/kg 케타민과 8mg/kg 자일라진.
      알림: 마취제는 안전한 캐비닛에 보관해야 합니다.
    4. 등장성 식염수(1mL 주사기)에 헤파린, 체중 1.7U/g을 준비합니다.
    5. 5% 이소플루란(전용 유도 챔버에서 기화됨)을 사용하여 동물을 마취시킨 다음 준비된 마취제 혼합물을 복강 내 주사합니다. 안면 마스크를 통해 1-2% 이소플루란으로 마취를 유지합니다.
      참고: 출혈 중 헐떡임을 피하기 위해 깊은 마취를 유지하는 것이 중요합니다.
      작업자를 보호하기 위해 이소플루란 추출 시스템이 있는 설정을 사용하십시오.
      모든 바늘과 주사기를 적절한 생물학적 위험 및 날카로운 폐기물 용기에 버리십시오. 밀봉된 날카로운 생물학적 위험 용기는 지정된 폐기물 흐름을 통해 폐기됩니다.
    6. 동물의 목에서 음경 부위까지 면도하고 젖고 따뜻한 종이를 사용하여 남아 있는 털을 제거합니다.
    7. 뒷발을 꼬집어 마취 깊이를 확인하십시오. 반사가 있는 경우 이소플루란 농도를 높입니다.
    8. 동물을 바로 누운 자세로 놓고 접착 테이프를 사용하여 네 팔다리를 모두 고정합니다.
  2. EVLP에 대한 심폐 차단 추출
    참고: 이 절차는 시기적절하고 외상이 없으며 재현성이 높은 방식으로 다양한 단계를 수행하기 위해 집중적인 교육이 필요합니다. 가장 섬세한 단계는 폐동맥 캐뉼라 삽입으로, 최상의 결과를 얻으려면 정반사 수술 현미경을 사용하여 확대하여 수행해야 합니다. 전체 절차는 잘 훈련된 한 명의 조사관이 수행할 수 있습니다. 이러한 실험적 독립성을 달성하려면 숙련된 조사자의 감독하에 최소 15개의 완전한 절차가 필요합니다.
    1. 목의 정중선에서 피부를 부드럽게 들어 올리고 작은 가위를 사용하여 꼬리에서 두부 축을 따라 세로 5cm 절개합니다.
    2. 침샘엽을 분리하고 후두와 기관이 명확하게 노출될 때까지 구부러진 겸자를 사용하여 흉골설골근 위의 근막을 조심스럽게 해부합니다.
    3. 기관 아래에 4-0 실크 봉합사를 통과시키고 집게를 기관 아래에 제자리에 두고 예쁜 매듭을 준비합니다.
    4. Stahl 공식33을 사용하여 생체 내 환기 및 폐 조달을 위한 일회 호흡량(Vt)을 계산합니다.
      figure-protocol-2× figure-protocol-3
    5. 생체 내 환기 및 폐 조달 전용 인공호흡기( 재료 표 참조)를 호흡수가 70회/분, 흡기 산소 분율(FiO2) 0.5, 호기말 양압(PEEP)이 3cm H2O.
      알림: PEEP를 3cm H2O로 설정하려면 인공호흡기의 호기 암을 물이 채워진 용기 표면 아래 3cm에 삽입된 백금 경화 실리콘 튜브에 연결합니다.
    6. 두 개의 연골 고리 사이에 가로 절개를 만들고 환기를 위해 외경 2mm 캐뉼라(길이 14mm, EVLP 환기 캐뉼라, 그림 6B)를 삽입하고 봉합사를 조여 고정합니다.
    7. 캐뉼라를 인공호흡기에 연결하고 인공호흡기의 호기 암에 연결된 물이 채워진 용기에 기포가 있는지 확인하여 효과적인 환기를 확인합니다.
    8. 끝이 뭉툭한 가위를 사용하여 복부를 따라 피부를 절개하고 복강으로 들어가 정중선 복벽 근육을 횡격막까지 절개합니다.
    9. 면봉을 사용하여 장을 부드럽게 옆으로 움직여 하대정맥을 노출시킵니다.
    10. 준비된 헤파린 용액을 정맥에 주입하고 5분 동안 순환시킵니다. 그런 다음 출혈을 위해 대정맥과 대동맥을 절개합니다.
    11. 동물이 완전히 피혈되고 사망한 것으로 확인되면 환기를 중지하고 기관 캐뉼라에서 인공호흡기를 분리하여 폐가 수축되도록 하여 온허혈이 시작됩니다. 총 온열 허혈 시간(WIT)을 1시간으로 유지합니다.
      참고: 임상 DCD 폐 기증에서 보고된 WIT 중앙값은 33분이지만 1년 생존에 대한 최대 60분의 WIT 지속 시간의 해로운 영향은 보고되지 않았습니다. 따라서 대부분의 센터는 현재 WIT34의 허용 가능한 상한으로 60-90분에 동의합니다. 따라서 앞서 자세히 설명한 바와 같이, 쥐 모델에서 1시간 WIT를 사용하는 것은 임상 시나리오35와 관련이 있습니다.
    12. 1시간의 총 온열 허혈 시간이 끝나기 15분 전(즉, 45분의 온열 허혈 후), 60mL 주사기(홀더에 고정)에 차가운(4°C, 냉장고에 보관) 보존 용액을 채웁니다( 표 1의 조성 참조).
      알림: 주사기의 바닥은 동물 위 20cm에 설정되어 있습니다. 얼음물에 담근 실리콘 튜브를 사용하여 주사기를 PA 캐뉼라에 연결합니다(그림 6C).
