방법 논문

시험 관 내 키메라 항원 수용체 T 세포 선별을 위한 환자 유도 3차원 종양 오가노이드 모델

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DOI:

10.3791/69113

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2025년 12월 30일

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1Department of Oncology, Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital, 2Department of Pharmacology, Joint Laboratory of Guangdong-Hong Kong Universities for Vascular Homeostasis and Diseases, School of Medicine, Southern University of Science and Technology, 3Department of Digestive Disease, Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital, 4Department of Human Cell Biology and Genetics, School of Medicine, Southern University of Science and Technology, 5Department of Surgical Endoscopy, Shenzhen People's Hospital (The First Affiliated Hospital, Southern University of Science and Technology; The Second Clinical Medical College, Jinan University), 6Department of Medicine and Therapeutics, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 7Institute of Digestive Disease, State Key Laboratory of Digestive Disease, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 환자 유래 종양 오르가노이드와 키메라 항원 수용체 T(CAR-T) 세포를 사용하여 CAR-T 세포의 고형 종양 세포에 대한 특이적 세포독성 활성을 평가하는 시험관 내 공동 배양 모델을 구축합니다.

초록

키메라 항원 수용체 T(CAR-T) 세포 치료는 혈액학적 악성 종양에서 흥미로운 임상 효과를 달성했으나, 고형종양에 대한 CAR-T 세포 치료는 아직 추가 개발이 필요합니다. 환자 유래 종양 오가노이드는 환자의 이질성을 유지하는 시험관 내 질환 모델로, 화학요법과 표적 약물의 효능과 안전성을 시험하는 데 사용되어 왔습니다. 이 방법은 종양 오가노이드를 CAR-T 세포와 공동 배양하는 시험 관 내 효능 시험 모델을 설명합니다. 환자의 대장암 샘플은 기저막 매트릭스 내에서 3차원(3D) 구조의 종양 오가노이드로 구성됩니다. 종양 오가노이드는 안정적으로 성장하며 지속적으로 통과할 수 있습니다. 성숙한 종양 오가노이드는 세척과 원심분리로 기질에서 분리되며, CAR-T 세포는 서로 다른 효과자-표적(E:T) 비율로 첨가되어 면역-오르가노이드 공동 배양 시스템을 형성합니다. 6-24시간 후에는 밝은 시야 영상을 통해 오가노이드의 형태와 세포 간 구조를 관찰합니다. 이 실험은 추가로 공동 배양 시스템에서 죽은 세포 염색을 수행하여 오가노이드의 생존 가능성을 반영하고 CAR-T 세포가 종양 오가노이드에 미치는 세포독성 효과를 평가할 수 있습니다. 이 실험은 CAR-T 세포와 3D 종양 오가노이드 간의 상호작용을 효과적으로 관찰할 수 있으며, 그 결과는 CAR-T 세포의 종양 파괴 활성을 평가하는 데 활용될 수 있습니다.

서론

키메라 항원 수용체 T(CAR-T) 세포 치료는 혈액 악성 종양 치료에서 놀라운 임상적 성공을 보였습니다1. 그러나 종양 이질성과 항원 손실, 종양 덩어리 내의 물리적 및 화학적 장벽, 면역억제 종양 미세환경 등 여러 주요 장애물로 인해 고형 종양에서의 적용은 제한적입니다 2,3. 이러한 문제들은 고형 종양 환경에서 CAR-T 세포 치료의 제한된 효과에 기여합니다.

CAR-T 세포 효능의 시험관 내 평가는 전임상 개발 과정에서 매우 중요한 단계입니다. 가장 흔히 사용되는 모델은 종양 세포주로, 특정 종양 관련 항원을 발현하거나 루시페라제 4,5와 같은 리포터 유전자를 운반하도록 조작될 수 있습니다. 따라서 기존의 세포주 기반 검사 결과는 임상 결과를 예측하지 못하는 경우가 많습니다. 환자 유도 종양 모델은 고형 종양 맥락에서 CAR-T 기능을 보다 정확하게 평가할 수 있는 유망한 대안을 제공합니다.

