방법 논문

조기 암 발견을 위한 맞춤형 단백질 코로나 프로파일링을 위한 표준화된 SDS-PAGE 워크플로우

1.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/69090

⸱

2025년 12월 19일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NanoDelivery Lab, Department of Molecular Medicine, Sapienza University of Rome

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 나노입자에 대한 맞춤형 단백질 코로나 프로파일링을 위한 SDS-PAGE 분석을 표준화하여, 암 특이적 신호의 재현 가능하고 확장 가능하며 저비용으로 검출할 수 있게 합니다. 췌장 관성 선암의 조기 진단을 위해 설계된 이 프로토콜은 연구 및 임상 환경 모두에서 복잡한 단백질체학적 방법에 대한 실용적이고 REASSURED에 맞춘 대안을 제공합니다.

초록

생물학적 체액에 노출된 나노입자(NP)에서 생성된 맞춤형 단백질 코로나(PC)는 조기 암 발견을 위한 유망하고 최소 침습적인 전략으로 떠올랐습니다. 본 연구는 견고성, 재현성 및 자동화를 보장하기 위해 최적화된 도데실 황산나트륨 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 이용한 단백질 코로나의 프로파일링 표준화 프로토콜을 도입합니다. 이 방법은 다양한 나노입자(NP) 플랫폼, 플라즈마 소스, 실험 조건에서 엄격히 검증되었으며, 연산자별 변동성이 최소화된 일관된 재현 가능한 프로파일을 입증했습니다. 기존 프로테오믹스 기법과 비교할 때, 이 접근법은 세계보건기구(WHO)의 진단 기준을 충족하는 더 빠르고 비용 효율적인 솔루션을 제공합니다. 초기 바이오마커가 제한적인 매우 공격적인 악성 종양인 췌장 관선암(PDAC)에 적용했을 때, 이 워크플로우는 초기 환자에서도 최대 90%의 분류 정확도를 달성했습니다. 이 표준화된 플랫폼은 암 검진을 위한 확장 가능하고 임상적으로 번역 가능하며 저렴한 진단 도구로의 중요한 진전을 의미합니다.

서론

나노입자 단백질 코로나 (NP-PC)

NP가 생물학적 체액에 노출된 후 표면에 형성되는 PC(PC)의 특성 분석은 질병 진단과 개인 맞춤 의학에 강력한 전략으로 부상했습니다. 이 흡착 단백질층은 역동적이고 질병 특이적 구성으로 NPs의 합성 정체성을 변화시키고 생물학적 상호작용을 촉진합니다2. PC 조성은 무작위가 아니며, NP의 물리화학적 특성과 도입된 생물학적 환경에 크게 의존합니다. NP 크기, 형태, 표면 전하, 조성 등의 요인은 흡착 단백질의 친화도, 반응학, 구조적 배열에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 마찬가지로, 생물학적 액체, 그 출처, 복잡성, 질병 상태가 코로나의 최종 구성에 중요한 역할을 합니다 4,5,6.

코로나의 역동적인 특성은 분석을 더욱 복잡하게 만드는데, 그 구조가 시간이 지남에 따라 부드럽고 느슨하게 결합된 외층에서 더 안정적이고 단단히 흡착된 내부 핵으로 진화하기 때문입니다 7,8. 경쟁 단백질 흡착 사건에서 비롯된 이러한 진화하는 구조는 의미있게 특성화되려면 시간 측정 및 표준화된 접근법이 필요합니다. 이러한 복잡성에도 불구하고, PC는 단순한 인공물이 아니라 비침습적으로 전신적인 질병 변화를 포착할 수 있는 생물학적으로 정보를 제공하는 층임이 널리 인식되고 있습니다. 이 논문에서 설명된 방법의 목표는 특히 액체 생검 접근법을 통한 조기 암 발견을 위해 개인화된 PC의 견고하고 재현 가능하며 접근 가능한 프로파일링을 위해 SDS-PAGE 사용을 표준화하는것입니다.