    13. 조직 손상을 방지하기 위해 끝이 뭉툭한 리스터 가위를 사용하여 정중 흉골 절개술을 수행하고 탄성 밴드에 부착된 무딘 견인기와 횡격막에 부착된 미세 모기 지혈제를 사용하여 흉벽을 조심스럽게 후퇴시켜 폐를 노출시킵니다. 폐 실질과의 직접적인 접촉을 피하십시오.
      참고: 이 단계에서 조직 건조를 방지하기 위해 필요한 경우 폐 표면에 소량의 생리 식염수를 바르십시오.
    14. 심장 좌심실 정점에 "X" 절개를 하고 심장 내부의 가위를 좌심방까지 밀어 LA 캐뉼라를 나중에 삽입할 수 있도록 합니다.
    15. 메인 PA 아래에 5-0 실크 봉합사를 통과시키고 미리 묶은 이중 매듭을 준비하고 집에서 만든 홀더로 봉합사를 한쪽으로 고정합니다(그림 6D 및 그림 7A).
    16. 나중에 LA 캐뉼라를 고정하기 위해 심장 주위에 추가 봉합사를 준비합니다(그림 7B).
    17. 메인 PA를 작게 절개하고 PA 캐뉼라를 삽입하여 기포가 유입되지 않도록 합니다.
    18. PA 캐뉼라를 통해 25mL의 냉찜질액으로 폐를 즉시 관류하여 냉허혈 시간을 시작합니다.
      알림: 이 관류를 위해 위에서 설명한 홀더의 주사기 높이에서 수동 압력을 사용하십시오.
    19. 예쁜 봉합사로 캐뉼라를 제자리에 고정합니다.
    20. PA 캐뉼라 삽입 직후 기관 캐뉼라를 인공호흡기에 다시 연결하고 초기 설정으로 인공호흡을 재개하여 호흡수를 분당 25회로 줄입니다.
    21. 좌심실 절개를 통해 좌심방으로 LA 캐뉼라를 삽입합니다.
    22. 좌심방에서 흐름이 방해되는 것을 방지하고 전체 25mL 부피의 냉간 보존 용액이 통과하도록 주의하면서 미리 묶인 두 번째 봉합사(심장 주변)로 캐뉼라를 고정합니다(~15분 소요).
    23. 보존액 관류가 끝나면 PA 캐뉼라를 불독 클램프(그림 7C, 파란색 원)로 고정하고 튜브에서 분리합니다.
    24. 폐를 동원하기 위해 기관과 주변 조직을 조심스럽게 해부합니다.
    25. 동맥류 클립(그림 7C, 빨간색 원)을 사용하여 기관을 고정하고 폐가 완전히 팽창된 상태(일회 호흡량 1회)합니다.
    26. 하행 대동맥과 기타 지지 혈관을 해부하여 심폐 블록을 풀고 기관을 부드럽게 잡아 들어 올립니다.
    27. 심폐 블록을 보존액이 들어 있는 접시에 엎드린 자세로 놓고 4°C에서 총 1시간의 저온 허혈 시간 동안 보관합니다.
      참고: 수술이 끝나면 전담 서비스에서 추가로 제거할 수 있도록 생물학적 유해를 폐기물 처리 백에 넣으십시오.
  3. Ex-vivo 폐 관류 및 열 전처리
    참고: 프로토콜의 여러 단계를 통해 진행을 안내하는 주요 단계를 설명하는 순서도를 참조하십시오.그림 8).
    1. 온도 조절 수조에 얼음 양동이를 놓아 관류 온도를 15°C로 낮춥니다.
    2. 저장소에 100mL의 관류액을 채우고 시스템을 통해 순환하도록 합니다. 인간 알부민 기반 관류 용액( 표 1의 조성물 참조)을 체외 관류를 위한 무세포 완충 세포외 용액으로 사용합니다.
    3. 관류액의 pH를 측정하고 생리학적 수준(7.35-7.45)으로 유지하고 그에 따라 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(THAM) 완충액을 첨가합니다.
    4. 심폐 블록의 무게를 측정하고 동맥류 클립을 기관에 제자리에 유지하면서 환기 캐뉼라부터 시작하여 EVLP 시스템에 장착합니다.
    5. PA 캐뉼라를 연결하고 기포가 폐 맥관 구조에 유입되지 않도록 조심스럽게 피하십시오(기포 트랩이 채워졌는지 확인).
    6. 관류액 몇 방울을 빠져나와 LA 캐뉼라를 연결하십시오.
    7. 배액 회로에 연결된 유출 라인의 높이를 조정하여 좌심방압을 3mmHg로 설정합니다.
    8. 무게 모듈을 0으로 설정하고 EVLP 전체에서 심장 폐 블록의 무게 변화를 모니터링합니다.
    9. Lindstedt와 Schaeffer가 개발한 공식을 사용하여 이론적 심박출량(CO)을 계산합니다.
      figure-protocol-4
    10. 표 2에 설명된 대로 관류(이론적 CO의 2%)를 시작하고 지정된 매개변수에 따라 관류액 흐름(이론적 CO의 7.5%)과 온도를 점진적으로 증가시킵니다.
      참고: EVLP 동안 관류액 흐름은 계산된 이론적 CO의 2%에서 7.5% 사이로 설정됩니다. 이 낮은 관류액 흐름은 폐동맥압을 정상 범위 내로 유지하고 특히 따뜻한 허혈성 손상 폐에서 초기 폐부종의 위험을 줄일 수 있습니다. 이를 통해 사용자는 장기간 준비를 유지할 수 있습니다. 다른 연구자들은 쥐 EVLP에 대해 유사한 흐름을 사용한 반면, 다른 연구자들은 이론적 CO38의 최대 20%의 흐름을 사용했습니다.
