방법 논문

살모넬라 혈청형 예측을 위한 층별 유전체 프레임워크: 중국 남서부에서 MLST, SeqSero, SeqSero2, SeqSero2S, SISTR 평가

503 조회수

⸱

DOI:

10.3791/69117

⸱

2026년 1월 9일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1West China School of Public Health and West China Fourth Hospital, Sichuan University, 2College of Pharmacy, Youjiang Medical University for Nationalities, 3Chengdu Center for Disease Control and Prevention (Chengdu Institute of Health Supervision), 4Sichuan Provincial Centre for Disease Control and Prevention, 5Department of Laboratory Medicine and Port Epidemic Disease Monitoring Key Laboratory of Sichuan Province, Sichuan International Travel and Healthcare Center (Chengdu Customs District Port Clinic), 6Health Promotion and Food Nutrition & Safety Key Laboratory of Sichuan Province, 7Innovation Center of Nursing Research and Nursing Key Laboratory of Sichuan Province, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 MLST 또는 SeqSero2S를 이용한 일상 감시, 핵심 유전체 MLST와 함께 발병 탐지, SeqSero2S를 신속 선별에 활용하는 살모넬라 혈청형 예측을 위한 층화된 유전체 워크플로우를 구축합니다. 이 프로토콜은 중국 내 감시를 강화하기 위해 다센터 분석을 통해 검증되었습니다.

초록

살모넬라의 정확한 혈청형 분석은 효과적인 감시 및 발병 조사에 필수적입니다. 혈청형 다양성은 병원성과 공중보건 위험 평가에 직접적인 영향을 미치기 때문입니다. 그러나 기존 슬라이드 응집 방법은 재현성 저하, 노동 집약도, 높은 비용 때문에 고처리량 모니터링 프로그램에서의 적용이 어려워집니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 다중유전자 서열 타이핑(MLST), 살모넬라 인 실리코 타이핑 리소스(SISTR), SeqSero, SeqSero2, SeqSero2S를 통합하여 전체 게놈 시퀀싱 데이터를 활용한 혈청형 예측을 위한 유전체 워크플로우를 개발하고 검증했습니다. 이 프로토콜은 중국 남서부에서 식품 및 인체 공급원에서 수집한 315개의 살모넬라 분리주를 다기관 분석하여 평가하였습니다. 이 연구 결과는 전통적인 혈청형 분석 대비 유전체 접근법 간 유전체 접근법 간 유사성이 유의하게 높았음을 보여주었으며(훈련 세트에서 각각 100%/99.1%/90.1%, 검증 세트에서 각각 100%/97.1%/93.1%) 워크플로우에는 감시 맥락에 기반한 적절한 예측 방법 선택 권고가 포함되어 있으며, 일상 모니터링에는 MLST와 SeqSero2S, 신속 선별을 위한 SeqSero2S, 발병 조사를 위한 핵심 유전체 MLST를 포함한 SISTR을 강조합니다. 이 접근법은 유전체 혈청형 분석의 통합을 촉진하여 전통적인 혈청학에 대한 의존도를 줄이고 살모넬라 모니터링 프로그램의 재현성과 확장성을 향상시킵니다.

서론

살모넬라는 전 세계적으로 가장 중요한 식중독성 병원체 중 하나로, 상당한 이환율과 사망률을 유발합니다 1,2. 중국에서는 식중독의 주요 원인으로 남아 있으며, 제한된 수의 혈청형이 감염의 대다수를 차지하고있습니다. 정확한 혈청형 식별은 감시 및 발병 조사에 매우 중요하며, 혈청형 다양성은 병원성 및 공중보건 위험과 밀접하게 연관되어 있습니다. 이는 살모넬라 엔테리티디스와 살모넬라 티피무리움과 같은 흔한 혈청형에서 잘 알려져 있지만, 살모넬라 파나마와 같이 덜 연구된 혈청형도 전 세계적 확산과 침습적 질병의 중요한 원인으로 작용하여 견고한 혈청형 분석의 필요성을 보여준다. 오랫동안 금본위로 인정받는 전통적인 혈청형 검사법은 150개 이상의 항혈청5가 필요한 시간과 비용이 많이 드는 과정입니다. 또한 재현성 저하6, 노동 집약적 작업 흐름7, 응집 반응의 주관적 해석으로 인한 고유 변동성8로 인해 고처리량 모니터링 프로그램에는 적합하지 않습니다9.