개인화된 PC와 암 발견에서의 관련성

이 방법의 과학적 근거는 개인화된 PC라는 개념에 있습니다. 환자 혈장과 함께 인큐베이팅된 NPs는 개인의 생리학적 또는 병리학적 상태를 반영하는 고유한 단백질 지문을 흡착합니다(11,12). 이 개념은 췌장관 선암(PDAC), 폐암13, 수막종14, 다형성 교모세포종15 등 질병이 존재할 때 PC 조성에 유의미한 변화가 있음을 보여주는 연구들에 의해 입증되었습니다. 특히 PDAC에서는 환자 혈장에서 추출한 PC가 건강한 기증자의 PC와 크게 다릅니다. 이러한 차이는 최대 90%의 진단 정확도를 달성하는 분류기 모델에서 활용되었습니다. 따라서 PC는 질병 특이적 신호의 나노스케일 집중기 역할을 합니다16.

최근 연구에 따르면 암 환자의 PC는 염증, 응고, 보체 활성화, 세포외 소포 수송에 관여하는 단백질이 풍부함을 보여준다는 것이 밝혀졌으며, 이 생물학적 경로들은 악성 종양에서 조절 장애가 있는 것으로알려져 있습니다. 이러한 단백질 패턴은 개별 환자 집단 내에서는 매우 재현성이 높지만, 질병 상태에 따라 명확히 구별되어, 코로나가 일반적인 질병 센서뿐만 아니라 질병 특이적 분류기로도 기능할 수 있음을 시사합니다. 가장 치명적이고 교묘한 악성 종양 중 하나인 PDAC의 맥락에서, 우리 그룹은 PC 특성화 18,19,20을 기반으로 한 NP 가능 혈액(NEB) 검사를 개척했습니다. 이 최소 침습 접근법은 NP가 저품도 및 질병 변형 혈장 단백질을 선택적으로 농축할 수 있는 능력을 활용하여 간단한 벤치 위 전기영동 분리를 통해 검출할 수 있게 합니다.

기존 단백질체 기법에 대한 장점

이 접근법을 개발한 이유는 질량분석(MS)과 같은 기존 단백질체학 기법의 한계에서 비롯됩니다. MS는 깊은 프로테옴 커버리지를 제공하지만 비용이 많이 들고 시간이 많이 들며, 고처리량 스크리닝이나 현장 진단에는 적합하지 않습니다21. 또 다른 주요 과제는 MS의 본질적 복잡성에 있습니다. 샘플 준비, 기기 교정, 획득 매개변수, 데이터 분석 워크플로우의 변동이 보고된 PC 조성에서 실험실 간 상당한 차이를 초래합니다22. 반면, PC에 대한 SDS-PAGE 분석은 질병 관련 단백질체 패턴을 빠르고 비용 효율적으로 포착할 수 있는 방법을 제공합니다. 중요한 점은, SDS-PAGE 판독은 개별 바이오마커의 절대적 식별에 의존하지 않고, 밀도계와 다변량 통계를 통해 분석할 수 있는 전 세계 단백질 프로필의 체계적 변화를 감지하는 데 의존한다는 점입니다.

알려진 표적에 한정되고 교차반응성이 강한 항체 기반 분석과 달리, SDS-PAGE는 단백질 환경을 편향 없이 바라보며 원본 샘플의 무결성을 보존하고 LC-MS/MS와 같은 상보적 플랫폼과의 후속 통합을 가능하게 합니다. 더불어 SDS-PAGE는 샘플 분획이나 고갈 단계가 필요하지 않기 때문에, 특히 저부피 생물 샘플 분석에 적합하며, 이는 취약한 개체군의 조기 진단 또는 선별에 필수적인 기능입니다23. 이 모든 이유로 이 프로토콜은 WHO가 보장하는 여러 기준(실시간 연결성, 샘플 채취 용이성, 저렴함, 민감성, 구체적, 사용자 친화적, 견고함, 장비 무첨가, 납품 가능함)과 일치하여 확장 가능한 진단을 위한 실용적인도구입니다. 이 증거를 바탕으로, NP가 환자 혈장과 함께 배양하면 SDS-PAGE를 사용해 체계적으로 프로파일링할 수 있는 재현 가능한 질병 특이적 PC를 흡수할 수 있다고 가설이 세워졌습니다. 또한 이러한 맞춤형 코로나의 표준화된 전기영동 분석이 암 환자와 건강한 개인을 구별하여 견고하고 임상적으로 번역 가능한 진단 도구를 제공할 수 있다고 제안합니다.

