렌티바이러스 벡터를 이용한 10 kb를 초과하는 형질전환유전자를 가진 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포의 효율적 생산

요약

여기서는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 10 kb를 초과하는 큰 형질전환유전자를 가진 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생성하는 최적화된 워크플로우를 제시합니다.

초록

키메라 항원 수용체(CAR) T 세포에 다중 수용체를 공학적으로 합성하는 것은 항원 음성 재발을 방지하고 표적/종양 외 독성을 줄이는 강력한 전략으로 부상했습니다. 그러나 렌티바이러스 전형전이유전자 크기가 증가할수록 바이러스 역가와 T 세포 전도율이 크게 감소하여 다중 수용체 CAR T 세포 제조는 여전히 도전적입니다. 현재의 생산 워크플로우는 종종 저수율 생산에서 형질전환된 T 세포를 농축하기 위해 세포 분류에 의존합니다. 그러나 셀 분류 기술은 CAR T 셀의 절대 수를 늘리지 않고 이미 복잡한 제조 공정에 더 많은 복잡성을 더합니다. 따라서 이러한 한계는 다중 수용체 CAR T 세포의 임상 번역을 저해하고 차세대 면역치료제 개발을 제한합니다.

여기서는 큰 렌티바이러스 형질전환 유전자를 가진 CAR T 세포를 생성하기 위해 최적화된 상세한 단계별 생산 워크플로우를 제시합니다. 이 워크플로우를 사용하여, 우리는 다양한 형질전환 유전자 크기에서 크기에 따라 전달 효율이 증가함을 입증했으며, 10.1 kb 렌티바이러스 벡터에서 최대 14.8배까지 뚜렷한 향상이 관찰되었습니다. 중요한 점은, 이 워크플로우가 강력한 T 세포 확장을 지원하며 세포 분류가 필요 없다는 점입니다. 렌티바이러스 유전자 전달의 현재 크기 한계를 극복함으로써 이 워크플로우는 다중 수용체 CAR T 세포의 효율적인 생성을 가능하게 하여 첨단 면역치료법 개발을 촉진합니다.

서론

키메라 항원 수용체(CAR) T 세포는 면역치료 분야에 혁신을 가져왔습니다. 그러나 놀라운 성공에도 불구하고, 종양 미세환경(TME)에 의한 면역억제, 항원 음성 종양 재발, 표적/종양 외 독성 등 중요한 과제가 남아 있습니다 ^1,2. 이중 CAR, CAR 및 TCR 결합 구조체, 사이토카인 스위치 수용체와 같은 다중 합성 수용체를 가진 CAR T 세포를 공학적으로 설계하는 것은 이러한 장애물을 극복할 잠재력을 가지고 있습니다 ^3,4. 혈액암에서는 효과터 T 세포에 이중 CAR을 장착하면 CD19와 CD20⁵와 같은 두 개의 서로 다른 항원을 동시에 표적으로 할 수 있어 종양 항원 탈출 위험을 줄입니다. 고형 종양에서는 논리 게이트 CAR 발현을 가능하게 하고 표적 정밀도를 높이는 합성 Notch(synNotch) 수용체 회로를 도입함으로써 온타겟/오프 종양 독성을 완화할 수 있습니다.. 그러나 다중 수용체를 보유한 CAR T 세포 생성은 형질전환 유전자 크기의 증가로 인해 여전히 도전적입니다. 인간면역결핍바이러스(HIV) 1형에서 유래한 자가 불활성화 3세대 렌티바이러스 벡터는 현재 연구 및 임상 규모에서 CAR T 세포 생산의 금본위로 자리 잡고 있습니다^. CAR T 세포를 생성하기 위해 렌티바이러스 벡터는 장기 말단 반복(LTR) 서열이 배치된 맞춤형 CAR 발현 카세트로 설계되어 T 세포 게놈에 통합됩니다. 현재 렌티바이러스 벡터의 최대 유효 포장 용량(EPC)은 약 9.2 킬로베이스(kb) LTR-to-LTR로, 이는 HIV-1의 천연 게놈 크기에 해당합니다. 렌티바이러스 역가는 벡터 길이가 증가함에 따라 반로그적으로 감소함에^{따라 15}, 다중 수용체를 가진 대형 형질전환유전자 공학은 렌티바이러스 생산 수율을 크게 감소시키고 궁극적으로 CAR T 세포 제조를 방해한다¹⁶. 자기 또는 형광 활성화 세포 분류(각각 MACS 또는 FACS)와 같은 세포 분류 기법을 사용하여 저수율 생산에서 CAR T 세포를 농축할 수 있지만, 이러한 방법들은 CAR T 세포의 절대적인 수를 늘리지 않고 이미 복잡한 제조 공정에 더 많은 복잡성을 더합니다. 그 결과, 대형 렌티바이러스 전형유전자를 가진 CAR T 세포의 제조 문제는 전임상 연구와 임상 응용 모두에 큰 장애물로 남아 있습니다.