여러 연구가 CAR-T 세포 평가를 위해 PDTO를 활용하기 시작했지만, 3D 종양 구조 보존과 효율적인 면역 세포-종양 세포 상호작용을 효과적으로 균형 있게 조절하는 표준화되고 견고하며 접근 가능한 공동 배양 프로토콜을 구축하는 데는 여전히 도전 과제가 남아 있습니다. 환자 유래 종양 오가노이드(PDTO)는 환자의 종양 조직이나 세포로부터 생성된 3차원(3D) 체외 질환 모델입니다. PDTO는 대장암, 유방암, 췌장암, 폐암 등 다양한 종양 유형에 대해 성공적으로 입증되었습니다. 이 구조들은 원래 종양의 조직학적 구조, 분자 프로필, 기능적 이질성을 유지합니다. 원발성 종양 세포 및 환자 유래 이종이식(PDX)과 함께, PDTO는 환자별 질병 특징을 모델링하는 데 유용한 플랫폼입니다7. 기존의 종양 세포주나 1차 배양과 비교할 때, PDTO는 생체 내 종양 환경을 더 가깝게 재현하며, 복잡한 세포 구성과 구조 조직을 보입니다8. 또한 유전체 안정성을 유지하고 유전자 발현 패턴을 장기간 동안 보존하여 치료 반응을 보다 정확하게 평가할 수 있게 합니다 9,10. PDTO는 종양 생물학, 약물 스크리닝, 정밀 의학 연구에 성공적으로 사용되었으며, 새로운 CAR 표적 식별, CAR 설계 최적화, 세포독성 평가 등 면역치료 검사에서의 유용성으로 점점 더 인정받고 있습니다.. 오가노이드 배양의 일반적인 한계는 3D 구조 유지를 위해 마트리젤(이하 기저막 기질 [BMM])과 같은 세포외기질(ECM) 성분에 의존한다는 점으로, 이는 공동 배양 분석에서 면역 세포 침윤을 방해할 수 있습니다. 공동 배양에서 일관성과 최적의 세포 상호작용을 보장하기 위해, 일반적으로 정의된 크기 범위(예: 직경 100-200 μm) 내의 오가노이드가 선택됩니다.

이 프로토콜은 대장암 유래 PDTO를 이용한 CAR-T 세포 세포독성을 평가하는 공동 배양 플랫폼을 설명합니다. 환자 종양 샘플은 효소적으로 해리되어 BMM에서 배양되어 3D 오가노이드를 생성합니다. 성숙하고 확장된 후에는 균일한 크기의 오가노이드를 분리하여 형광 표지합니다. 이들은 다중 웰 플레이트에 시딩되어 CAR-T 세포와 다양한 이펙터-표적(E:T) 비율로 공동 배양됩니다. 이 접근법의 핵심 특징은 공동 배양 전에 BMM에서 PDTO를 의도적으로 제거하여, CAR-T 세포가 종양 오가노이드에 직접 및 방해받지 않고 접근할 수 있으면서도 현탁 상태에서 3D 무결성을 유지할 수 있게 한다는 점입니다. 24시간 후 밝방야 현미경 검사에서 진행성 PDTO 붕괴가 드러나며, 이는 3D 형태의 교란, 종양 세포의 축소, 생존력 상실이 특징입니다. 생세포 영상 및 형광 현미경은 형광 표지된 CAR-T 세포와 종양 표적 간의 상호작용을 추가로 시각화합니다. 정량적 세포사멸 분석법이 세포독성을 평가하는 데 사용됩니다. 이 오가노이드 기반 면역 공동 배양은 CAR-T 세포의 항종양 효능을 체 외에서 평가할 수 있는 견고하고 환자 특이적인 플랫폼을 제공하여 치료 최적화와 임상 번역 지원을 가능하게 합니다.