워크플로우 및 임상 적용 가능성

SDS-PAGE 기반 코로나 프로파일링 프로토콜은 NPs 제조 및 희석된 혈장과의 배큐, 코로나 분리, 겔 전기영동, 정량적 밀도 분석(그림 1)에 이르기까지 각 단계를 체계적으로 분류합니다. 배양 시간, 혈장 희석, NP 타입25 와 같은 주요 매개변수는 최적의 단백질 포획과 겔 이미지 해상도를 보장하기 위해 정밀하게 조정됩니다. 프로토콜은 샘플 처리량, 저장 안정성, 배치 간 일관성26과 같은 실질적인 문제도 해결합니다. 더불어, SDS-PAGE는 비파괴 기법이기 때문에 MS와 같은 보완적인 프로테오믹 접근법과 원활하게 결합되어 개별 단백질 밴드의 분자 구성을 식별할 수 있습니다15. 워크플로우는 수동 및 자동 피펫팅 플랫폼과의 호환성을 포함해 높은 운영자 간 재현성을 최적화했으며, 다양한 NP 화학물질과 혈장 농도에 걸쳐 견고합니다. 이러한 특징들은 이 방법이 다양한 실험실 환경에서 적용될 수 있도록 하여 중앙집중식 진단 허브와 분산형 연구소 모두에 적합하게 만듭니다. 따라서 이 기술은 초기 진단, 바이오마커 발견, 중개 나노의학에 참여하는 연구자와 임상의에게 특히 적합합니다. 이 방법은 다양한 병리에 적용 가능하며, 타액이나 소변을 포함한 혈장 외에도 다양한 생물학적 체액에 적응할 수 있습니다. 이 프로토콜의 유연성과 견고성은 임상 검증 파이프라인, 대규모 선별 검사 연구, 현장 진료 플랫폼에 통합하기에 강력한 후보입니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

이 프로토콜은 다양한 유형의 NP에서 형성된 PC(인간 혈장)와의 조제, 배양, 분리 및 분석을 위한 상세하고 표준화된 워크플로우를 제공합니다. 그림 2는 전체 프로토콜의 그래픽으로 표현되어 있으며, NP 합성부터 단백질 프로필의 다변량 SDS-PAGE 분석까지의 순차적 실험 단계를 설명합니다. 특히, 우리 연구팀은 이전 연구들18,26에서 입증한 바와 같이 방법론이 표준화되어 결과의 재현성과 신뢰성을 보장합니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. NP의 준비 및 특성 분석

  1. GO 나노시트
    1. 4 mg/mL 정액을 초순수수에 희석하여 원하는 농도로 만듭니다. 적절한 분산을 위해 28% 진폭(펄스: 0.8/0.6초)으로 2분간 초음파 검사를 하세요.
    2. UV-Vis 분광법을 이용한 농도 정량화
    3. 633 nm He-Ne 레이저를 이용해 동적 광산란(DLS)을 통해 유체역학적 크기와 제타 전위를 측정합니다. 큐벳 검출 한계에 따라 초순수수에서 희석하여 샘플을 준비합니다(예: 1 mL 큐벳에 대해 1:100 희석). 세 번의 복제에서 표준편차(SD)± 평균 기록하세요.
  2. 골드 NP
    1. 시트레이트 안정화 100 nm 금 NP(재고 농도: 3.8E+9 입자/mL)를 추가 변형 없이 사용하세요.
    2. 633 nm He-Ne 레이저를 이용해 동적 광산란(DLS)을 통해 유체역학적 크기와 제타 전위를 측정합니다. 큐벳 검출 한계에 따라 초순수수에서 희석하여 샘플을 준비합니다(예: 1 mL 큐벳에 대해 1:100 희석). 세 번의 복제에서 평균 ± SD를 기록하세요.
  3. 도탭 리포좀
    1. 1,2-디올레올-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP) 분말을 인증된 화학 연기 후드 내에서 적절한 개인 보호 장비(실험복, 장갑, 고글)를 착용한 채 클로로포름에 녹입니다. 진공 상태에서 2시간 증발시키고, 지질 막을 초순수수로 재현탁하여 최종 농도인 1 mg/mL에 도달한 후 4 °C에서 하룻밤 수화합니다. 마지막으로, 리포좀 용액을 0.1 μm 폴리카보네이트 필터를 통해 20회 압출합니다.
    2. 633 nm He-Ne 레이저를 이용해 동적 광산란(DLS)을 통해 유체역학적 크기와 제타 전위를 측정합니다. 큐벳 검출 한계에 따라 초순수수에서 희석하여 샘플을 준비합니다(예: 1 mL 큐벳에 대해 1:100 희석). 세 번의 복제에서 평균 ± SD를 기록하세요.
      주의: 클로로포름은 완전한 개인 보호 장비(PPE)와 함께 연기 후드에서 다룰 때. 유기 용매 폐기물은 기관의 화학 안전 절차에 따라 처리됩니다.
      참고: 크기 분포가 약 300 nm 중심인 GO의 경우, 125 W에서 10분간 초음파 세척, 4 °C에서 7,700 x g 에서 30분간 원심분리, 상청액 수집, 다시 18,620 x g 원심분리기 30분간 피상액 추출, 그리고 펠릿을 재현탁합니다. 크기 분포가 대략 100 nm 중심인 GO의 경우, 4 °C에서 3 × 180분 초음파 처리, 10,000 x g 에서 30분간 원심분리, 각 라운드 후 4 °C에서 원심분리하여 최종 상원액을 수집합니다.