전체 유전체 시퀀싱(WGS)의 등장으로 병원체 특성 분석이 혁신적으로 변화하여 빠르고 고해상도의 혈청형 예측이 가능해졌습니다. 멀티로커스 시퀀스 타이핑(MLST), SeqSero13, SeqSero214, SeqSero2S15, 그리고 살모넬라 인 실리코 타이핑 리소스(SISTR)7,15 등 여러 인실리코 도구가 개발되었습니다. MLST가 표준화된 장기 역학 추적을 제공하는 반면, SeqSero2와 SeqSero2S는 원시 리드에서 직접 분석할 수 있게 하여 일반적인 혈청형에 대한 고처리량 스크리닝을 가능하게 합니다14,15. 반대로 SISTR은 조립된 유전체를 필요로 하지만 항원 유전자 검출과 핵심 유전체 다좌위 서열 분류(cgMLST)를 통합하여 발병 조사에 대한 포괄적인 해결을 제공합니다17. WGS 기반 살모넬라 특성 분석이 연구에서 주요 증거로 점점 더 채택되고 있으나, 대규모 감시에서의 적용은 제한적이며, 이는 방법 적합성에 영향을 미치는 미해결된 실용적 고려사항 때문인 부분적으로 기인합니다. 전 세계 조사에 따르면, 참여 실험실 중 단 8%만이 일상적인 감시에 WGS를 사용하며, 분석 복잡성이 주요 장벽 중 하나로 나타났습니다20. 예를 들어, 신뢰할 수 있는 혈청형 예측은 적절한 시퀀싱 깊이(비용 효율성을 위해 일반적으로 >75×, 특히 고품질 분석을 위해 ~200×)과 고품질 유전체 조립체(N50 연속체> 최소 비용 효율적인 최소 30 kbp, 바람직하게는 100 kbp>100 kbp)에 달려 있으며, 특히 SISTR 21,22,23과 같은 조립 의존 도구의 경우 더욱 그렇습니다. 또한, 도구 선택은 실험실의 계산 자원과 전문성에 맞춰야 합니다. SeqSero2S와 같은 오픈소스 도구는 원시 리드를 분석하고 계산 집약적인 조립15를 우회하여 빠른 스크리닝을 가능하게 하는 반면, 생물정보학 용량이 제한된 실험실은 데이터 분석 및 저장에 어려움을 겪을 수 있습니다. 따라서 대규모 감시에서 혈청학적 검사를 줄일 수 있는지를 판단할 충분한 데이터가 없으며, 이는 자원 적응적 접근법의 필요성을 부각시킵니다. 특히, COVID-19 팬데믹 이후 다양한 의료 기관에서 대량의 유휴 시퀀싱 기기와 qPCR이 존재하여, 이 역량을 유전체 감시에 재활용할 기회를 제공합니다.

이 격차를 해소하기 위해, 우리는 위에서 언급한 유전체 혈청형 분석 도구에 대해 중국 남서부에서 식품 및 인체 공급원에서 수집한 315개의 살모넬라 분리주를 사용하여 다기관 평가를 실시했습니다25,26. 이러한 결과를 바탕으로, 우리는 다양한 실험실 자원과 감시 요구를 고려한 계층화된 워크플로우를 개발하여 다양한 맥락에서 도구 선택에 대한 명확한 기준을 제공했습니다. 이 프레임워크는 신속 선별을 위한 SeqSero2S와 발병 조사를 위한 SISTR과 cgMLST를 결합하여 유전체 접근법 도입을 용이하게 하고 전통적인 혈청형 분석 방법에 대한 의존도를 줄입니다. 여기서는 각 워크플로우 단계를 상세히 설명하며, 분리 식별, 시퀀싱, 데이터 분석, 그리고 다양한 감시 상황에서 예측 도구 선택 기준을 설명합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

인간 대변 샘플 채취 및 처리는 쓰촨대학교 서화제4병원 윤리위원회(프로토콜 번호: HXSY-EC-2022093)의 승인을 받아 헬싱키 선언과 우수 임상 실무에 따라 수행되었습니다. 국가 공중보건 규정에 따라 사전 동의가 포기되었습니다.

참고: 살 모넬라 생체 배양과 인간 대변 샘플을 포함하는 모든 절차는 표준 미생물학적 관행과 생물안전 절차에 훈련받은 인력이 생물안전 레벨 2(BSL-2) 실험실에서 수행해야 합니다. 항상 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하세요. 여기에는 실험복, 장갑, 안전 고글이 포함됩니다. 오염된 장갑은 정기적으로 소독하고 교체하세요. 실험 전후로 모든 작업 표면을 적절한 소독제(예: 70% 에탄올, 1% 차아염소산나트륨)로 오염 제거하세요. 생물학적 물질을 포함한 모든 액체 및 고체 폐기물은 폐기 전에 121 °C에서 최소 30분 이상 오토클레이빙으로 오염을 제거해야 합니다. 에어로졸과 물보라의 발생을 피하세요. 인증된 생물학적 안전 캐비닛 내에서 에어로졸을 생성할 수 있는 모든 절차(예: 원심분리, 격렬한 흔들림)를 수행하세요.