최근 우리는 단일 벡터 synNotch(svsNotch) 시스템¹⁷과 같은 대형 렌티바이러스 형질전환유전자를 가진 이펙터 T 세포에 최적화된 CAR T 세포 생산 워크플로우를 확립했습니다. 여기서는 광범위한 채택을 돕기 위한 단계별 프로토콜로 방법론을 자세히 설명합니다. 개념 증명으로, 우리는 5.7 kb에서 9.2 kb, 10.1 kb 범위의 렌티바이러스 형질전환유전자 크기 전반에서 크기에 따라 전달 효율이 향상됨을 입증했습니다. 전반적으로 이 최적화된 워크플로우는 전도율을 최대 14.8배까지 향상시켜 세포 분류 필요성을 없애고 10 kb를 초과하는 형질전환 크기를 가진 효과기 T 세포의 효율적인 생성이 가능해졌습니다.

프로토콜

인간 T 세포는 펜실베이니아 대학교 인간면역학 코어를 통해 조달되었으며, 이 센터는 MIATA와 펜실베이니아 대학교 윤리 지침을 준수하는 표준 운영 절차 및 샘플 수령, 처리, 냉동 및 분석을 위한 표준 운영 절차 및/또는 프로토콜을 준수하여 운영됩니다.

참고: 렌티바이러스와 CAR T 세포 생산에 대한 최적화된 워크플로우의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 주요 최적화 단계와 현재 표준 워크플로우의 비교는 표 1에 요약되어 있습니다. 모든 세포 배양은 37°C에서 5%_CO2 가 포함된 가습 인큐베이터에서 유지되었으며, RPMI-1640에 10% 열로 비활성화된 태아 소 혈청(FBS), 10 mM HEPES 완충제, 2 mM L-알라닐-L-글루타민(재료표 참조), 100 U/mL 페니실린, 100 U/mL 스트렙토마이신으로 구성된 T 세포 배지(TCM)를 사용하였습니다.

그림 1: 대형 형질전환유전자를 이용한 렌티바이러스 및 CAR T 세포 생산을 위한 최적화된 워크플로우. 렌티바이러스 생성(위)과 CAR T 세포 생성(아래)의 개식적 표현으로, 바이러스 역가와 전도 효율을 향상시키는 주요 단계와 최적화를 강조합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

		표준 워크플로우	최적화된 워크플로우
바이러스	바이러스 엔벨로프	VSV-G	코칼-G
	형질전환	L2000	L30001
	LV 수확	24시간2 + 48시간2	30-36 시간3
T-세포	선박	T25 플라스크	96웰 평평한 바닥판
	표면적/부피 비율	가변	5.12 cm2/mL4
	보조제	전혀 없습니다	SF1085
1 μg DNA당 13 μL L3000, 배지 변화 없음
106,800 x g에서 2회 원심분리, 2.5시간, 둥근 바닥관
12,300 x g에서 3회 원심분리, 원뿔형 바닥관,
4전도 후 추가 매체 보충
555 μg/mL

표 1: 표준 및 최적화된 워크플로우 비교. 향상된 워크플로우의 주요 최적화 사항, 현재 표준 워크플로우와 비교한 점들. 이 표는 롬멜 등(¹⁷)의 허가를 받아 수정하였습니다.