    11. 수조의 온도를 점진적으로 높여 관류액의 온도를 조정하십시오.
      알림: 부상을 방지하기 위해 모든 난방 장비에 손을 대지 않도록 주의하십시오.
    12. 관류 온도가 35°C에 도달하면 기관에서 동맥류 클립을 제거하고 생체 외 환기 전용 인공호흡기를 시작하여 기계적 환기를 시작합니다( 재료 표 참조).
      알림: 압력 교정은 2점 교정(0 및 30cm H2O)을 사용하여 14일마다 수행됩니다. 튜브 교정은 튜브 및 캐뉼라의 저항과 관련된 외부 요인을 수정하기 위해 프로그래밍된 프로토콜에 따라 각 사용에서 수행됩니다.
      1. 기도압 측정과 함께 폐용적을 단계적으로 증가시키는 프로그래밍된 프로토콜에 따라 전용 시점(순서도, 그림 8 참조)에서 호흡 신호 및 폐 순응도를 지속적으로 기록하므로 인공호흡기 설정 및 데이터 수집을 위해 참조된 소프트웨어를 사용하십시오.
      2. 그런 다음 컴플라이언스는 압력 부피 루프의 수축 사지에 적합한 방정식(Salazar-Knowles 방정식)에 의해 자동으로 계산됩니다.
      3. 모든 환기 데이터를 표시하고 전용 개인용 컴퓨터에 저장하고 스프레드시트로 내보냅니다. 선택한 시점에서 데이터를 추출하여 다른 스프레드시트로 전송한 다음 통계 분석 소프트웨어에 복사/붙여넣습니다.
    13. 호흡수와 일회 호흡량을 각각 7회/분, 3mL/kg으로 10분 동안 설정한 후 10분 동안 15회/분, 6mL/kg으로 증가시킨 후 마지막으로 30회/분, 6mL/kg으로 증가시킵니다. EVLP 전체에서 호기말 양압(PEEP)을 3cm H2O로 설정합니다(표 2).
    14. 6초 동안 기도압을 15cm H2O로 설정하여 무기폐를 예방하기 위해 EVLP의 30분마다 모집 조작을 적용합니다.
    15. 1시간, 2시간, 3시간, 4.5시간 및 6시간 EVLP에서 총 폐 부피 10mL/kg 체중까지 단계적 폐 팽창을 적용하여 폐 순응도 및 최대 흡기압(Pmax)을 결정합니다.
      참고: 규정 준수 측정은 위에서 설명한 모집 조작에 따라 수행됩니다.
    16. 60분 EVLP 후 유입 PA 캐뉼라에서 관류액 온도를 37°C에 도달하도록 높입니다.
    17. EVLP 60분 후에 생체 외 가열 프로토콜을 시작합니다.
    18. 그림 2, 그림 3 및 그림 4-5에 표시된 대로 유입 PA 캐뉼라에서 수조 온도를 최대 43°C까지 올려 41.5°C에 도달합니다(~ 5분 소요).
    19. 이 온도를 60분에서 90분 EVLP까지 유지합니다(총 30분).
      참고: 이전 작업에서 우리는 30분 동안 41.5°C가 전체 폐 수준에서 열 손상을 촉진하지 않음을 보여주었습니다29. 우리는 그러한 조건에서 열 손상을 테스트하기 위해 특정 시험관 내 세포 생존율 분석을 수행하지 않았습니다.
    20. 30분 가열 후 수조에 얼음을 추가하여 유입 캐뉼라의 온도를 37°C로 빠르게 (5분) 설정합니다.
      참고: 대조군에서 관류액 온도는 열 전처리 적용 없이 EVLP 전체에서 37°C로 유지됩니다( 표 2 참조). 우리는 "가짜 가열" 그룹(예: 온도 상승 없이 수조 열 조절)을 통합하지 않습니다.
    21. EVLP가 끝날 때까지 유입 PA 캐뉼라에서 관류액 온도를 37°C로 유지합니다.
    22. 그림 1-2B와 같이 회로(폐 준비의 업스트림 또는 다운스트림)에 연결된 샘플링 포트 중 하나에서 EVLP의 1시간, 2시간, 3시간, 4.5시간(각 시점에서 1-2mL) 및 6시간(10mL)에 관류 용액 샘플을 수집합니다. 가스 분석(CG4+ 카트리지를 사용하여 pH, PCO2 및 PO2 측정)을 위해 샘플을 즉시 사용하십시오. 추가 생화학적 측정을 위해 샘플을 원심분리하고(500× g, 4°C에서 10분) 사용할 때까지 투명한 상청액을 -80°C에서 유지합니다.
    23. 6시간 EVLP 후 동맥류 클립을 기관에 다시 적용하고(폐가 완전히 팽창되면) 불독 클램프로 PA 캐뉼라를 고정합니다.
    24. 심폐 블록의 무게를 측정하여 최종 무게를 얻습니다.
      참고: EVLP 중 체중 증가는 최종 체중과 초기 체중 간의 차이로 평가하거나 위에서 설명한 체중 모듈을 사용하여 EVLP 동안 지속적으로 모니터링할 수 있습니다.
    25. 폐를 조심스럽게 해부하여 개별 엽을 분리합니다.
    26. 다운스트림 적용을 위해 조직을 보존합니다: 액체 질소에서 급속 동결하고 생화학적 분석을 위해 -80°C에서 보관하거나 조직학적 평가를 위해 파라포름알데히드(PFA)에 고정합니다. 왼쪽 폐를 유지하고 폐 이식을 준비할 수 있습니다.