1. 식품 샘플 채취 및 균주 식별

  1. 소매 시장이나 가공 시설에서 식품 샘플을 수집하세요. 국가 식품 안전 기준 GB 4789.4 및 식중독 질병 감시 프로그램의 기밀 유지 프로토콜에 따라 식품 샘플에서 살 모넬라 를 분리하십시오.
  2. 사전 농축:
    1. 각 식품 샘플을 정확히 25g씩 무게 측정하세요. 샘플에 완충 펩톤 워터(BPW)를 225mL(1:10 희석 비율)로 추가하고, 30초간 소용돌이를 통해 완전한 균질화 및 침수를 보장합니다.
    2. 샘플을 BPW 온도에서 36°C ± 1°C에서 150rpm으로 설정한 진동 인큐베이터에서 8-18시간 배양합니다.
      참고: 비선택적 육수에서의 사전 농축은 병원체 부하를 크게 증가시킵니다. 이후 모든 재료(용기, 피펫 등)는 매우 전염성이 강한 것으로 취급하세요.
  3. 선택적 농축: 사전 농축 후 샘플 1mL를 테트라티오네이트 육수(TTB)에 옮깁니다. TTB를 42°C에서 18-24시간 동안 흔들지 않고 부양하세요.
  4. 분리: 배양 후에는 농축된 배양물을 다음 선택적 한천 플레이트에 스트릭합니다: 헥토엔 엔테릭(HE) 한천, 자일로스 라이신 디옥시콜레이트(XLD) 한천, CHROMagar 살모넬라. 플레이트를 36°C에서 18-24시간 부양하세요.
    참고: 플레이트에 스트리킹할 때는 에어로졸과 교차 오염을 피하기 위해 주의해야 합니다. HE 한천에서는 추정되는 살모넬라 군락이 보통 청록색에서 파란색으로 나타났으며, 중심이 검은색이든 없든 있습니다. 주변 한천도 비슷한 녹색 빛을 띠기도 합니다. XLD 한천에서 추정되는 살모넬라 군락은 보통 붉은색에 중심이 검은색입니다. CHROMagar에서는 추정되는 살모넬라 군락이 제조사에 의해 지정된 마젠타에서 연보라색 색상으로 특징지어집니다. 각 선택적 배지에서 18-24시간 부화 후 잘 분리된 군집이 나타날 것으로 예상합니다. 과도하게 자란 플레이트(>300 군락)는 희석과 재스트레이킹이 필요할 수 있습니다.
  5. 식별: 살 모넬라 군락이 의심되는 판을 검사합니다. 제조사의 분석 지침에 따라 그람 음성(GN) 신분증을 사용한 자동 식별 시스템을 사용하여 의심되는 균주를 식별하세요.
    참고: GN 카드의 로트 번호가 유효하고 만료일 내에 있는지 확인하세요.
    1. 순수 군락에서 0.45% 식염수 용액을 사용해 지정된 탁도(0.50-0.63 McFarland 표준)로 만든 박테리아 현탁액을 준비합니다.
    2. 서스펜션을 GN 카드에 넣고 테스트를 실행하세요. 시스템이 카드를 35.0 °C ± 2.0 °C에서 자동으로 인큐베이팅하도록 설정하고, 생화학적 반응을 최대 8시간까지 모니터링하도록 설정하세요.
    3. 살모넬라 엔테리카 ssp. enterica 결과는 95% 확률과 우수한 신뢰 등급으로 ≥ 받아들입니다.
  6. 혈청형 분석: 37°C에서 하룻밤 배양한 후 군집 한천 판에서 단일 군집을 채취합니다. 슬라이드 응집 검사를 수행하여 O-항원과 H-항원을 검출합니다. 검사 시에는 시중에 판매되는 살모넬라 항혈청 키트( 재료표 참조)를 사용하세요.

2. 인간 샘플 채취 및 균주 식별

참고: 인간 대변 샘플에서 살모넬라 를 분리하려면 식중독병 감시 프로그램의 기밀 유지 프로토콜을 준수해야 합니다.

  1. 채취: 약 2g의 신선하게 배출된 인간 대변 샘플을 채취합니다. 대변 샘플을 깨끗하고 건조하며 입이 넓은 용기에 담아주세요. 대변 샘플을 단열 운반 상자를 사용해 1시간 이내에 실험실로 운반하여 샘플 무결성을 유지하세요.
    주의: 인간 대변 샘플에는 살모넬라 외에도 여러 병원체가 포함될 수 있습니다. 모든 샘플은 감염 가능성이 있는 것으로 간주하며, 생물학적 위험 물질 취급에 대한 표준 예방 조치를 준수하세요.
  2. 접종: 채취된 대변 샘플을 다음 선택적 한천 플레이트에 직접 접종합니다: CHROMagar 살모넬라, 살모넬라-XLD 한천, 그리고 시겔라(SS) 한천.
    참고: CHROMagar 살모넬라 와 XLD 한천의 특징적인 군집 형태는 1.4단계를 참조하십시오. SS 한천에서 추정되는 살모넬라 군락은 보통 무색, 불투명 또는 검은 중심이 있는 황갈색으로 나타납니다. 한천 자체는 비교적 변하지 않았습니다.
  3. 식별: 1.5단계에서 설명한 살 모넬라 의심 집단을 식별합니다.
  4. 혈청형 검사: 1.6단계에서 설명한 슬라이드 응집을 통해 혈청형 검사를 수행합니다.