1. 렌티바이러스 생성

1. HEK293T 세포의 유지
   1. HEK293T 세포가 고르게 분포되어 있고 뭉치가 없으며, 50-70% 합류율을 유지하세요(일반적인 수율: T150 플라스크당 1.0-1.5 × 10개의⁷ 셀).
   2. 상원액을 흡인하고, 플라스크 상단에 실온(RT) PBS 20mL를 넣어 세포가 떨어지지 않도록 한 뒤, 세포 위에 부드럽게 돌린 후 세척액을 흡인합니다.
   3. 0.05% 트립신-EDTA 3mL를 추가하고, 플라스크를 좌우로 기울인 채 RT에서 15-30초간 배양합니다. 세포 분리 모니터링.
   4. 7mL의 냉 중의학을 추가하고, 플라스크 바닥에 세포를 재현탁시켜 단일 세포 현탁액을 만들어 50mL 튜브로 옮깁니다. 플라스크를 10-20mL 차가운 한통으로 씻고 같은 튜브에 세척물을 넣으세요.
   5. 세포를 원심분리(300 × g, 5분, 4 °C)로 제거하고, 상원액을 흡인한 후 10mL TCM에 재현탁한 후 세포 수를 세는 것입니다.
   6. T150 플라스크 내 세포를 3× 10개의⁶ 세포로 HEK293T 3 2일마다(예: 월요일과 수요일) 또는 3일마다 1× 10개의⁶ 세포를 배지하여 3일마다 배지(예: 주말 통과 시 금요일에 플래팅)에 30mL TCM을 37 °C로 예열하여 배지합니다.
2. 렌티바이러스 생산을 위한 HEK293T세포 형질전환
   참고: 2일 후 70-80% 합류율을 지속적으로 달성하는 파종 밀도를 확인하기 위한 소규모 파일럿 실험을 수행하세요. 형질HEK293T 시점에 세포 합류율이 80%를 넘지 않도록 주의하세요(논의 참조). 형질전환은 저소 혈청 최소 필수 배지 및 상업용 지방 분리 시약(L3000 및 P3000, 재료표 참조)을 사용하여 최적화되었습니다.
   1. 위에서 설명한 HEK293T 트립신 처리를 통해 세포를 채취하고, 37 °C로 예열한 30mL TCM과 함께 T150 플라스크당 4× 10개의⁶ 개 세포를 배지 배지합니다.
   2. 2일 후에는 배양물이 고르게 분포되어 있고 70-80%가 합류하는지 확인하세요.
   3. 환원혈청 최소 필수 배지 50mL를 RT에 데우고, 렌티바이러스 플라스미드를 해동한 후 부드럽게 섞은 후 빠르게 스핀합니다. 펄스 소용돌이 지방 분리 시약을 빠르게 돌려서 RT에 두세요.
   4. DNA 마스터 믹스를 준비하세요. 각 플라스크마다 다음 순서로 결합합니다: 2 mL의 환원 혈청 최소 필수 배지, 39 μg 렌티바이러스 포장 플라스미드(18 μg pTRP Gag-Pol, 18 μg pTRP RSV-Rev, 3 μg pTRP Cocal-G), 15 μg 전이 플라스미드, 108 μL P3000 시약(2 μL P3000/μg DNA). 필요에 따라 확대하고 피펫팅 손실을 반영하여 최종 양을 최소 10% 이상 늘려야 합니다. 펄스 소용돌이를 빠르게 돌려서 RT에 저장하세요.
   5. L3000 마스터 믹스를 준비하세요. 각 플라스크마다 다음 순서로 결합합니다: 1.84 mL의 환원 혈청 최소 필수 배지와 162 μL L3000(3 μL L3000/μg DNA). 필요에 따라 확대하고 피펫팅 손실을 반영하여 최종 양을 최소 10% 이상 늘려야 합니다. 펄스 소용돌이를 빠르게 돌려 RT에서 5분간 배양하세요.
   6. 5분 후, 플라스크당 2mL의 L3000 마스터 믹스를 해당 DNA 마스터 믹스에 추가하여 대략 1:2 희석을 만듭니다. 튜브 바닥부터 천천히 L3000 믹스를 넣으면서 옆면을 건드리지 마세요. 피펫팅으로 충분히 혼합한 후 RT에서 15분간 배양하세요.
   7. 그동안 각 배양액에서 6mL의 상원액을 조심스럽게 제거하고 각 플라스크에 라벨을 붙HEK293T.