4. 통계

  1. 동물을 특정 치료 그룹에 할당합니다(대조군 대 열 전처리, 각 실험 종점에 대해 n = 5/그룹).
    참고: 우리는 동물을 하나 또는 다른 그룹에 무작위로 할당하지 않지만 그룹은 매일 번갈아 가며 진행됩니다. 프로토콜(열 대 제어)은 실험 중 관류액의 온도를 엄격하게 알아야 하기 때문에 맹검 방식으로 수행할 수 없습니다. 대조적으로, 생물학적 및 조직학적 분석은 할당된 치료군을 식별하지 않고 맹검 방식으로 수행됩니다.
  2. 데이터를 분석합니다.
  3. SEM± 수단으로 결과를 표현합니다.
  4. Kolmogorov-Smirnov 테스트를 사용하여 데이터의 정규 분포를 확인합니다.
  5. 시점 실험의 경우 양방향 ANOVA를 사용하여 시간 및 그룹 할당의 효과를 평가한 다음 그룹 효과에 대한 Sidak의 사후 테스트와 1시간을 기준으로 시간 효과에 대한 Bonferroni 보정을 평가합니다. 0.05< p 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주합니다. ANOVA를 적용하기 전에 비정규 분포의 경우 데이터의 로그 변환을 고려하십시오.
  6. 조직학적 분석의 경우, 10개 필드/섹션에서 혈관주위 부종을 정량화하여 각 샘플의 폐 손상 점수를 (맹검 방식으로) 결정합니다.
    1. 혈관주위 부종이 있는 혈관의 상대적 수를 사용합니다(A): 0: 없음; 1: 경증(<25%); 2: 보통(25-50%); 3: 심각(>50%).
    2. 혈관주위 부종(B)의 두께를 내혈관 직경의 백분율로 계산합니다(0: 부종 없음, 1: <25%; 2: 25-50%; 3: >50%).
    3. 조사된 10개 섹션에서 A + B의 합을 사용하여 점수31을 계산합니다.
    4. 비모수 Mann-Whitney 검정(데이터의 정규 분포가 아니기 때문에)을 사용하여 통계적 비교를 수행하고 유의성은 p < 0.05로 할당됩니다.

결과

폐 생리학적 변수는 폐동맥압(PAP), 계산된 폐혈관 저항, 정적 폐 순응도(SPC) 및 최대 기도압(Pmax)을 포함한 환기 매개변수를 포함하여 절차 전반에 걸쳐 지속적으로 모니터링됩니다. 또한, 웨이트 모듈은 폐의 체액 축적에 대한 간접적인 측정을 제공하여 부종 형성을 평가할 수 있습니다. 제어 폐(Ctrl)와 관련하여 열 전처리(TP)의 이점에는 SPC의 개선(그림 9A, 초기 SPC 값에 대한 각 시점의 SPC의 비율로 표현됨, n = 5/그룹) 및 EVLP 동안 폐 중량 증가 감소(그림 9B, n = 5/그룹)가 포함됩니다. 데이터는 SEM± 평균으로 표시됩니다.

관류액은 다양한 바이오마커에 대해 분석할 수 있습니다. 예를 들어, 열 전처리는 EVLP 종료 시 내피 세포 바이오마커인 폰빌레브랜드(vWF)의 방출이 현저히 감소하는 것과 관련이 있습니다(그림 9C, n = 5/그룹, SEM± 의미).

EVLP가 끝날 때 얻은 폐 조직의 형태학적 분석에는 조직학 및 면역조직화학이 포함됩니다. 헤마톡실린 및 에오신(H & E) 염색 절편의 예는 그림 9D에 나와 있으며, 폐 손상 점수로 표현되는 열 전처리에 노출된 폐의 조직학적 손상 감소를 보여줍니다(그림 9E, n = 5/그룹). 점수는 10개 필드/섹션에서 혈관주위 부종을 정량화하여 설정되었습니다(프로토콜 단계 4.6.1 및 4.6.2 참조). 조사된 10개 섹션의 A + B의 합계를 사용하여점수 31을 계산했습니다.

EVLP가 끝날 때 폐 조직의 분자 분석에는 RNA 또는 단백질 발현 프로파일링이 포함됩니다. 예를 들어, 유도성 열충격 단백질 HSP70의 단백질 발현 수준을 ELISA에 의해 측정하여 열 전처리에 노출된 폐에서 열충격 반응의 발달을 나타낼 수 있다(그림 9F, EVLP의 다른 지속 시간을 갖는 시간 경과 실험을 나타냄, n = 5/그룹에서 각 시점에서). TP군에서 HSP70의 발현은 3시간 EVLP 후, 즉 TP 종료 후 90분 후에 정점에 도달했으며, 이후 EVLP가 종료될 때까지 안정적으로 유지되었습니다. 데이터는 SEM± 평균으로 표시됩니다.