3. 라이브러리 준비 및 전체 유전체 시서열 분석

  1. 박테리아 배양: LB 한천에 살모 넬라 줄무늬, 37°C에서 12시간 배양. 군락을 골라 200mL LB 육수에 접종한 후 150rpm(37°C, 12시간)으로 흔듭니다. 세포를 채취하기 위해 12,000 × g 에서 10분간 원심분리기를 사용하세요.
    참고: 모든 원심분리 단계는 에어로졸 발생을 방지하기 위해 밀폐된 로터나 안전 컵을 사용하여 수행하세요.
  2. DNA 추출: 제조업체의 프로토콜에 따라 상업용 DNA 추출 키트( 재료표 참조)를 사용하여 유전체 DNA를 추출합니다.
    주의: 상업용 DNA 추출 키트에 사용되는 시약(예: 용해 완충제, 단백질효소 K)은 흡입하거나 피부 및 눈에 접촉할 경우 해로울 수 있습니다. 휘발성 시약을 사용할 경우 연기 후드나 생물학적 안전 캐비닛에서 추출을 수행하고, 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요.
  3. DNA 품질 평가: dsDNA 고감도 분석 키트를 사용해 유전체 DNA를 정제하고 형광측정기를 사용해 정량합니다. 1% 아가로스 겔을 100V 전압에서 45분간 전기영동하여 DNA 무결성을 검증합니다; 고품질 DNA는 단일 콤팩트 밴드>20 kbp로 나타나며, 번짐이최소화됩니다.
    참고: (중요한 단계) 고품질의 고분자량 유전체 DNA(A260/A280 비율이 ~1.8-2.0)는 성공적인 라이브러리 준비 및 시퀀싱에 매우 중요합니다.
    주의: 아가로스 겔 전기영동에 사용되는 핵산 염색료(예: GelRed, 에티듐 브로마이드)는 돌연변이를 유발합니다. 젤과 염색 용액을 다룰 때는 항상 장갑을 착용하고, 기관의 유해 폐기물 규정에 따라 폐기하세요.
  4. DNA 단편화: 제조사 프로토콜에 따라 집중 초음파 시스템을 사용해 약 150ng의 적격 유전체 DNA를 평균 ~350 bp 크기로 분해합니다.
  5. 상업용 라이브러리 준비 키트를 사용하여 절단된 DNA 조각을 사용해 시퀀싱 라이브러리를 구성합니다(재료 표 참조). 절단된 DNA 조각의 엔드 복구 및 5'-인산화를 수행합니다. 그 다음 3' 끝에 단일 'A' 베이스를 추가하고, 인덱스 시퀀싱 어댑터를 연결하세요.
  6. 키트에 명시된 한정 주기 PCR 프로그램을 통해 어댑터 연결 DNA 조각을 증폭 및 풍부하게 합니다.
  7. 형광분석법과 모세관 전기영동과 같은 방법을 사용하여 최종 라이브러리를 선정하고 정량화합니다.
  8. 표준 운영 절차에 따라 시퀀싱 플랫폼에서 쌍결 시퀀싱(2× 150 bp)을 수행합니다.

4. 데이터 분석

  1. 원시 시퀀싱 데이터의 품질 관리: 기본 매개변수와 함께 fastp(버전 0.23.0)를 사용하여 원시 FASTQ 파일에 대해 초기 품질 관리를 수행합니다. 목표는 어댑터 시퀀스와 저품질 리드를 제거하여 후속 분석을 위한 깨끗한 FASTQ 데이터를 생성하는 것입니다.
  2. SPAdes(버전 3.15.0)를 사용해 고품질 필터링된 리드를 초안 게놈으로 조립하고, 불일치를 줄이고 인델26을 짧게 만드는 세심한 옵션을 선택하세요.
  3. 유전체 서열(FASTQ /FASTA 파일)을 다양한 혈청형 예측의 입력으로 활용하세요.
    1. MLST의 경우, FASTQ 파일을 BioNumerics 소프트웨어(버전 7.6)로 가져오세요.
      1. 템플릿 가져오기 창에서 고급 옵션의 '파싱 편집 '을 클릭하세요. 데이터 파싱 문자열 과 데이터 장식 을 [DATA]로 설정하세요. 파일 이름 파싱을 위해 정규 표현식 DATA]_* 와 [DATA] 를 적용합니다. 템플릿을 저장하고 선택한 후 다음 을 클릭한 후 완료하세요. 제출 작업 창에서 제출을 확인하여 데이터를 업로드하세요. CEStoreUploader 도구는 자동으로 열려 WGS의 원시 데이터를 계산 엔진으로 전송합니다.
      2. 업로드 후 유전체 항목을 선택하세요. WGS 도구 로 이동하여 "TraNetGenotype"을 선택하여 자동 ST 예측을 받으세요. TraNetGenotype 대화상자에서 균주 유형으로 살모넬라 를 선택하고, 혈청형 분석, 병원성 분석, 항생제 감수성 분석을 선택한 후 '예'를 클릭하세요.
    2. SISTR(버전 1.1.3; https://github.com/phac-nml/sistr_cmd; 매개변수: 모든 매개변수는 기본값입니다), 터미널을 열고 조립된 게놈 파일 assembly.fasta가 있는 디렉터리로 이동하세요.
      1. 다음 명령을 실행하여 세로바 예측을 수행하고 CSV 형식으로 포괄적인 보고서를 생성하세요: sistr --qc --alleles-output allele-results.json --cgmlst-profiles cgmlst-profiles.csv -f tab -o sistr-output.tab -i assembly.fasta. 이 명령은 예측된 세로바르를 포함한 보고서를 생성합니다.
        참고: -QC: 조립품에 대한 품질 관리 검사를 수행합니다. -i assembly.fasta: 입력 FASTA 파일을 지정합니다. -f csv: 출력 형식을 CSV로 정의합니다. -o sistr_results: 출력 파일의 기본 이름(예: sistr_results.csv)을 설정합니다. -p 4: 계산 속도를 높이기 위해 4개의 CPU 스레드를 사용함. --alleles-output: 대립유전자 서열과 정보를 JSON 파일에 저장합니다. --cgmlst-profiles: cgMLST 대립유전자 프로필을 CSV 파일로 내보냅니다.
    3. SeqSero (버전 1.0; https://github.com/denglab/SeqSero; 매개변수: 모든 매개변수는 기본값입니다), 입력 데이터 파일이 포함된 디렉터리로 이동합니다. 분석 시 기본 매개변수로 다음 명령을 실행하세요: python SeqSero.py -m 4 -i assembly.fasta. 이 도구는 예측된 혈청형이 포함된 파일 Seqsero_result.txt 포함된 출력 디렉터리를 생성합니다.
      참고: -m 4는 입력 유형을 게놈 조립으로 지정합니다. -i는 입력 FASTA 파일을 정의합니다.
    4. SeqSero2(버전 1.3.1; https://github.com/denglab/SeqSero2; 매개변수: 모든 매개변수는 기본값입니다). 다음 명령어를 실행하세요: python3 SeqSero2_package.py -m k -t 4 -i assembly.fasta. 도구는 예측된 혈청형을 완료 시 직접 터미널 화면에 출력합니다. 출력은 예측된 혈청형을 제공합니다.
      참고: -m k: 독특한 혈청형 결정 인자를 사용하여 빠른 혈청형 예측을 위한 k-mer 기반 워크플로우를 지정합니다. -t 4: 입력 타입을 조립된 시퀀스로 나타냅니다.
    5. SeqSero2S (버전 1.1.1; https://github.com/denglab/SeqSero2S; 매개변수: 모든 매개변수는 기본값입니다): 제공된 스크립트로 실행하세요: python SeqSero2S.py -m k -t 4 -i assembly.fasta. 출력은 예측된 혈청형을 제공합니다.
      참고: -m k는 원시 리드 또는 유전체 조립체의 k-mer 기반 분석을 가능하게 합니다. -T 4는 조립된 시퀀스 입력을 지정합니다.