2. 인간 혈장 준비

  1. 상업용 인간 혈장(HP)
    1. 필요 시 상업용 동전 건조 혈장을 초순수수와 희석하세요.
    2. 재구성된 혈장을 18620 x g 온도에서 4 °C에서 15분간 원심분리하고, 상청액을 수집하여 -80 °C에서 보관하여 사용 후까지 보관합니다.
  2. 환자 유래 HP
    1. 1216 x g 에서 4 °C에서 10분간 원심분리 혈액 샘플을 채취한 후 상원액을 채취하여 혈장 분리를 합니다.
    2. 450 μL 혈장 샘플을 0.5 mL 단백질 저결합 튜브에 담아 -80 °C에서 보관하다가 사용하세요.
      참고: 모든 인간 혈장 샘플은 기관 윤리 지침에 따라 수집되었으며, 모든 참가자로부터 사전 동의를 받았습니다.
      주의: 인간 혈장은 생물학적 위험이 있습니다. 장갑, 실험복, 보호 안경을 착용해 생물안전 캐비닛(BSC) 안에서 손잡이를 하세요. 모든 혈장 함유 물질은 기관 생물안전 및 폐기물 처리 규정에 따라 폐기됩니다.

3. PC 결성

  1. 수동 액체 취급
    1. 혈장 희석을 조절하기 위해 비신코닉산(BCA) 분석 법을 통해 단백질 농도를 정량화하여 최적의 NP: 혈장 비율을 결정합니다.
    2. 원하는 혈장 농도에 100 μL NP 현탁액을 100 μL 플라즈마에 첨가합니다.
    3. 37°C에서 1시간 배양하세요.
      참고: BCA 분석의 경우, 시약 A와 B를 50:1로 혼합하고, BSA 표준 희석액을 준비한 후 10-25 μL 샘플/표준 시료 + 200 μL 시약을 추가하고, 37 °C에서 30분간 배양하고, 562 nm에서 흡광도를 측정합니다. 플라즈마 농도는 일반적으로 NP 부피에 따라 0.5%에서 50% v/v 사이로 조정되며, 이는 NP 종류에 따라 다릅니다. GO는 권장 농도가 0.5%에서 5%로 낮아지며; DOTAP/골드 NP는 더 높은 농도(최대 50%)를 사용하세요. 단백질 1.5mL 저결합 튜브를 사용하세요.
  2. 자동 인큐베이션 프로토콜
    1. 액체 취급 소프트웨어 프로토콜을 자동 피펫팅 플랫폼(20 μL + 200 μL 헤드)에 로드합니다.
    2. 각 NP 타입 100 μL을 저결합 1.5 mL 튜브에 투여합니다.
    3. 2.1과 2.2에 따라 다음 공식에 따라 재구성된 플라즈마를 추가한다:
      여기서 VNP는 NP 현탁 부피입니다. 100 μL NP에 대해:
      figure-protocol-1
      5%: 5.3 μL HP
      20%: 25 μL HP
      50%: 100 μL HP
    4. 초순수도를 200 μL에 도달시키기 위해 추가:
      5%: 94.7 μL
      20%: 75 μL
      50%: 없음
    5. 믹스 샘플:
      5%: 15 μL 사이클
      20%: 50 μL 사이클
      50%: 100 μL 사이클 3.2.6. 37°C에서 1시간 동안 배양하세요
      참고: 보조 그림 1 은 세 가지 최종 플라즈마 농도(5%, 20%, 50% v/v)에서 NP-HP 혼합물을 준비하는 데 사용되는 자동 설정의 그래픽 인터페이스를 보여줍니다. 각 농도는 3배로 구성되어 있습니다. 데크 구조에는 팁 랙, 폐수 저장소, 그리고 NP 서스펜션(GO, 금 나노스피어, DOTAP 리포좀, NP), HP, 초순수수(H2O)가 들어 있는 3× 4개의 저결합 튜브 랙이 포함되어 있습니다. 단백질 저결합 튜브를 사용하세요.