   8. 15분 후, 플라스크를 위쪽으로 기울이고, 세포가 떨어지지 않도록 플라스크 상단의 상액에 4mL의 형질전환 혼합물을 천천히 방출하여 각 배양물을 트랜스펙션합니다. 천천히 피펫을 위아래로 두 번 돌려 플라스크를 원래 위치로 돌려놓고, 부드럽게 휘저은 후 인큐베이터에 다시 넣고 시간을 기록하세요.
      참고: 렌티바이러스 수확 전까지 배양 건드리지 마세요. 제조사가 L3000 형질염색 혼합물을 포함한 HEK293T 상청액을 형질전환¹⁸ 후 신선한 배양액으로 교체하라는 권고와 달리, 이 단계를 생략하면 렌티바이러스 역가가 더 높아집니다¹⁷.
3. 렌티바이러스 상원액의 수확, 농축 및 냉동
   참고: 렌티바이러스 상청액은 모든 처리 단계에서 얼음 또는 4 °C 온도에서 보관하여 분해를 방지하세요.
   주의: 렌티바이러스 벡터는 감염성 물질로 분류됩니다. 개인 보호 장비(예: 이중 장갑, 일회용 실험복) 사용을 포함한 적절한 생물안전 수칙을 준수하세요. 모든 작업 표면은 10% 표백제 후 70% 에탄올로 오염을 제거하세요. 오염된 소모품과 액체 폐기물을 생물학적 위험 폐기물로 폐기하기 전에 10% 표백제로 소독하여 기관 생물안전 지침에 따라 반드시 처리해야 합니다.
   1. 초원심분리기 장비(버킷, 원뿔 튜브, 원뿔형 어댑터)를 10% 표백제로 세척한 후 물로 씻어냅니다. 잠시 자연 건조한 후 70% 에탄올을 뿌리고 조직 배양 후드 아래에서 자연 건조합니다.
   2. 삽입된 로터를 장착한 초원심분리기를 4 °C로 예냉합니다.
   3. 렌티바이러스 상원액은 형질전환 후 30-36시간 후에 50 mL 튜브에 옮겨 채취합니다. 원심분리(500 × g, 5분, 4 °C)로 상원액을 정화한 후 0.45 μm 공극 필터로 여과한 후 얼음 위에 보관합니다.
   4. 원뿔형 어댑터를 버킷에 삽입하고, 필터링된 상청액을 원뿔형 초원심분리관으로 옮긴 뒤 버킷에 적재합니다. 반대편에 콜드 TCM을 넣어 무게 차이를 0.1g 이하로 맞추세요.
   5. 상청액을 12,300 × g, 4°C에서 밤새 초원심분리하여 농축합니다.
   6. 다음 날 아침, 양동이를 조심스럽게 꺼내 얼음 위에 보관하세요.
   7. 냉동용 드라이아이스와 알리오트용으로 라벨이 붙은 크라이오비얼이 담긴 상자를 준비하세요.
   8. 조직 배양 후드 아래에서 각 양동이를 열고 집자로 초원심분리관을 제거하세요. 각 튜브에 대해 다음과 같이 진행하세요:
   9. 상청액을 튜브 바닥에서 0.5인치 떨어진 곳까지 조심스럽게 흡입한 후 남은 액체를 6웰 플레이트에 디캔트합니다. 튜브를 살짝 두드려 잔여 액체를 제거하세요.
   10. 300 μL 냉 중의학을 추가하고, 30초간 부드럽게 재현탁한 후 현탁액을 크라이오비아로 옮깁니다.
   11. 튜브를 200 μL 냉각 중통으로 세척한 후 같은 크라이오비얼에 세척액을 넣으세요.
   12. 렌티바이러스 역가검사를 위해 60 μL을 부드럽게 혼합하여 알리코트하고(1.4단계 참조), CAR T 세포 생산을 위해 여러 개의 100 μL 알리코트를 만들고, 남은 양은 추가로 한 튜브를 추가로 만듭니다. 즉시 얼린 얼음 위에 얼려 바로 얼리세요. 장기 보관을 위해 알리코트를 -80 °C로 옮깁니다.
4. 1차 T 세포를 이용한 농축 렌티바이러스의 역가 측정
   참고: 약 1× 10⁵ 렌티바이러스 1개 희석당 T 세포가 필요합니다. 예를 들어, 여섯 개의 렌티바이러스가 8개의 희석을 각각 필요로 합니다: 6 × 8 × 1 × 10⁵ = 4.8 × 10⁶ T 세포. 피펫팅 손실을 고려하기 위해 추가 세포를 준비해야 합니다. T 세포는 항-CD3 및 항-CD28 항체로 코팅된 자기 활성화 구슬을 사용해 자극합니다(재료표 참조).
   1. T 세포 활성화 (0일차)
      1. 전제 조건: 정제된 인간 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포를 TCM에서 준비 상태로 유지하세요.
      2. CD4⁺ 와 CD8⁺ T 세포를 세고 1:1 비율로 합치세요.