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프로토콜

대장암 환자 유래 오가노이드가 사용되었습니다. 종양 조직 조직은 조직학적으로 확진된 원발성 대장암(CRC) 환자로부터 치료받지 않은 환자들로부터 채취하였습니다. 모든 조직은 선전 천하이 사커우 자유무역지대 병원에서 표준 진단 절차 중 채취된 내시경 생검 표본에서 채취하였습니다. 모든 기증 조직은 기관 병리학자들의 조직병리학적 검사를 통해 CRC로 확인되었습니다. 프로토콜은 기관 지침을 따릅니다. 모든 환자로부터 서면 동의서를 받았습니다. 이 연구는 선전 천하이 석구자유무역지대 병원 윤리위원회(2024KY-009-01K)의 승인을 받았습니다.

1. PDTO 문화

  1. 조직 준비
    1. 조직학적으로 확진된 원발성 대장암(CRC) 환자로부터 대장내시경 생검을 통해 얻은 종양 조직 조각을 멸균된 50mL 튜브에 삽입합니다.
    2. 행크스 밸런스 소금 용액(HBSS), 1% 소 혈청 알부민(BSA), 100 U/mL 페니실린, 0.1 mg/mL 스트렙토마이신, 50 μg/mL 겐타미신, 5 μg/mL 암포테리신 B, 10 μM 로 관련 키나제 억제제(Y-27632)로 구성된 냉간 조직 세척액 30 mL를 추가합니다.
    3. 튜브를 얼음 위에 올려놓고 5분간 부드럽게 흔들어 조직을 씻어내세요.
    4. 1.1.3 단계를 반복합니다. 새 휴지 세척액으로 두 번 더 사용했습니다.
  2. 조직 소화
    1. 괴사나 지방 조직을 잘라내고 종양을 조직 조각으로 절단하세요.
    2. 소화 배지 8mL(DMEM 배지, 500 U/mL 콜라게나제 IV, 1.5 mg/mL 콜라겐제 II, 20 μg/mL 히알루론다제, 0.1 mg/mL 분산 유형 II, 10 μM Y-27632, 1% 태아 소 혈청)을 37 °C까지 가열합니다.
    3. 조각을 소화 완충제로 옮기고 37°C에서 수욕에서 배양합니다. 효소가 침투하기 쉽게 5분마다 ~10초간 손으로 부드럽게 돌리세요.
      참고: 조직 블록 크기에 따라 소화 완충 부피를 조절하세요. 일반적으로 내시경 생검 크기에는 8-10mL가 충분합니다.
    4. 15분 후 해리 상태를 현미경으로 관찰하세요. 조직 조각이 남아 있으면 최대 30분까지 소화를 계속하세요.
    5. 클러스터가 보이면 10mL 피펫을 사용해 기계적으로 해리하기 위해 부드럽게(5-10회) 피펫을 사용하세요. 350 × g 에서 원심분리기를 5분간 사용했습니다.
    6. 상원액 버리기; 펠릿을 세척액 10mL에 재현탁한 후 350 × g 에서 원심분리하여 5분간 보관합니다. 세탁을 두 번 반복하세요.
      참고: PDTO는 일반적으로 배양 후 3-5일 이내에 조밀한 구형 구조를 형성하기 시작했습니다. 오르가노이드는 견고한 증식을 보였고, 10일째에서 14일째에는 실험에 적합한 크기(직경 약 100-200 μm)에 도달했습니다. 배출은 건강한 성장을 유지하고 과도한 합류 또는 중추 괴사를 방지하기 위해 7-10일마다 시행되었습니다. 일반적으로 생검당 8-10 mL 소화 완충제(2 mm³ 조각)를 사용하여 TrypLE 발현을 1× 최종 작동 농도로 유지합니다.