figure-results-1
그림 1: EVLP 플랫폼에 대한 설명. (1) 관류액을 위한 이중벽 저장소. (2A) 관류액 순환용 롤러 펌프. (2B) 관류액 샘플링(생화학적 측정 및 가스 분석)용 롤러 펌프. (3) 온도 조절 수조. (4) 가스 탱크에 연결된 멤브레인 가스 교환기(도시되지 않음). (5) 좌심방압 센서. (6) 가열 및 밀봉된 챔버. (7) EVLP 인공호흡기. (8) 온도 프로브 및 온도계. (9) 심폐 차단용 연결 플랫폼, 그 요소는 그림 2에 자세히 설명되어 있습니다. (참고: PA 압력 센서는 보이지 않습니다.) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 심폐 차단용 연결 플랫폼. (1) 폐동맥으로의 유입 캐뉼라. (2) 좌심방에서 유출 캐뉼라. (3) 기관 캐뉼라 연결. (4) 무게 모듈. (5) 유입 캐뉼라에 단단히 부착된 자체 설계 온도 프로브. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 신호 트랜스듀서/증폭기 및 아날로그/디지털 컨버터 박스. (A). 폐동맥압 변환기/증폭기. (B). 펌프 속도 유량 컨트롤러. (씨). 좌심방압 변환기/증폭기. (D). 폐 중량 모듈. (E). 아날로그/디지털 변환기. (F). 데이터 표시 및 기록을 위한 개인용 컴퓨터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: EVLP 동안 관류액의 온도 유지. (1) 온도 조절 수조. (2) 온도 조절 수조의 물이 순환하는 이중벽 유리 용기가 있는 관류액 저장소. (3) 온도 조절 수조에 연결된 가열 물 용기 내부의 가열 코일 튜브. (4) 수조에서 따뜻한 물 순환을 위한 이중벽 유리 용기가 있는 오르간 챔버. (5) 전자 온도계와 자체 설계 온도 프로브가 유입 캐뉼라에 단단히 부착되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 열 전처리를 위한 최적 온도 식별. (A) 다양한 가열 온도 평가를 위한 EVLP 프로토콜. EVLP의 60분에서 90분까지 관류액 온도는 표시된 온도에서 증가했습니다. EVLP 90분에서 EVLP가 끝날 때까지 90분 동안 온도를 37°C로 되돌려 다양한 생리학적, 분자적 측정을 수행하였다. (B) 생리학적 및 분자적 매개변수에 대한 다양한 가열 온도의 영향에 대한 결과 요약(녹색은 유리한 효과를 나타내고, 빨간색은 불리한 효과를 나타내며, 주황색은 혼합 효과를 나타냄). 41.5°C의 가열 온도가 가장 큰 보호 효과를 제공했습니다. 약어: EVLP = 생체 외 폐 관류; TP = 열 전처리. 이 수치는 Ojanguren et al.21에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6: 수술 재료. (A) 심폐 차단 추출을 위한 기구: 동맥류 클립 홀더 및 동맥류 마이크로클립(Yasargil 시스템), 불독 클램프, 가위, 미세가위, 탄성 밴드에 부착된 견인기. (B) 폐동맥(PA), 좌심방(LA) 및 기관에 대한 EVLP 캐뉼라. (C) 폐의 차가운 관류액 세척을 위한 수제 관류 시스템. 동물의 PA 레벨과 주사기 바닥 사이의 거리는 20cm로 설정됩니다. (C) 집에서 만든 홀더. (표시되지 않음: 수술용 현미경, 인공호흡기 및 마취 설정). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 7: 수술 준비의 대표 사진 (A) 폐동맥 주위에 미리 묶인 매듭. (B) 심장 끝 주위에 미리 매듭을 묶습니다. (C) PA 캐뉼라의 불독 클램프(파란색 원)와 기관의 동맥류 클립(빨간색 원). 약어: PA = 폐동맥. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 8: 순서도. 프로토콜의 여러 단계를 통해 진행을 안내하는 주요 단계. 1시간에서 1.5시간 EVLP 사이의 기간은 그룹 할당(대조군 대 열 전처리)에 따른 치료 프로토콜을 나타내기 위해 확대됩니다. 약어: CI = 한랭 허혈; EVLP = 체외 폐 관류; PA = 폐동맥; SPC = 정적 폐 순응도; TP = 열 전처리; WI = 온열 허혈. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 9: 손상된 쥐 폐에서 열 전처리의 효과에 대한 대표적인 결과. 1시간의 온열 허혈로 손상된 폐를 EVLP 시스템에서 6시간 동안 관류했습니다. EVLP의 60분에서 90분까지 폐 그룹을 41.5°C(TP 그룹)에서 열 전처리했습니다. 폐의 대조군은 EVLP 기간 동안 37°C로 유지되었습니다. (A) 대조군(Ctrl, n = 5) 및 TP 폐(n = 5)에서 초기 값의 비율로 표현되는 정적 폐 순응도(SPC). SPC는 TP 폐에서 더 잘 보존되었습니다. (B) 대조군(n = 5) 및 TP 폐(n = 5)에서 EVLP 동안 폐의 체중 증가. TP 그룹에서 부종 형성이 크게 감소했습니다. (C) 내피 세포 바이오마커 폰 빌레브란트 인자의 관류액 방출은 대조군(n = 5)에 비해 TP 그룹(n = 5)에서 억제되었습니다. (D) 대조군(n = 5) 및 TP 폐(n = 5)에서 EVLP 말단의 폐 거시적 및 현미경적(헤마트실린-에오신 염색) 모양. (E) 폐 손상 점수(조직학적 손상의 정량화를 위해)는 대조군(n=5)에 비해 TP군(n=5)에서 낮았습니다. (F) 대조군 및 TP군에서 1, 2, 3, 4.5 및 6시간 EVLP 후 측정된 폐 조직 추출물에서 유도성 열충격 단백질 HSP70의 단백질 수준(각 시점에서 n = 5/그룹), TP 그룹에서 현저한 열충격 반응을 나타냄. TP 그룹에서 HSP70의 발현은 3시간 EVLP(TP 종료 후 90분) 후에 최고조에 달했으며 그 후 EVLP가 끝날 때까지 안정적으로 유지되었습니다.
모든 그래프는 평균 ± SEM을 보여줍니다. 시간 경과 실험(A-C,F)의 경우 양방향 분산 분석에 이어 그룹 효과에 대한 Sidak의 테스트와 시간 효과에 대한 Bonferroni의 조정(시간 1시간을 기준으로 함)을 사용하여 통계적 비교를 수행했습니다. 폐 손상 점수(E)의 경우 Mann-Whitney 테스트를 사용하여 통계적 비교를 수행했습니다. * p < 0.05(그룹 간 차이), † p < 0.05 대 1시간 EVLP. 약어: Ctrl = control; EVLP = 체외 폐 관류; HSP70 = 열충격 단백질 70; SPC = 정적 폐 순응도; TP = 열 전처리. Parapanov et al.23에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 프로토콜에 사용된 용액의 구성. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: 관류 흐름, 유입 온도(폐동맥 캐뉼라 수준) 및 시간 경과에 따른 환기에 대한 EVLP 설정. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 3: 문제 해결. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 자료. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