5. 중요한 매개변수와 실용적 고려사항

참고: 특히 자원이 제한된 환경에서 이 유전체 워크플로우를 성공적으로 구현하는 데 중요한 고려사항들이 있습니다.

  1. 원시 시퀀싱 데이터가 충분한 범위 깊이를 달성하는지 확인하세요. 약 100배의 시퀀싱 깊이가 고품질 분석에 일반적으로 충분합니다.
    참고: 비용 효율성을 우선시하는 실험실에서는 MLST 또는 SeqSero221을 사용하여 신뢰할 수 있는 혈청형 예측을 위한 실용적인 낮은 임계값으로 최소 75배 시퀀싱 깊이를 권장합니다.
  2. 원본 리드의 품질이 높은지, Q30 점수(기본 통화 정확도 99.9%)가 보통 90% 이상인지 확인하세요.
  3. 조립된 콘티그가 필요한 혈청형 예측 도구를 사용하기 전에 신규 게놈 조립의 품질을 평가하세요. N50 통계를 주요 지표로 사용하세요.
    참고: 최소 100 kbp의 N50은 권장22, 30 kbp 이상의 N50은 신뢰할 수 있는 분석의 최소 요구사항으로 간주되어야 합니다23.
  4. 필터링된 리드를 조립된 게놈으로 다시 매핑할 때 최소 ≥98%의 읽기 매핑률을 보장하여 조립의 완전성을 확인하세요.

6. 고처리량 살모넬라 감시를 위한 권장 혈청형 예측 프로토콜

참고: 혈청형 예측 방법은 감시 상황, 요구되는 정확도, 사용 가능한 실험실 자원을 기준으로 선택하세요. 고처리량 살모넬라 감시를 위해서는 아래 프로토콜을 따르세요:

  1. 예비 식별: GB 4789.4에 따라 초기 스크리닝을 실시하여 살모넬라 속균으로 분리균을 확인합니다.
    참고: 이 단계에서는 분리물의 구체적인 혈청형을 식별할 필요가 없습니다.
  2. 일상 감시(고처리량 모드): BioNumerics가 더 이상 업데이트되지 않으므로 일상 감시를 위해서는 지속적인 기술 지원과 업데이트를 받는 오픈 소스 MLST28, SeqSero2S 또는 검증된 사용자 친화적인 유전체 분석 플랫폼을 사용하세요.
    참고: MLST에 대해: 7유전자 체계는 표준화되고 휴대성이 있으며 계통발생학적으로 유익한 프로필(서열 유형, ST)을 제공하여 장기 역학과 전 세계 균주 비교에 이상적입니다. 그 단순함은 빠른 분석과 최소한의 계산 부담을 보장합니다. SeqSero2S의 경우: 빠른 혈청형 예측과 통합 MLST 결과를 한 번에 동시에 얻을 수 있는 이중 이점을 제공합니다. 이 장치는 원시 시퀀싱 리드를 직접 분석하여 유전체 조립을 우회하여 시간과 자원을 절약할 수 있습니다. 조립된 FASTA 데이터조차도 계산 분석에 의존하지 않고 독립적으로 혈청형 예측을 수행하기 때문에 SISTR과 같은 도구보다 더 빠릅니다.
  3. 신속 스크리닝(시간에 민감한 설정): 빠른 결과를 얻거나 계산 능력이 제한된 실험실에서는 SeqSero2S를 사용해 예비 혈청형 예측을 수행합니다.
    참고: SeqSero2S 예측을 수행할 때는 기본적으로 "I_4,[5],12:i:-"를 살모넬라 티피무리움으로 해석하는 것이 권장됩니다.
  4. 발병 조사(고정확도 모드): 고해상도가 필요한 발병 추적을 위해서는 cgMLST를 사용하여 혈청형 예측을 보완하고 소스 추적을 위한 고해상도 군집 분석을 제공하는 SISTR을 사용합니다.
  5. 품질 관리 및 일관성 없는 결과 확인:
    1. 일반적인 시퀀싱 유형 균주에 대해서는 무작위 검증을 수행하세요. 비일반 카드는 20%의 검증 비율을 사용하세요. 혈청형 결과가 일관되지 않은 경우, 확실한 결과를 위해 상위 수준이나 참조 실험실로 분리주를 의뢰하십시오.
    2. 확인 분석을 위해서는 다음과 같은 여러 검증된 방법을 사용하세요: 최소 두 가지 다른 실 리코 예측 도구를 사용한 반복 유전체 분석; 최소 두 가지 다른 도구를 사용해 실 리코 예측을 반복했습니다; 고해상도 WGS 기반 방법(예: cgMLST 또는 전체 유전체 SNP 분석)을 이용한 계통발생학적 맥락화29.
    3. 이 포괄적인 증거에 대한 합의를 바탕으로 최종 혈청형을 할당하세요.
      참고: 비흔 혈청형에 대한 권장 20% 검증 비율은 유전체 도구가 비흔 혈청형에서도 높은 일치율(SISTR 대 MLST 93.3%, SISTR 대 SeqSero2S 95.0%)을 유지한다는 관찰에 근거합니다(표 1). 이 임계값은 비용 효율적이며, 일상 감시에서 유전체 도구 간 불일치 빈도가 낮다는 점을 감지할 수 있는 충분한 안전 여유를 제공합니다.

7. 통계 분석

  1. R 소프트웨어(버전 4.1.2)를 사용하여 데이터 분석을 수행합니다.
  2. 범주 변수를 백분율이 포함된 빈도로 제시합니다.
  3. 범주 데이터30에 대해 χ2 검정을 사용한 그룹을 비교하며, P-값 <0.05를 통계적으로 유의하다고 간주합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

프로토콜은 중국 남서부 지역의 315개 살모넬라 분리주를 사용하여 검증되었으며, 213개 분리주(2/3)를 훈련 세트로 사용하여 다섯 개의 WGS 기반 혈청형 예측 방법(MLST, SISTR, SeqSero, SeqSero2, SeqSero2S)을 기존 혈청형 결과 평가하는 데 사용되었습니다. 나머지 102개 분리주(1/3)는 MLST, SISTR, SeqSero2S 성과 평가를 위한 검증 세트로 사용되었습니다.

훈련 집합 분석 (n = 213)
재현성 평가: 기존 혈청형 분석은 WGS 기반 예측 방법의 다섯 가지 방법과는 제한적인 일치를 보였으며, 일치율은 60.6%에 불과했습니다(129/213). 반면, 다섯 가지 WGS 접근법 중 어느 두 개 간의 쌍별 일치는 99.1%(211/213)에 달했으며, 82.2%의 분리株(175/213...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

중국 남서부에서 315개의 살모넬라 분리주를 포함한 이 대규모 평가는 WGS 기반 혈청형 분석법이 기존 접근법에 비해 더 우수한 재현성을 입증했습니다(84.1% 대 62.9% 커버리지, P<0.001). 우리의 연구 결과는 샘플 준비와 DNA 품질 관리(섹션 1-3)의 중요한 초기 단계가 후속 신뢰성에 직접적인 영향을 미치는 포괄적인 유전체 워크플로우를 검증합니다. 프로토콜은 조립 의존 도구(4-5절)를 위해 고품질 게놈 조립체(가급적 >100 kbp)를 강조합니다. 계층화된 실행 전략은 실험실이 특정 감시 필요와 계산 자원에 따라 적절한 방법을 선택할 수 있도록 하며, 최종 분석에는 SISTR(훈련 및 검증 세트 모두에서 100% 일치), 일상 감시에는 MLST(98.1%/97.1%)/SeqSero2S(90.1%/93.1%), 신속 스크리닝(6절)에는 SeqSero2S가 권장됩니다. 이 프레임워크는 실질적인 실험실 제약을 효과적으로 해결하며, SeqS...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.