4. SDS-PAGE를 이용한 PC 분석

  1. PC 격리
    1. NP-HP 샘플을 18,620 x g, 4 °C에서 15분간 원심분리합니다. 튜브 바닥에는 눈에 띄는 펠릿이 있어야 합니다. 상정액은 투명해 보이면 조심스럽게 버려야 진행합니다( 보완 그림 2 참조).
    2. 펠릿을 200 μL 초순수수로 세척한 후 다시 현탁한 후 다시 원심분리합니다. 이 단계를 두 번 반복하세요. 최종 세척 후에도 콤팩트 펠릿이 여전히 보여야 하며, 이는 NP-단백질 복합체의 성공적인 분리를 확인시켜줍니다( 보충 그림 2 참조).
    3. 준비 하중 버퍼(LB):
    4. 혈장 상태와 혼합 환원제(1:10), SDS 샘플 완충 변성 단백질(1:2), 물을 기준으로 총 LB 부피를 계산합니다.
    5. 펠릿을 적절한 용량의 1x LB에 재현탁하고 100°C에서 10분간 끓입니다.
    6. 원심분리기는 18,620 x g, 4 °C에서 15분간 가열합니다. 상정액을 채취하세요.
  2. SDS-PAGE 샘플 로딩
    1. 사다리는 몰 중량(MW) 표준과 하중 완충제를 희석하여 준비합니다.
    2. Tris/Glycine/SDS 런닝 버퍼 10배를 희석해 1배로 만듭니다.
    3. 전기영동 챔버에 4%-20% 얼룩 없는 그라디언트 젤을 조립하고, 제조사가 권장하는 수준에 도달할 때까지 러닝 버퍼를 추가하세요.
    4. 각 웰에 10 μL 샘플과 7 μL 사다리를 적재합니다. 젤을 150V로 실온에서 ~90분 동안 돌리세요.
      참고: LB의 부피는 겔 이미지에서 최적의 단백질 시각화를 위해 3.1.1에서 선택한 혈장 농도를 기준으로 계산해야 합니다(일반적으로 20 μL LB에 10 μg 단백질).
      주의: 최적의 재현성을 위해 신선하게 준비된 NP-플라즈마 샘플을 사용하여 SDS-PAGE 분석을 수행하십시오. 세척된 펠릿을 -80°C에서 24시간 보관하면, 재현탁 및 DLS/제타 전위 측정 후) 및 단백질 코로나 지문(프로토콜 4.3.1 단계부터 처리 시; 보충 그림 3 참조) 모두에서 감지 가능한 변화가 발생했습니다.

5. 단백질 패턴 분석

  1. 이미지 처리
    1. 화학 발광 이미저를 이용한 이미지 겔.
    2. 겔 이미지를 다음과 같이 처리합니다:
      1. 젤 이미지를 가져오고 TIFF 파일로 저장한 뒤, 특히 주변 레인에 영향을 주는 비스듬한 레인 왜곡 같은 원치 않는 효과를 교정하세요. 모든 젤 레인을 감지하세요. 이미지에서 배경 신호를 빼세요.
      2. 마커 레인의 이중 항 지수 적합을 기반으로 픽셀 단위를 분자량 단위로 변환하여 수직 변위를 보정합니다. 강도 프로필과 레인별 신호 분포를 시각화할 수 있는 그래픽 출력을 생성하세요.
    3. 처리된 데이터, 즉 계산된 1차원 프로파일을 내보내세요.
    4. 프로파일을 정규화하여 분자량 분포를 계산하고, 각 레인에 대해 원하는 MW 범위에 걸친 정수 면적을 계산합니다.
    5. 출력 데이터, 즉 지정된 분자량 범위 내의 정분면을 내보내세요.
  2. 진단을 위한 다변량 분석
    1. 분류 분석에는 선형 판별 분석(LDA) 또는 기타 다변량 방법을 적용하세요.
    2. 정확도, 민감도, 특이도를 계산하고 ROC 분석을 수행합니다.
      참고: 이미지 처리, 프로파일 정규화, 적합 및 분류에 사용되는 스크립트는27번부터 제공되며, 해당 사용자 매뉴얼도 함께 제공됩니다.
      주의: 인간 혈장을 다룰 때는 생물안전 프로토콜을 준수하세요.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