2. PDTO의 건설

  1. 행렬 임베딩
    1. 200 μL BMM(4 °C에서 미리 냉각된 상태)을 깨끗한 튜브에 넣고, 미리 냉각된 피펫 팁을 사용해 셀 펠릿을 최소 10-15번 위아래로 움직이며 현탁액이 균일하고 덩어리가 보이지 않을 때까지 반복합니다.
    2. 24웰 플레이트의 각 웰에 약 30μL 방울을 분사합니다. 37°C에서 10분간 배양하여 굳어버립니다.
    3. 500 μL 오가노이드 배양 배양지(고급 DMEM/F12 배양지, 50 μg/mL R-스폰딘 1, 10 μg/mL 노긴, 500 μg/mL EGF, 100x HEPES, 100x 글루타맥스, 500x 노르모신, 500x 겐타미신/암포테리신 B, 50x N2, 100x B27, 500 mM n-아세틸시스테인, 1 M 나이아신아마이드, 5 mM Alk 4/5/7 억제제, 30 M p38 억제제, 100 μM 가스트린을 첨가), 그리고 100 μM 프로스타글란딘 E2)를 웰당 사용했습니다.
      참고: 방울당 약 30 μL BMM을 사용하세요; 세포 밀도에 따라 조정하세요.
  2. 배양 유지
    1. 37 °C에서 5%CO2를 가진 오가노이드 배양; 매체는 3일마다 교체하세요.
    2. 오가노이드 형성을 매일 모니터링하세요. 3일째에는 작은 구형이 나올 것으로 예상하세요.
    3. 6일째부터 10일째까지 오가노이드 형성 성공 여부를 평가합니다. 형성 기간(3일에서 14일 사이)은 조직의 생존력과 줄기 상태에 따라 달라집니다.

3. PDTO 통과

  1. 분해
    1. 원심분리기를 4°C까지 미리 냉각하세요. 배지를 제거하고 얼음 차가운 HBSS 1mL를 넣은 뒤, 부드럽게 3-5번 피펫을 돌려 BMM을 방해합니다.
      참고: 잘 자란 오가노이드는 육안으로도 작은 흰 점으로 관찰할 수 있습니다.
    2. 현탁액을 멸균된 15mL 튜브에 옮기고 350 × g에서 원심분리기에서 5분간 보관합니다.
  2. 효소 해리
    1. 상청액을 버리고 TrypLE 1mL를 추가하세요. 37°C 물에 2분간 담가세요.
    2. TrypLE를 중화하기 위해 HBSS 2mL를 첨가합니다; 350 × g 에서 원심분리기를 5분간 가열합니다.
    3. 상청액을 제거하고 HBSS 2mL에 재현탁합니다. 다시 350 × g 에서 5분간 원심분리기를 사용했습니다.
  3. 재임베딩
    1. 신선한 BMM을 1:3-1:6 비율로 첨가합니다(오가노이드 펠릿: BMM, v/v); 부드럽게 다시 현지하세요. 각 방울은 약 30 μL의 최종 부피를 포함합니다. 방울을 새로운 24웰 플레이트에 넣고; 37°C에서 10분간 배양합니다.
    2. 웰당 500 μL 배양지를 추가하고 37°C에서 5%CO2로 배양합니다.
    3. 매일 우물을 점검하세요; 약 48시간 이내에 3D 재조립을 관찰합니다.
    4. 3-5회 통과 후에는 건강한 오가노이드를 선택하여 하류 분석이나 냉동 보존에 사용한다.