감사의 글

이 연구는 티베트 및 쓰촨 과학기술국의 보조금(XZ202301ZY0049G, 2024NSFSC0563 본부로, 2024NSFSC0033 X.P.), 쓰촨 과학기술 프로그램(2024JDRC0032 이후, Y.X.), 보건 신생산성 연구소 프로젝트(HN240302C H.Z.), 공중보건 실험실과학 학문 재활성화 프로젝트(2023SY-04 부대 H.Z.)의 지원으로 지원받았습니다. 서화보건대학/화서제4병원, 쓰촨대학교.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
바이오누머릭스 (버전 7.6)응용수학https://bionumerics.software.informer.com/7.6/MLST/혈청형 예측/계통 분석
크로마가르 살모넬라벡턴, 디킨슨 앤 컴퍼니214983선택적 살모넬라 염색 배지
Fastp (버전 0.23.0)오픈 소스https://github.com/OpenGene/fastp리드 품질 관리
일루미나 노바세쿼터 6000 시퀀싱 시스템일루미나20012850전체 게놈 시퀀싱 플랫폼
M220 집중 초음파기코바리스500295DNA 전단
Magbeads 토양용 고속 DNA 키트MP 생의학MP116560200유전체 DNA 추출 키트
마이크로소프트 엑셀 2016마이크로소프트KB5002794데이터 관리
NEXTFLEX 신속 DNA 시퀀스 키트리비티50-255-1124서열 라이브러리 준비
큐비트 2.0 형광도계써모피셔 사이언티브Q32866DNA 정량
큐비트 dsDNA 고감도 분석 키트써모피셔 사이언티브Q32851DNA 정량
R (버전 4.1.2)R 재단https://www.r-project.org/통계 컴퓨팅
살모넬라 항혈청 키트스테이튼스 혈청 연구소60898O/H-항원 검출
세크서오픈 소스https://github.com/denglab/SeqSero혈청형 예측
SeqSero2오픈 소스https://github.com/denglab/SeqSero2혈청형 예측
SeqSero2S오픈 소스https://github.com/denglab/SeqSero2s혈청형 예측
시스트르오픈 소스https://github.com/phac-nml/sistr_cmd혈청형 예측
SPAdes (버전 3.15.0)오픈 소스https://github.com/ablab/spades게놈 조립
스웜 아가르BD 생명과학211519세로타형 배양에 사용됨
TBS-380 형광광도터너 바이오시스템즈운항번호 3800-003DNA 정량
VITEK 2 컴팩트 시스템생체의학과 악용; 리외95061-768자동 미생물 식별 시스템