      3. 활성화 비즈를 다음과 같이 세척합니다: 튜브에 1mL의 TCM을 추가하고, 비즈를 소용돌이로 재현탁한 뒤, 필요한 양을 옮겨 비즈 대 T 세포의 비율을 3:1로 만듭니다. 튜브를 자석 스탠드에 넣고 비즈가 튜브 벽을 따라 펠릿을 형성하도록 하세요. 30초 후 상청액을 조심스럽게 흡인하고, 자기 받침대에서 튜브를 분리한 뒤, 구슬을 1mL의 TCM에 다시 담가세요. 세척을 두 번 더 반복하세요.
      4. 활성화 비즈를 T 세포에 추가하고, TCM을 37°C로 예열한 상태에서 최종 농도를 1× 10⁶ cells/mL로 조절합니다.
      5. 잘 섞은 후 현탁액을 시약 저장소로 옮기세요. 멀티채널 피펫을 사용해 96웰 평바닥판의 플레이트 셀과 100 μL TCM을 웰당 투여합니다. 구슬이 가라앉지 않도록 1-2분마다 충분히 섞으세요.
   2. T 세포 전도 (1일차)
      참고: 큰 형질전환유전자(예: 9 kb LTR-to-LTR)를 가진 렌티바이러스의 경우, 1:2 연속 희석(희석하지 않은 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32)을 사용하여 6가지 조건을 준비합니다. 형질전환유전자가 더 작은 렌티바이러스(예: 7 kb LTR-to-LTR)의 경우, 1:4 연속 희석을 가진 8가지 조건이 필요합니다. 남은 우물을 미변환(UTD) 대조군으로 사용하세요.
      1. 각 농축 렌티바이러스 각각 60 μL씩 RT에서 해동한 후 얼음 위에 보관합니다.
      2. 96웰 둥근 바닥판에 희석 시리즈를 준비합니다: 상단 줄에 렌티바이러스 60 μL을 추가하고, 아래 각 줄에 30 μL 냉 TCM을 추가하며, 위에서 두 번째 줄로 30 μL을 옮기고 혼합(1:2 희석), 두 번째 줄에서 세 번째 줄로 30 μL을 옮기고 혼합합니다(1:4 희석). 총 여섯 가지 조건(희석되지 않은 상태, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32)이 준비될 때까지 계속합니다. 즉시 변환에 사용하세요.
      3. 비드 자극 후 23-26시간 동안, 다중 채널 피펫을 사용해 희석판에서 렌티바이러스 25 μL을 T 세포에 전달합니다. UTD 대조 웰에 25 μL TCM을 추가합니다.
   3. T 세포 수유 (3일차)
      1. 각 웰에 37°C로 미리 예열된 125 μL TCM을 다중 채널 피펫을 사용해 부드럽게 첨가합니다.
   4. T 세포 제거 및 유세포 분석 (5일차)
      1. 각 조건마다 1.5mL 나사 캡 튜브 3세트를 준비하고 뚜껑을 제거하세요. 세 세트 중 두 세트를 자석 스탠드에 넣으세요.
      2. 각 웰을 다시 매달아 셀을 첫 번째 튜브 세트로 옮겨 비즈가 튜브 벽을 따라 펠릿을 형성하도록 합니다. 30초 후에는 상청액을 조심스럽게 두 번째 튜브 세트로 옮기세요. 30초 기다렸다가 (구슬이 더 이상 보이지 않을 것입니다), 상청액을 세 번째 튜브로 옮겨 얼음 위에 보관하세요.
      3. 적절한 전도 마커(예: 항-CD19 CAR 또는 항-HER2 synNotch)를 염색하여 항체(재료 표 참조)와 함께 T 세포를 염색하고, 유세포분석을 통해 마커 발현을 분석합니다.
      4. 바이러스 부피와 전도율 사이의 선형 범위에 대략 대응하는 30% 미만의 조건을 식별합니다.
      5. 렌티바이러스 역가는 다음 공식으로 계산합니다:
         역가(TU/mL) = (초기 T 세포 수 x 형질 세포 비율 x 희석 인수) ÷ 바이러스 부피(mL)
         예: 렌티바이러스 스톡의 희석 비율이 1:32인 20% CAR 발현:
         (100,000 세포 x 0.2 x 32) / (0.025 mL) = 2.56 × 10⁷ TU/mL