4. CAR-T 세포와 PDTO의 공동 배양

  1. 공동 배양 배지 준비
    1. CAR-T 생존 가능성을 지원하기 위해 10 ng/L IL-2와 0.05 mM β-머캡토에탄올을 기본 유기체 배양 배양지에 보충합니다.
      참고: 기본 매체는 PDTO의 3D 구조와 실행 가능성을 지원합니다.
  2. PDTO 준비
    1. 멸균 세포 스크레이퍼나 피펫 팁을 사용해 배양판에서 성숙한 PDTO가 포함된 BMM 방울(예: 4-6일차)을 제거합니다.
    2. BMM/PDTO 혼합물을 15mL 원뿔 튜브로 옮깁니다.
    3. 튜브에 얼음처럼 차갑게 식힌 HBBS 또는 티슈 워시 용액(1.1.2단계에 설명된 대로)을 5-10mL 넣으세요. 부드럽게 5-10번 뒤집어 BMM에서 오가노이드를 떼어내세요.
    4. 혼합물을 얼음 위에 5분간 두세요. BMM은 액체가 되고, 해리된 PDTO는 계속 떠 있습니다.
    5. BMM이 포함된 상정액을 조심스럽게 흡인하고, PDTO 탄환은 남겨두세요. 펠릿을 건드리지 마세요.
    6. BMM을 완전히 제거하기 위해 4.2.3부터 4.2.5까지 단계를 두 번 더 반복합니다.
    7. 최종 세척 후에는 PDTO가 포함된 상청액과 원심분리기를 300 × g 에서 4 °C에서 5분간 채취합니다.
    8. 상원액을 흡인하고 PDTO 펠릿을 1-2mL의 유기성 배양지 또는 공동 배양 배지에 재현탁합니다.
    9. (카운트 선택 사항) 단셀 현탁 장치를 준비하세요.
      1. 정확한 계수가 필요하다면 재현탁된 오가노이드를 새 튜브로 옮기고, 37 °C에서 미리 가열된 TrypLE Express와 함께 3-5분간 인큐베이션한 후 부드러운 피펫팅으로 단일 세포 현탁을 달성합니다. 세포 계수(예: 혈세포계나 자동 세포 계수기 사용)를 진행하세요.
        참고: 이 단계는 오가노이드를 분리시키며, 재도금 전에 계산 목적으로만 사용됩니다.
    10. 크기 선택 및 표준화: 공동 배양을 위한 일정한 오가노이드 크기를 보장하기 위해, 4.2.8단계부터 재현탁된 PDTO를 50mL 원뿔관 위에 올려놓은 70μm 세포 체를 통과시킵니다. 이 단계는 큰 오가노이드 집합체와 이물질을 제거하여 균일한 공동 배양에 적합한 표준 크기 분율을 나타냅니다.
    11. 표준화된 오가노이드 현탁액을 300 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다.
    12. 상원액을 흡인하고 표준화된 PDTO를 적절한 양의 미리 예열된 공동 배양 배양지에 재현탁합니다.
    13. 표준화된 PDTO를 세는 것(예: 현미경 아래 혈구계를 사용해 필드당 오르가노이드 수를 세는 것).
      참고: 카운팅은 세포 수가 아니라 오르가노이드 수에 기반합니다.
    14. 표준화된 PDTO를 목표 웰당 수에 원하는 다중 웰 플레이트(예: 96웰 U-바텀 플레이트)에 시딩합니다.
    15. 원하는 이펙터-표적(E:T) 비율로 웰에 CAR-T 세포를 추가합니다.
  3. PDTO 라벨링
    1. 원심분리기를 4°C로 미리 냉각하세요. 매체를 흡입하세요; 비말을 제거하기 위해 HBSS 1mL를 추가하세요.
    2. 15mL 원심분리관에 옮기고, HBSS 4mL를 추가한 후 부드럽게 피펫을 사용하세요. 350 × g 에서 원심분리기를 5분간 보관합니다.
    3. 상정액을 버리고 HBSS 5mL를 넣은 후 부드럽게 피펫을 사용하세요. 다시 350 g × 원심분리기를 5분간 했습니다.
    4. Hoechst 33342 작업 용액을 준비하세요.
    5. 펠릿을 1 mL Hoechst 33342 용액(최종 농도 5 μg/mL)에 재현탁합니다. 염료가 균일하게 침투되도록 3-5번 부드럽게 뒤집어 섞으세요. 튜브를 알루미늄 호일로 감싸서 빛으로부터 보호하세요. 37°C에서 10분간 배양하세요. 스테인 후에는 HBSS로 두 번 세척해 과도한 염료를 제거하세요.
  4. PDTO의 도금
    1. 겔 방울-웰 비율 1:5에서 오가노이드 밀도를 추정합니다; 약 1× 103 오 르가노이드/mL의 공동 배양 배지에서 재현탁합니다.
    2. 96웰 플레이트에 웰당 100 μL을 추가하고; 조건별로 최소 3개를 포함하세요.
      참고: 이 단계에서 세포 수를 측정하지 마십시오; 오르가노이드는 온전하게 유지됩니다.
  5. CAR-T 공동문화
    참고: 이 프로토콜은 PDTO와 함께한 CAR-T 세포의 공동 배양 및 효능 평가에 중점을 둡니다. 본 연구에 사용된 CAR-T 세포의 생성 및 특성 분석은 8절에서 설명되어 있습니다.
    1. 로그 상에서 CAR-T 세포를 채취하세요. 트리판 블루로 스테인을 사용해 생존 가능성을 확인>95%.
    2. 원심분리기 셀에서 350 × g 에서 5분간 사용; 공동 배양 배지에서 재현탁.
    3. 농도를 4× 106/mL, 2× 106/mL, 1× 106/mL로 조절하세요.
    4. 실험 설계에 따라 유정당 100 μL CAR-T 현탁을 추가합니다. 웰을 조절하기 위해 100 μL 공배양 배지를 추가하세요.
    5. 플레이트를 37°C, 5%CO2 에서 6-24시간 배양합니다.