참고문헌

  1. GBD 2017 Non-Typhoidal Salmonella Invasive Disease Collaborators. The global burden of non-typhoidal Salmonella invasive disease: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet Infect Dis. 19 (12), 1312-1324 (2019).
  2. Selim, S. A. A comprehensive review of antibiotic susceptibility patterns in strains isolated from food. J Pure Appl Microbio. 19 (2), 818-833 (2025).
  3. Shen, Y., et al. Genomic investigation of Salmonella enterica serovar Welikade from a pediatric diarrhea case first time in Shanghai, China. BMC Genomics. 25 (1), 604(2024).
  4. Pulford, C. V., et al. Global diversity and evolution of Salmonella enterica serovar Panama: a genomic epidemiology study. Lancet Microbe. 6 (9), 101150(2025).
  5. Hong, H., et al. Genetic characterization and in silico serotyping of 62 Salmonella enterica isolated from Korean poultry operations. BMC Genomics. 26 (1), 166(2025).
  6. Kitchens, S. R., Wang, C., Price, S. B. Bridging classical methodologies in Salmonella investigation with modern technologies: a comprehensive review. Microorganisms. 12 (11), 2249(2024).
  7. Uelze, L., et al. Performance and accuracy of four open-source tools for in silico serotyping of Salmonella spp. based on whole-genome short-read sequencing data. Appl Environ Microbiol. 86 (5), e02265-e02319 (2020).
  8. Wang, B. X., et al. High-throughput fitness experiments reveal specific vulnerabilities of human-adapted Salmonella during stress and infection. Nat Genet. 56 (6), 1288-1299 (2024).
  9. Kumar, S., Kumar, Y., Kumar, G., Kumar, G., Kasana, D. A highly drug-resistant Salmonella enterica serovar Weltevreden of human origin from India and detection of its virulence factors. Indian J Microbiol. 65 (3), 1384-1394 (2025).
  10. Lu, Y., et al. Advances in whole genome sequencing: methods, tools, and applications in population genomics. Int J Mol Sci. 26 (1), 372(2025).
  11. Mukherjee, S., et al. Increasing frequencies of antibiotic resistant non-typhoidal Salmonella infections in Michigan and risk factors for disease. Front Med (Lausanne). 6, 250(2019).
  12. Yachison, C. A., et al. The validation and implications of using whole genome sequencing as a replacement for traditional serotyping for a national Salmonella reference laboratory. Front Microbiol. 8, 1044(2017).
  13. Zhang, S., et al. Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data. J Clin Microbiol. 53 (5), 1685-1692 (2015).
  14. Zhang, S., et al. SeqSero2: rapid and improved Salmonella serotype determination using whole-genome sequencing data. Appl Environ Microbiol. 85 (23), e01746-e01819 (2019).
  15. Deng, X., et al. Salmonella serotypes in the genomic era: simplified Salmonella serotype interpretation from DNA sequence data. Appl Environ Microbiol. 91 (3), e0260024(2025).
  16. Cui, Q., et al. Characterization and implications of the regionally prevalent ST8333 strains of Salmonella enterica serotype 4,[5],12:i: - China, 2017-2023. China CDC Wkly. 6 (47), 1232-1235 (2024).
  17. Yoshida, C. E., et al. The Salmonella In Silico Typing Resource (SISTR): an open web-accessible tool for rapidly typing and subtyping draft Salmonella genome assemblies. PLoS One. 11 (1), e0147101(2016).
  18. Ikeuchi, S., et al. Molecular epidemiological analysis of Salmonella Schwarzengrund isolated in Japan by newly developed multi-locus variable-number tandem repeat analysis method. Lwt. 207, 116593(2024).
  19. Kong, X., et al. Emergence of extensively drug-resistant Salmonella Kentucky ST198 in Southwest China. J Glob Antimicrob Resist. 43, 264-270 (2025).
  20. Davedow, T., et al. PulseNet international survey on the implementation of whole genome sequencing in low and middle-income countries for foodborne disease surveillance. Foodborne Pathog Dis. 19 (5), 332-340 (2022).
  21. Xian, Z., et al. Subtyping evaluation of Salmonella Enteritidis using single nucleotide polymorphism and core genome multilocus sequence typing with nanopore reads. Appl Environ Microbiol. 88 (15), e0078522(2022).
  22. Liu, C. C., Hsiao, W. W. L. Machine learning reveals the dynamic importance of accessory sequences for Salmonella outbreak clustering. mBio. 16 (3), e0265024(2025).
  23. Fourteenth external quality assessment for Salmonella typing. , European Centre for Disease Prevention and Control. ECDC, Stockholm. (2025).
  24. Gomes, E., et al. Advances in whole genome sequencing for foodborne pathogens: implications for clinical infectious disease surveillance and public health. Front Cell Infect Microbiol. 15, 1593219(2025).
  25. Zhou, L., et al. Antimicrobial resistance and genomic investigation of Salmonella isolated from retail foods in Guizhou, China. Front Microbiol. 15, 1345045(2024).
  26. Zuo, H., et al. Comparative genomic and antimicrobial resistance profiles of Salmonella strains isolated from pork and human sources in Sichuan, China. Front Microbiol. 16, 1515576(2025).
  27. Feehan, J. M., et al. Purification of high molecular weight genomic DNA from powdery mildew for long-read sequencing. J Vis Exp. (121), e55463(2017).
  28. Jolley, K. A., Bray, J. E., Maiden, M. C. J. Open-access bacterial population genomics: BIGSdb software, the PubMLST.org website and their applications. Wellcome Open Res. 3, 124(2018).
  29. Yang, L., et al. Phylogeny and divergence of the 100 most common Salmonella serovars available in the NCBI Pathogen Detection database. Front Microbiol. 16, 1547190(2025).
  30. Zuo, H., et al. High-altitude exposure decreases bone mineral density and its relationship with gut microbiota: results from the China multi-ethnic cohort (CMEC) study. Environ Res. 215 (Pt 2), 114206(2022).
  31. Arrieta-Gisasola, A., et al. Genotyping study of Salmonella 4,[5],12:i:- monophasic variant of serovar Typhimurium and characterization of the second-phase flagellar deletion by whole genome sequencing. Microorganisms. 8 (12), 2049(2020).
  32. De Sousa Violante, M., et al. Genomic diversity of Salmonella Typhimurium and its monophasic variant in pig and pork production in France. Microbiol Spectr. 12 (12), e0052624(2024).
  33. Kong, X., et al. Phenotypic and genotypic characterization of Salmonella Enteritidis isolated from two consecutive food-poisoning outbreaks in Sichuan, China. J Food Safety. 43 (1), e13015(2022).
  34. Hong, W., et al. Integrating serotyping, MLST, and phenotypic data: decoding the evolutionary drivers of Salmonella pathogenicity and drug resistance. Appl Environ Microbiol. 91 (10), e0151125(2025).
  35. Lin, A., et al. Targeted next-generation sequencing assay for direct detection and serotyping of Salmonella from enrichment. J Food Prot. 87 (4), 100256(2024).
  36. van den Berg, O. E., et al. Ongoing increase in autochthonous Salmonella Enteritidis infections, the Netherlands, June 2023 to June 2025. Euro Surveill. 30 (30), 2500536(2025).
  37. Li, X., Oladeinde, A., Rothrock, M. Jr, Chung, T. J., Ghazi Al Hakeem, W. Using core genome and machine learning for serovar prediction in Salmonella enterica subspecies I strains. FEMS Microbiol Lett. 372, fnaf040(2025).
  38. Krüger, G. I., et al. Adaptive signatures of emerging Salmonella serotypes in response to stressful conditions in the poultry industry. Lwt. 215, 117188(2025).
  39. Gou, J., et al. Microbial biomarkers and sex-associated gut microbiota characteristics of thyroid cancer. BMC Cancer. 25, 1688(2025).
  40. Meng, J., et al. Medical laboratory data-based models: opportunities, obstacles, and solutions. J Transl Med. 23 (1), 823(2025).
  41. Wu, X., et al. Evaluation of multiplex nanopore sequencing for Salmonella serotype prediction and antimicrobial resistance gene and virulence gene detection. Front Microbiol. 13, 1073057(2022).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

MLST

관련 논문