재현 가능하고 생리학적으로 관련된 쥐 EVLP 모델의 개발은 폐 이식 연구에서 중요한 진전을 나타냅니다. 쥐와 인간 폐 사이의 상당한 종 차이(최근 1에서 검토됨), 특히 쥐 폐의 더 큰 취약성에도 불구하고 쥐 EVLP 모델은 높은 재현성과 저렴한 비용으로 약리학적 및 비약리학적 개입을 제공합니다. EVLP는 기증자 폐 기능을 평가하고, 허혈-재관류 손상과 같은 임상 손상 시나리오를 시뮬레이션하고, 이식 전에 치료 개입을 구현하기 위한 고유한 플랫폼을 제공합니다 2,39,40. 이러한 맥락에서 쥐 EVLP 모델은 엄격하게 통제된 조건33에서 고처리량 기계론적 조사를 가능하게 합니다. 최근 몇 년 동안 여러 그룹이 쥐 EVLP 기술의 개선에 기여했습니다. Nelson et al. 기본적인 절차 지침을 제공했습니다39. Wang et al. 순환기 사망(DCD) 시뮬레이션41 후 기증을 모방하도록 맞춤화된 모듈식 EVLP 설정을 제안했습니다. Gouchoeet al. 인공 산소 운반체를 사용하여 새로운 관류액 제제를 탐색했습니다42 Oliveira et al. 장기간 저온 허혈 보존 후 염증에 초점을 맞췄습니다38. 이러한 기존 지식을 바탕으로 현재 프로토콜은 온열 허혈에 의해 손상된 쥐 폐 이식편의 재조정을 위한 내인성 보호 메커니즘을 활성화하도록 설계된 새로운 비약리학적 전략, 즉 열 전처리를 도입합니다. DCD 상태를 시뮬레이션하는 손상된 폐 모델은 수컷 Sprague-Dawley 쥐33에서 수행되었습니다.

이 프로토콜을 확립하려면 폐 생존력과 재현성에 결정적인 영향을 미치는 기술적으로 까다로운 몇 가지 단계에 세심한 주의가 필요했습니다. 폐 회수는 실질 손상을 피하기 위해 최소한의 조작으로 수행되어야 합니다. 마취의 깊이는 헐떡임으로 인한 폐울혈과 출혈 불량을 예방하는 데 가장 중요합니다. 작은 색전증도 부종을 유발할 수 있으므로 캐뉼라 삽입 및 회로 프라이밍 중에 기포를 엄격히 피하는 것이 필수적입니다43. 일반적인 프로토콜 문제에 대한 구체적인 문제 해결 조언은 표 3에 나와 있습니다. 환기 및 관류 설정은 안전한 한계 내에서 조정할 수 있지만 기압상해 또는 용적상해를 예방하기 위해 폐 보호 전략을 유지해야 합니다44. 관류액 흐름은 돼지나 인간과 같은 대형 모델의 40%에 비해 쥐의 추정 심박출량의 최대 20%까지 증가할 수 있지만 신중하게 적정해야 합니다45. 우리의 프로토콜에서는 더 낮은 관류액 흐름(이론적 심박출량의 7.5%)을 사용하여 폐동맥압의 급증과 따뜻한 허혈성 손상 폐에서 초기 폐부종의 발생을 방지하여 확장된 준비를 허용합니다. 일부 실험실에서는 염증을 줄이기 위해 관류 중에 코르티코스테로이드를 투여하지만46,47, 알려진 항염증 효과는 일부 실험 결과를 혼란스럽게 할 수 있으므로 폐 손상 및 염증 과정을 연구하는 능력을 보존하기 위해 모델에서 코르티코스테로이드를 사용하지 않습니다.

열 전처리에는 정밀한 온도 제어가 필요합니다. 저수지에서 폐까지 튜브를 따라 열이 손실되기 때문에 유입 캐뉼라에서 관류액 온도를 모니터링해야 하며, 준비 내에서 목표를 달성하기 위해 수조 설정을 원하는 유입 온도보다 약간 높게 유지해야 합니다. 센서는 정확성을 보장하기 위해 다중 채널 PCE-T 1200 디지털 온도계를 사용하여 매년 교정됩니다.