5. 죽은 세포 염색

  1. SYTOX 그린 염색
    1. 10×5 셀마다 100 μL Nuclear Green 염색액을 1 μL SYTOX Green (1000x)를 1 mL의 분석 완충액에 희석하여 준비합니다.
    2. 6시간 및 24시간 공동 배양 시점에는 웰당 100μL SYTOX 그린 염색액을 추가합니다. 37°C에서 20분간 어두운 환경에서 부화하세요.

6. 이미지 획득

  1. 상정액을 흡인하고 DMEM/F12 100 μL를 추가합니다.
  2. 현미경(예: 공초점)을 사용해 밝은 시야 및 형광 이미지를 캡처하기:
    Hoechst 33342 (PDTO): 여기(Ex)/방출(Em) = 350 nm/461 nm
    mCherry (CAR-T): Ex/Em = 587 nm/610 nm
    SYTOX 그린(죽은 세포): Ex/Em = 504 nm/528 nm
  3. 중앙 필드에 초점을 맞춘 각 웰당 최소 3분의 이미지를 촬영하세요.

7. 데이터 분석

  1. Launch ImageJ (버전 1.54, NIH, https://imagej.nih.gov/ij/); SYTOX 그린 채널 이미지를 가져오세요. 임계값을 수동으로 설정하여 형광 신호와 배경을 구분합니다(이미지 > 임계값 조정 >).
  2. 분석 > 측정 기능을 사용해 통합 밀도를 계산하세요. 적절한 통계 분석 소프트웨어(예: GraphPad Prism)에서 .csv 데이터를 내보내 후속 통계 분석에 활용합니다.
  3. 임계값을 설정하여 형광 신호와 배경 신호를 분리하세요.
  4. 전체 필드를 선택하세요; 분석 > 측정 을 실행하여 형광 신호 강도를 합산합니다.
  5. 데이터를 내보내고 24시간 동안 치료군과 대조군을 비교하기 위한 통계 분석을 수행합니다.