PC 실험 표준화의 주요 과제 중 하나는 기술적 및 운영자별 변동성을 최소화하는 것으로, 이 연구에서 앞서 강조한 내용입니다26. 운영자 편향과 자동화 도구가 재현성에 미치는 영향과 같은 실험 변수의 영향에 관한 미해결 질문이 여전히 남아 있습니다18,28.

첫째, 본 연구는 제안된 프로토콜의 견고성과 재현성에 대한 체계적인 평가를 제시합니다. 이 연구의 목적은 두 가지였습니다: (i) 수동 또는 자동 피펫팅 시스템을 사용하여 다양한 운영자가 얻은 SDS-PAGE 프로필의 일관성을 평가하는 것, (ii) 프로토콜이 서로 다른 NP 화학과 바이오유체 조건 전반...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

NP 유형 간 방법의 다양성과 재현성

여기서 제시된 프로토콜은 HP와 함유한 NP에서 형성된 PC를 격리하고 특성화하기 위한 표준화되고 재현 가능한 워크플로우를 제공합니다. 이전 및 현재 연구(33)에서 입증된 바와 같이, 이 방법은 개인화된 PC의 생물학적·진단적으로 중요한 특징을 포착하는 SDS-PAGE 기반 분자 지문을 생성할 수 있게 합니다. 수동 및 자동화 워크플로우 전반에 걸쳐 관찰된 일관성은 PC 연구의 핵심 과제인 기술적 및 운영자 의존적 변동성 최소화를 해결합니다. Giulimondi 등(26)이 강조한 바와 같이, 운영자 편향과 워크플로우의 이질성은 역사적으로 표준화를 방해해 왔습니다. 연구 결과는 통제된 조건 하에서 이러한 변수들을 데이터 품질을 해치지 않고 효과적으로 완화할 수 있음을...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자들은 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 유럽연합-차세대EU(NextGenerationEU)의 자금 지원을 받아 MUR(NRRP 보완 투자 국가 계획)의 "D3 4 HEALTH-지속 가능한 의료를 위한 디지털 기반 진단, 예후, 치료제"의 지원을 받아 일부 자금을 지원받았습니다. PNC0000001, 스포크 3 리네아 테마티카 2, 미션 4, 컴포넌트 2 컵: B53C22006120001. 이 작업은 또한 AIRC 재단의 IG 2020-ID. 24521 프로젝트 하에 P.I. 포치 다니엘라의 지원을 받았습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5ML 단백질 로바인드 튜브에펜도르프22431081
10배 트리스/글리신/SDS바이오라드1610732
원심분리기노동기술자Z 216 MK 헤름18,620 RCF에서 4 & 도에서 20분간 사용; C
케미닥 영상 시스템바이오-래드12003153젤 이미지 획득에 사용됨
클로로포름시그마 올드리치C2432-1LDOTAP용 용매
코닝 1-200 및 마이크로; L 유니버설 핏 벌크 팩드 피펫 팁코닝4845
크라이테리언 TGX 얼룩 없는 프리캐스트 젤바이오라드5678095
증류수 6 x 1L서모피셔15230001
도탭 (1,2-디올레올-3-트리메틸암모늄-프로판)아반티 극지 지질890890P-200mg양이온성 리포좀 제조에 사용되었으며; 클로로포름에 용해되어 증발, 수화, 압출
엔듀로 300V 전원 공급 장치와 nbsp;Labnet E0303-230V
글로맥스 디스커버 마이크로플레이트 리더프로메가GM3000
금 나노입자 (시트레이트 안정화)시그마-올드리치742031-25ML나노소재로 사용; 추가 정제 없이 사용
그라데이언트 폴리아크릴아마이드 젤 (4– 20% TGX)바이오-래드5678095SDS&ndash에 사용; 페이지
그랜트 악기   열셰이커 HC24N (24 x 1.5mL 마이크로튜브)피셔 사이언티픽PHMT-PSC24N
그래핀 옥사이드(GO) 용액그래페네아고-4-1000나노소재로 사용; 0.25 mg/mL로 희석하고 초음파 검사를 했습니다
인간 혈장(HP)시그마-올드리치P9523-5ML나노입자 배양에 사용
이미지랩 소프트웨어바이오-라드. 버전 6.1.0.07/젤 이미지를 tiff 파일로 내보낼 때 사용됩니다
Laemmli 로딩 버퍼 2x바이오라드1610737펠릿 재현탁에 사용됩니다
MATLABMathWorks. 버전 R2022a/이미지 처리, 데이터 분석 및 프로파일 계산에 사용됩니다
미니 익스트루더아반티 극지 지질610020리포좀 준비에 사용됨
NuPAGE 샘플 감소제 (10배)써모 사이언티픽NP004
인산염 염수 완충제코닝 21-031cmDOTAP-HP 샘플에 사용
피어스 BCA 단백질 분석 키트, 1개 키트 (1L)서모피셔23225
피펫 팁 0.5-10ul 투명악시겐T-300-STK
PIPETMAN L P10L, 0.5-10 및 마이크로; L, 금속 배출기길슨FA10002M
PIPETMAN P20, 2-20 및 마이크로; L, 금속 배출기길슨F144056M
PIPETMAN P200, 20-200 및 마이크로; L, 금속 배출기길슨F144058M
PIPETMAX 자동 피펫팅 시스템길슨GSYS0021자동 샘플 취급에 사용
폴리카보네이트 필터 (0.1 & 마이크로; m)아반티 극지 지질610005-1EA리포좀 압출에 사용
프리시전 플러스 프로틴 올 블루 프리스테인 단백질 기준바이오라드1610373
프리시전 플러스 단백질 무염색 기준  바이오라드1610363EDU
비브라 셀 소닉 케이터 VC505소닉스 앤 머티리얼즈 주식회사VC505
제타사이저말번ZS90동적 광산란(DLS) 및 미세전기영동(ME) 측정에 사용됩니다