우리의 연구 결과는 또한 기존 온열 요법의 주요 한계를 다룹니다. 전신 열 적용은 부정확한 온도 조절, 전신 부작용 및 장기 특이성 부족으로 인해 제한됩니다. EVLP는 통제되고 국부적인 환경을 제공하여 열 스트레스를 폐 조직에 직접 정확하게 전달할 수 있도록 함으로써 이러한 장벽을 우회합니다29. 이 방법을 사용하면 열 손상을 유발하지 않고 보호 세포 반응을 최적화하기 위한 두 가지 중요한 매개변수인 열 응력의 크기와 지속 시간을 엄격하게 조절할 수 있습니다. 또한 당사의 EVLP 플랫폼을 사용하면 분자, 조직학 및 기능 분석을 포함한 여러 다운스트림 평가가 가능합니다. 중요한 것은 EVLP를 받은 폐도 이식할 수 있어 생체 내에서 EVLP 이식 후 기능을 직접 평가할 수 있다는 것입니다 29. 따라서 이 모델은 분리된 장기 및 이식 후 수준 모두에서 평가를 지원합니다. 이러한 맥락에서 EVLP 동안 41.5°C에 일시적으로 노출되는 열 전처리의 통합이 유망한 개입으로 떠오릅니다. 열 충격 반응 및 기타 스트레스 적응 경로를 자극함으로써 이 방법은 약리학적 교란 요인 없이 이식편 탄력성을 향상시킵니다. 우리의 결과는 열 전처리가 폐 이식편 생리학을 개선하고 부종 형성을 감소시키며 염증 매개체 및 세포 손상의 바이오마커의 방출을 감소시킨다는 것을 보여줍니다(열처리된 폐의 EVLP 관류액에서 폰빌레브란트 인자 수치 감소로 예시됨). 형태학적 분석은 구조적 손상을 줄이고 조직 무결성을 보존하여 이 개입의 보호 효과를 더욱 뒷받침합니다. 대부분의 실험용 쥐 EVLP 데이터는 수컷에서 생성되어 성별에 대한 통찰력을 제한합니다. 두 연구에서는 여성에서 서로 다른 결과가 보고되었습니다 - 한 연구에서는 재관류 손상 감소, 다른 연구에서는 염증 증가48,49. 우리 연구는 수컷을 사용했지만 이전에 암컷을 사용한 돼지 EVLP 모델에서 TP 이점을 관찰했으며29 성별 간 관련성을 시사합니다.

우리 방법의 중요한 제약 조건과 단점을 강조할 필요가 있습니다. 첫째, 폐가 실제 원하는 온도로 관류되도록 하려면 온도 센서를 단단히 부착하여 유입 캐뉼라에서 후자를 모니터링해야 합니다. 둘째, 매우 짧은 시간 내에 온도 변화를 얻어야 하며, 이를 위해서는 가열을 위해 급속 반응 온천수조를 사용하고 급속 냉각을 위해 수조에 얼음을 추가해야 합니다. 셋째, 열 스트레스에 대한 생리적 반응은 사용되는 종에 따라 다를 수 있으며 스트레스의 수준과 기간에 따라 크게 달라집니다. 따라서 이 프로토콜이 다른 동물 종 또는 인간 폐에 적용되는 경우 다양한 기간 동안 다양한 가열 온도를 사용하여 파일럿 실험을 수행하고 적용된 열 스트레스의 보호 및 잠재적 해로운 영향과 관련된 특정 종점을 평가하는 것이 필수입니다. 넷째, 열 반응 유전자의 동역학적 발현으로 인해 열 전처리의 효과는 열 스트레스 적용 후 회복 시간에 따라 달라집니다. 이 주제에 대한 최근 간행물에서 볼 수 있듯이 열 적용의 시간 의존적 효과를 평가하려면 서로 다른 열 스트레스 지속 시간(즉, EVLP의 지속 기간이 다름)을 사용하는 실험이 필요합니다30.

전체적으로, 우리의 현재 연구는 한계 기증자 폐 품질을 개선하기 위한 실행 가능한 전략으로 열 전처리를 통합하는 상세하고 재현 가능한 쥐 EVLP 프로토콜을 확립합니다. 이 프로토콜은 확장 가능하고 더 큰 동물 또는 인간 EVLP 시스템에 적용할 수 있어 번역 관련성을 강화합니다. 방법론적 엄격함과 생리학적 충실도를 모두 제공함으로써 이 모델은 허혈-재관류 손상을 줄이고 이식 후 폐 이식 결과를 개선하기 위한 비약물적 개입을 탐색할 수 있는 새로운 길을 열어줍니다.