8. CAR-T 세포의 생성 및 특성 분석

  1. CAR 구조 설계
    참고: 본 연구에 사용된 CAR-T 세포는 대장암에서 자주 과발현되는 항원인 B7-H3(CD276 유전자에 의해 암호화됨)를 표적으로 합니다14. CAR 구성은 다음과 같이 구성됩니다:
    세포외 도메인: B7-H3 클론 376.96에 대한 단클론 항체에서 유래한 단일 사슬 변성 단편(scFv).
    힌지 및 막관통 도메인: CD8α 힌지와 막 관통 도메인.
    공동 자극 영역: 인간 CD28.
    신호 전달 도메인: 인간 CD3ζ.
  2. CAR-T 세포 생성
    1. 분리: 건강한 기증자 털에서 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 Ficoll-Paque 밀도 구배 원심분리를 사용하여 분리합니다.14.
    2. 활성화: 10 ng/mL IL-7과 5 ng/mL IL-15를 보충하여 T 세포 배지에서 플레이트 결합 항-CD3/CD28 항체로 인간 PBMC를 48시간 활성화합니다. T 세포 배지는 RPMI 1640과 Click's Media를 각각 250mL씩 같은 양으로 혼합하고, 태아 소 혈청(FBS), GlutaMAX 1회, 페니실린-스트렙토마이신(Pen/Strep)으로 보충하여 준비합니다.
    3. 전도: 앞서 설명한 레트로넥틴 코팅판을 사용하여 레트로바이러스 상액으로 활성화된 T 세포를 전달합니다.
    4. 확장: 전도 후 3일 후 IL-7과 IL-15를 포함한 완전한 인간 T세포 배지에서 T세포를 채취 및 배양하여 특성화 및 기능 분석에 추가로 7-9일을 진행합니다.
  3. CAR-T 세포 특성 분석
    1. CAR 발현: 재조합 B7-H3-Fc 단백질을 이용한 유세포검사로 전이 후 5-7일 이내에 CAR 발현을 평가하고, 이어서 인간 Fc14에 대한 형광 표지된 2차 항체를 검사합니다. 일반적인 전도(CAR+ 셀) 효율은 80%에서 90% 사이입니다.
    2. 표현형: CD3, CD4, CD8, CD4, CD4RA, CCR7 등에 대한 항체를 이용한 유세포검사로 T 세포 소집합(예: CD4+, CD8+ 등)을 특성화합니다14.
    3. 기능적 검증(선택적 사전 공동 배양): 공동 배양 실험 전에 B7-H3 양성 및 B7-H3 음성 표적 세포주와 공동 배양하고, 사이토카인 방출(예: ELISA)에 의한 IFN-γ 또는 세포독성(예: 유세포검사15 사용)을 측정하여 CAR-T 세포를 기능적으로 검증합니다.
  4. 공배양 준비 (PDTO 분석)
    1. CAR-T 세포는 로그 단계 증식(일반적으로 활성화 후 10-14일 사이) 동안 공동 배양을 수행합니다. 사용 전에 세포를 HBSS로 두 번 세척하여 IL-7/IL-15를 제거하고, 4.1단계에서 설명한 공동 배양 배지에 재현탁합니다.
    2. 트리판 블루 염색을 사용해 생존 가능성을 >95%로 확인하세요.
    3. 시각적 체크포인트: 3일째부터 5일째에 작은 구형 군집(50-100 μm)과 10일부터 14일째에 성숙한 구형(100-200 μm)을 점검합니다.

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결과

대장암 오가노이드는 내시경 생검 샘플(그림 1)에서 성공적으로 추출되었으며, 종양 정체는 병리학적 진단으로 확인되었습니다(그림 2). BMM에서 배양된 종양 조각은 24시간 이내에 3D 구조를 형성하기 시작했습니다. 1세대 오가노이드(P0)는 7일째에서 14일 사이에 전달되었습니다. 오가노이드는 구형, 낭포형, 원형 구조 등 다양한 형태를 보였다(그림 2A).

형광 영상 시스템을 사용하여 PDTO와 CAR-T 세포 간 상호작용을 24시간 동안 관찰하였습니다. 종양 오가노이드는 Hoechst 33342로 표지되었고, CAR-T 세포는 mCherry를 발현하였습니다. 형광 현미경 검사 결과 CAR-T 세포가 6시간 동안 웰 바닥에 고르게 분포되어 있음을 확인했습니다...

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토론

본 논문은 밝시야 영상과 형광 염색을 결합하여 오가노이드 생존성을 평가하는 CAR-T 세포가 PDTO에 미치는 세포독성 효과를 평가하는 방법을 제시합니다. 이 이중 모달리티 접근법은 3D 모델 시스템에서 종양 세포 사사를 강력하게 시각화할 수 있게 하며, CAR-T 세포독성의 반정량적 평가를 제공합니다.