참고문헌

  1. Cai, R., Chen, C. The crown and the scepter: Roles of the protein corona in nanomedicine. Adv Mater. 31 (45), 1805740(2019).
  2. Caputo, D., et al. Nanotechnology meets oncology: A perspective on the role of the personalized nanoparticle-protein corona in the development of technologies for pancreatic cancer detection. Int J Mol Sci. 23 (18), 10591(2022).
  3. Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: A test study. ACS Nano. 5 (9), 7503-7509 (2011).
  4. Hajipour, M. J., et al. Personalized protein coronas: A "key" factor at the nanobiointerface. Biomater Sci. 2 (9), 1210-1221 (2014).
  5. Quagliarini, E., et al. Protein corona-enabled serological tests for early-stage cancer detection. Sens Int. 1, 100025(2020).
  6. Caracciolo, G., et al. Size and charge of nanoparticles following incubation with human plasma of healthy and pancreatic cancer patients. Colloids Surf B Biointerfaces. 123, 673-678 (2014).
  7. Barrán-Berdón, A. L., et al. Time evolution of nanoparticle-protein corona in human plasma: Relevance for targeted drug delivery. Langmuir. 29 (21), 6485-6494 (2013).
  8. Yu, Y., Luan, Y., Dai, W. Dynamic process, mechanisms, influencing factors, and study methods of protein corona formation. Int J Biol Macromol. 205, 731-739 (2022).
  9. Hadjidemetriou, M., Kostarelos, K. Evolution of the nanoparticle corona. Nat Nanotechnol. 12 (4), 288-290 (2017).
  10. Caputo, D., et al. A protein corona-enabled blood test for early cancer detection. Nanoscale. 9 (1), 349-354 (2017).
  11. Pozzi, D., Caracciolo, G. Exploiting differences in personal nanoparticle corona profiles for cancer diagnostics. , Taylor & Francis. 431-433 (2025).
  12. Vence, M. G., et al. Potential clinical applications of the personalized, disease-specific protein corona on nanoparticles. Clin Chim Acta. 501, 102-111 (2020).
  13. Di Domenico, M., et al. Nanoparticle-biomolecular corona: A new approach for the early detection of non-small-cell lung cancer. J Cell Physiol. 234 (6), 9378-9386 (2019).
  14. Papi, M., et al. Exploitation of nanoparticle-protein interactions for early disease detection. Appl Phys Lett. 114 (16), 163702(2019).
  15. Di Santo, R., et al. Protein corona profile of graphene oxide allows detection of glioblastoma multiforme using a simple one-dimensional gel electrophoresis technique: A proof-of-concept study. Biomater Sci. 9 (13), 4671-4678 (2021).
  16. Caputo, D., et al. Synergistic analysis of protein corona and haemoglobin levels detects pancreatic cancer. Cancers. 13 (1), 93(2020).
  17. Colapicchioni, V., et al. Personalized liposome-protein corona in the blood of breast, gastric and pancreatic cancer patients. Int J Biochem Cell Biol. 75, 180-187 (2016).
  18. Di Santo, R., et al. Personalized graphene oxide-protein corona in the human plasma of pancreatic cancer patients. Front Bioeng Biotechnol. 8, 491(2020).