공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

스위스 국립 과학 재단(Nr 310030_212252)에서 TK 및 LL에 대한 보조금으로 지원됨).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
<스트롱>일반 장비
동맥류 클립 B. 브라운FE762K
공기/표면 비드 열 센서TES 일렉트로닉 코퍼레이션/디스트렐렉 AGTP01/176-67-162
둔한 견인기파인 사이언스 툴즈18200-09
불독 세라핀파인 사이언스 툴18051-50
시선 압축  프로메디컬25404
마취용 연결 키트휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-3076
면봉적용된 SA6001109
해부 가위B. 브라운 BC165R
쥐용 얼굴 마스크템 세가PFM0006
헤파린 5000 U/mLB. 브라운3522430
마취용 유도실휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기50-0116
홍채 박리, 완전 휘은 겸자를아스쿨라프그리고 nbsp; OC022R
이소플루란프로벳 AG2222
이소플루란 증기 19.3로타처 메디컬CV30-310 O<잠수함>2/항공
iSTAT4 카트리지액손 연구소 AG03P85-25
케타솔 100 (100 mg/mL)E. 그레이브 AG 박사QN01AX03
리스터 가위 B. 브라운BC876R
마이크로 가위, 곡선형 블런트/블런트아스쿨라프 FM011R
마이크로 애드손 겸자파인 사이언스 툴11018-12
마이크로 모기 지혈기파인 사이언스 툴13011-12
현미경 OPMI MDU자이스267067
NaCl 0.9%  B. 브라운534534
바늘 23G x 25mmBD 마이크로랜스 4300800
바늘 25G x 25mmBD 마이크로랜스 3300400
퍼파덱스(보존 솔루션)Xvivo 퍼플로우 AB19811
관류 주사기 60ml 루어 락BD 플라스틱300865
라소르아스쿨라프 GT-421
규모Mettler toledoPB602-L
실크 봉합 4-0B. 브라운F1134035
실크 봉합사 5-0B. 브라운F1134027
스틴 (관류 용액)Xvivo 퍼플로우 AB19004
수술용 장갑앤셀93-843
주사기 1 mL, 옴니픽스-FB. 브라운9161406V
테이프루코픽스02136-00
온도계TES 일렉트로닉 코퍼레이션1303
포르몰 바이오시스템즈 스위스 AG87-0960-00-10113
인공호흡기(EVLP) (EVLP 프로토콜에 따라 일조량 설정)플렉시번트FX3
인공호흡기(폐 조달)와 nbsp; (설정된 조석량: 7.69*(체중(kg)^1.04)휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기683
바이틀랜너 견인기B. 브라운BV073R
자일라솔 (1 mg/mL)E. 그레이브 AG 박사QN05CM92
야사르길 어플라이어B. 브라운FE502T
IPL-2 EVLP 시스템
양압 어댑터휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-3635
AME 14 - SC0062 펌프 튜빙 (타이곤) 3스톱 칼라, 12개씩 팩휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-0126
AME 24- SC0072 펌프 튜빙 (타이곤) 3스톱 칼라, 12개 팩휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-0155
고립 관류 폐 크기 2(IPL-2) 829/2형 기본 유닛휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-2266
섬유 산소 공급 장치 D150용 연결 키트휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-3765
EBM 부종 균형 모듈(EBM) 센서 포함휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-4626
섬유 산소 공급 장치 D150형, 5개 세트휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-3762
OP-테이블 5 사이즈용 대동맥 또는 기관 캐뉼라 클램프 홀더휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-3855
산소 공급 장치 홀더휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-3061
HSE 중량 측정 시스템휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-4604
HSE-BDAS 윈도우 2000, XP, 윈도우 7용 기본 데이터 수집 소프트웨어휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-1712
HSE-USB 데이터 수집 하드웨어, 윈도우 10 또는 11용 독립형 USB 박스휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-3330
ISM 827/230 V 롤러 펌프 레글로 아날로그, 4채널, 0.003-35 ml/min (2개)휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-0114
좌심방 캐뉼라 (DD 4.0 mm)휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-0712
1/16" 피팅이 장착된 미니 스루 산소 전극 (선택 사항)휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-4189
홀더에 장착된 D150형 섬유 산소 공급 장치 설치 키트휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-3759
9500형 일방향 스톱콕 (PA용, LA용)휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-0097
OPPM 플러그시스 산소 부분압 모듈 타입 697  (선택 사항)휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-0210
플러그시 기본 시스템 케이스 타입 603휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-0045
pO2 0 솔루션 20 mL 및 nbsp 패키지; (선택 사항)휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-3812
압력 트랜스듀서 P75 타입 379/HSE, 범위 -75에서 + 75 mm Hg (PA, LA)휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-0020
폐동맥 캐뉼라 (외경 2.0 mm, 머리 직경 2.5 mm)휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-0711
완충 용액용 저수지(재킷 처리)휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-3496
SCP 플러그시 서보 컨트롤러 704형 관류휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-2806
pO2 또는 pCO2 미니 센서 및 nbsp용 차폐 케이스; (선택 사항)휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-4196
단일 O2 또는 CO2 센서를 위한 소형 장착판   (선택 사항)휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-3000
TAM-A 플러그시 트랜스듀서 앰프 모듈 타입 705/1 (PA용, LA용 각각 하나)휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-0065
온도 조절기 순환기 E 103 (3L)휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-0125
3방향 스톱콕 타입 9560 R (PA용, LA용)휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-0096
유체 라인 차단 밸브가 있는 잭 버퍼 저장소용 튜브 설정휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-3456
인공호흡기 캐뉼라(기관) 외경 2.0mm, L 14mm휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기73-3384
컴퓨터 소프트웨어
HSE-BDAS 윈도우 2000, XP, 윈도우 7용 기본 데이터 수집 소프트웨어휴고 삭스 전자기기 - 하버드 기기V2.0
엑셀마이크로소프트2502, Microsoft 365
플렉시웨어시렉8
그래프패드 프리즘그래프패드 소프트웨어 주식회사10.0.1
스프래그-도울리 쥐 및 nbsp;샤를 리버 연구소(프랑스 생제르맹-뉘엘)와 nbsp;

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