이 프로토콜의 핵심 요소 중 하나는 배양 매체입니다. CAR-T 세포와 종양 오가노이드는 영양소 요구량이 다르기 때문에, CAR-T 세포와 오르가노이드 배양 배양지의 적합성이 먼저 평가되었습니다. CAR-T 세포는 오가노이드 배양 배양지에서 표준 T 세포 배지보다 생존력과 증식 능력을 더 효과적으로 유지했습니다(보충 그림 1). 반면, 오르가노이드는 T 세포 배지에서 생존력과 구조적 완전성을 빠르게 잃었습니다. 따라서 오르가노이드 배지를 공동 배양 기반으로 선택하고, IL-2와 β-머캅토에...

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공개 사항

저자들은 이해 충돌이 없음을 선언한다.

감사의 글

이 연구는 중국 국가중점연구개발프로그램(2022YFC2304400, 2022YFC2304401), 난산 의료보건시스템 과학기술프로젝트(NSZD2024046, NS2024105), 선전 의학연구기금(D2401023)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
15mL 튜브세이닝3030100
24웰 플레이트코닝3524
50mL 튜브세이닝3030000
96웰 플레이트코닝3599
고급 DMEM/F12깁코C11330500BT
알크산 4/5/7 억제제MCEHY-10432 
B27깁코17504044
생명안전 캐비닛 (클래스 II)써모피셔해당 없음
소 혈청 알부민시그마 올드리치A9056
세포 배양 접시바이오필TCD010060
원심분리기에펜도르프5810R
클릭스 미디엄후지 필름9195
CO2 인큐베이터야마타IP610
콜라게나제 II솔라비오C8150
콜라겐제 IV시그마 올드리치C9407
공초점 레이저 현미경자이스LSM900
냉동 보존 매체제노악CELLBANKERTM2
소화 완충기사내에서 준비된 시약해당 없음원고에 제공된 구성
디지털 셰이커미울랍HS-25
분산형 II시그마-알드리치D4693
DMEM깁코C11995500BT
다이나비즈 인간 T 활성화제 CD3/CD28써모피셔11131D
EGF페프로텍AF-100-15-500UG
태아 소 혈청깁코1631389
가스트린글립바이오GA20228
겐타미신/암포테리틴 B깁코R0151
글루타맥스깁코35050061
행크스의 균형 잡힌 소금 용액깁코C14175500BT
젠장깁코15630080
호에스트(Hoechst 33342)와 nbsp;비요타임C1027
히알루로니다제솔라비오H8030
IL-15페프로텍200-15-10UG
IL-2노보프로틴CK24-10
IL-7페프로텍200-07-10UG
이미지JNIH (오픈 소스)https://imagej.nih.gov/ij/
뒤집힌   형광 현미경MshotMF52-N
마트리젤코닝356231
N2깁코17502048
n-아세틸시스테인시그마 올드리치A7250-5G
나이아신아마이드시그마 올드리치N0636-100G
노긴페프로텍120-10C-20
노르모신인비보젠안티-NR-1
오가노이드 배양 배지사내에서 준비된 시약해당 없음원고에 제공된 구성
P38 억제제MCEHY-10295와 nbsp;
페니실린-연쇄상술깁코15140122
프로스타글란딘 E2MCEHY-101952 
로-연관 키나아제 억제제 줄기세포72304
RPMI 1640하이클론SH30809.01B
R-스폰딘 1페프로텍120-38-20UG
S1 피펫 필러써모 사이언티픽9501
혈청학적 피펫바이오필GSP-010-050
단일 채널 피펫에펜도르프3123000063
단일 채널 피펫에펜도르프3123000055
단일 채널 피펫에펜도르프3123000098
단일 채널 피펫에펜도르프3123000022
멸균 일회용 메스테크-SSSD10
시톡스 그린비요타임C1181S
텍스맥스 미디엄밀텐이 바이오텍130-097-196
온도조절기 물탱크블루파드BWS-10
트리판 블루피진PH0519
트립LE 익스프레스깁코12605028
β-머캡토에탄올깁코21985023

참고문헌

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CAR T3

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