  19. Digiacomo, L., et al. Efficient pancreatic cancer detection through personalized protein corona of gold nanoparticles. Biointerphases. 16 (1), 011010(2021).
  20. Caputo, D., Caracciolo, G. Nanoparticle-enabled blood tests for early detection of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Lett. 470, 191-196 (2020).
  21. Caracciolo, G., et al. Challenges in molecular diagnostic research in cancer nanotechnology. Nano Today. 27, 6-10 (2019).
  22. Ashkarran, A. A., et al. Measurements of heterogeneity in proteomics analysis of the nanoparticle protein corona across core facilities. Nat Commun. 13 (1), 6610(2022).
  23. Pederzoli, F., et al. Protein corona and nanoparticles: How can we investigate on. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 9 (6), e1467(2017).
  24. Otoo, J. A., Schlappi, T. S. REASSURED multiplex diagnostics: A critical review and forecast. Biosensors. 12 (2), 124(2022).
  25. Papi, M., Caracciolo, G. Principal component analysis of personalized biomolecular corona data for early disease detection. Nano Today. 21, 14-17 (2018).
  26. Giulimondi, F., et al. Reproducibility of biomolecular corona experiments: A primer for reliable results. Part Part Syst Charact. 40 (2), 2200169(2023).
  27. Renzi, S., et al. Structuring lipid nanoparticles, DNA, and protein corona into stealth bionanoarchitectures for in vivo gene delivery. Nat Commun. 15 (1), 9119(2024).
  28. Van Dorpe, S., et al. Integrating automated liquid handling in the separation workflow of extracellular vesicles enhances specificity and reproducibility. J Nanobiotechnology. 21 (1), 157(2023).
  29. Quagliarini, E., et al. The influence of protein corona on graphene oxide: Implications for biomedical theranostics. J Nanobiotechnology. 21 (1), 267(2023).
  30. Jiříčková, A., et al. Synthesis and applications of graphene oxide. Materials. 15 (3), 920(2022).
  31. Saorin, A., et al. A redefined protocol for protein corona analysis on graphene oxide. ACS Nanosci Au. , (2025).
  32. Digiacomo, L., et al. Nanoparticle-protein corona enhances accuracy of Ca-19.9-based pancreatic cancer classification. Nanoscale. 17 (12), 7066-7075 (2025).
  33. Caputo, D., et al. Improving the accuracy of pancreatic cancer clinical staging by exploitation of nanoparticle-blood interactions: A pilot study. Pancreatology. 18 (6), 661-665 (2018).
  34. Quagliarini, E., et al. A decade of the liposome-protein corona: Lessons learned and future breakthroughs in theranostics. Nano Today. 47, 101657(2022).
  35. Wu, S. Y., An, S. S. A., Hulme, J. Current applications of graphene oxide in nanomedicine. Int J Nanomedicine. 10 Suppl 1, 9-24 (2015).
  36. Caputo, D., et al. Multiplexed detection of pancreatic cancer by combining a nanoparticle-enabled blood test and plasma levels of acute-phase proteins. Cancers. 14 (19), 4658(2022).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

BCA

관련 논문