2. CAR T 세포 생산

참고: CAR T 세포 생산의 일반적인 시작 양은 그룹당 1-5개 ×^{10개의 6T} 세포입니다. UTD 대조군의 세포 수를 50% 늘려야 하며, 이 그룹은 후속 실험에서 전이 농도를 정규화하는 데도 사용될 것입니다. 확장 기간 동안 인구가 5-6배로 증가할 것으로 예상됩니다. T 세포 전도는 블록 공중합체를 강화제로 사용하여 최적화되었으며(재료 표 참조), 96웰 평바닥판에서 특정 표면 대 부피 비율을 적용하여¹⁷.

1. 100 mg/mL 증강제 스톡 용액 제제
   1. 플라스틱 병에 5g의 공중합자 강화제를 넣고, 그 다음 45mL의 초순수수를 추가하세요. RT에서 밤새 저어주세요.
   2. 용액을 눈금이 있는 실린더에 옮기고, 초순수한 물과 함께 부피를 50mL로 조절합니다.
   3. 용액을 0.22 μm 공극 필터로 여과하여 4 °C에서 보관합니다.
2. T 세포 활성화 (0일차)
   1. 전제 조건: 정제된 인간 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포를 TCM에서 준비 상태로 유지하세요.
   2. CD4⁺ 와 CD8⁺ T 세포를 세고 1:1 비율로 합치세요.
   3. 워시 활성화 비즈는 다음과 같습니다.
      1. 튜브에 1mL TCM을 추가하고, 소용돌이로 구슬을 재현탁한 뒤, 구슬 대 T 세포의 3:1 비율을 달성할 수 있도록 필요한 양을 옮깁니다. 튜브를 자석 스탠드에 넣고 비즈가 튜브 벽을 따라 펠릿을 형성하도록 하세요.
      2. 30초 후 상청액을 조심스럽게 흡인하고, 자기 받침대에서 튜브를 분리한 뒤, 구슬을 1mL의 TCM에 다시 담가세요. 세척을 두 번 더 반복하세요.
   4. T 세포에 활성화 비즈를 추가하고 최종 농도를 1×^{10 6} cells/mL로 조절하고, TCM은 37 °C로 예열한 상태입니다.
   5. 잘 섞은 후 현탁액을 시약 저장소로 옮기세요. 멀티채널 피펫을 사용해 96웰 평바닥판의 플레이트 셀과 웰당 50 μL의 TCM을 사용합니다. 구슬이 가라앉지 않도록 1-2분마다 충분히 섞으세요.
3. T 세포 전도 (1일차)
   참고: 이전 용량 조절 결과를 바탕으로 렌티바이러스 양을 선택하여 최종 전도 수준이 그룹 간 유사성(일반적으로 20%에서 30% 사이)되도록 해야 합니다. 여러 렌티바이러스 통합을 피하려면 최대 전도 농도를 30% ≤ 유지하세요. 트랜스유니언이 큰 렌티바이러스는 일반적으로 희석되지 않은 바이러스 또는 1:4-1:8 희석 비율이 필요합니다. 렌티바이러스 잔여물을 피하기 위해 그룹 크기를 조정하세요. 각 동결-해동 주기마다 렌티바이러스 역가가 감소합니다. 준비 직후 렌티바이러스 마스터 믹스를 사용하세요.
   1. RT에서 필요한 농축 렌티바이러스를 해동한 후 얼음에 보관하세요.
   2. 예를 들어, 100 μL 증강제(100 mg/mL 스톡)와 4.9mL 중의학을 혼합하여 2 mg/mL 용량의 강화제 작업 용액을 준비합니다.
   3. 적정 결과를 바탕으로 렌티바이러스 마스터 믹스를 준비하고 최종 농도인 275 μg/mL로 증강제를 첨가합니다. 피펫팅 손실을 고려하여 최종 부피를 최소 10% 이상 늘려야 합니다. 예를 들어, 100개의 우물에서 1:16 희석을 달성하려면:
      총 부피: 100개의 웰 × 12.5 μL 렌티바이러스 × 110% = 1,375 μL
      1:16 희석: 1,375 μL / 16 = 85.9 μL 렌티바이러스
      강화제: 189 μL (최종 275 μg/mL)
      최종 마스터 믹스: TCM 1,100 μL + 렌티바이러스 85.9 μL + 강화제 189 μL = 1,375 μL
   4. 비드 자극 후 23-26시간 동안, 다중 채널 피펫을 사용해 렌티바이러스 마스터 믹스 웰당 12.5 μL의 T 세포를 전달하여 최종 증강제 농도가 55 μg/mL로 나옵니다. UTD 대조 웰에 12.5 μL TCM을 추가합니다.
4. T 세포 수유 (3일차)
   1. 각 웰에 37°C로 미리 예열된 125 μL TCM을 다중 채널 피펫을 사용해 부드럽게 첨가합니다.
5. T 세포 디비딩 (5일차)
   참고: 각 배양액마다 멸균 저장소와 50mL 튜브 3세트를 준비하세요. 전체 세척 부피는 T 세포 배양 부피의 ≤ 20%로 제한하여 세포가 8× 10⁵ cells/mL 이하로 희석되지 않도록 하세요.
   1. 각 배양물을 다채널 피펫을 사용해 멸균 저장소에 모아두고, 원래 플레이트를 TCM으로 세척한 후 세척물을 저장소에 추가하세요. 각 세포 현탁액을 첫 번째 50mL 튜브 세트로 옮깁니다.
   2. 튜브를 자석 스탠드에 넣어 비즈가 튜브 벽을 따라 펠릿을 형성하도록 하세요. 30초 후, 상청액을 조심스럽게 두 번째 튜브 세트로 옮겨 자석 스탠드에 넣으세요. 30초를 기다렸다(구슬이 더 이상 보이지 않을 것이다), 그 후 상원액을 세 번째 튜브로 옮겨 인큐베이터에 보관한다.
   3. 각 배양액을 세어 37 °C로 예열한 TCM을 사용해 8 ×^{10 5} 세포/mL로 정규화합니다. 최종 부피에 따라 적절한 배양 용기에 플레이트를 넣습니다(표 2).
   4. T 세포를 하루 동안 쉬게 한 후 7일째부터 매일 수유를 시작하세요(다음 단계 참조).
6. T 세포 영양 공급 (7일째 및 그 이후 매일 진행)
   참고: T 세포는 약 24-36시간마다 두 배가 되고, 휴식 전에 5-7 배로 증가합니다. 전기 임피던스 기반 셀 카운터 (재료표 참조)를 사용하여 T 세포 부피를 모니터링하여 냉동 보존의 최적 시점을 파악합니다.
   1. 각 배양액을 모아 잘 섞고, 세포 수를 세세요.
   2. 각 배양액을 37 °C로 예열한 TCM을 사용해 8 ×^{10 5} 세포/mL로 정규화한 후 적절한 배양 용기에 재판을 넣습니다(표 2).
   3. 평균 세포 부피가 320 μm³ 이하로 떨어질 때까지 팽창을 계속한 후 냉동 보존 단계로 넘어갑니다.
7. 유세포분석을 이용한 T 세포 전도 검증
   참고: T 세포 전도는 5일째부터 냉동 보존일까지 언제든지 평가할 수 있습니다. 확장 과정에서 발현 수준이 감소하므로, 조기 측정을 통해 플로우 사이토메트리 분석 중 음과 양의 분획이 명확히 분리될 수 있습니다.
   1. 각 배양액에서^{5T 세포} 10개× 채취하세요.
   2. 적절한 전도 마커(예: 항-CD19 CAR 또는 항-HER2 synNotch)를 염색하여 항체( 재료표 참조)와 함께 표식 발현을 분석하고 유세포분석으로 표식 발현을 분석합니다
8. T 세포 냉동 보존 (보통 10일에서 12일 사이)
   참고: 크라이옵저브는 해동 중 생존력을 높이기 위해 T 세포를 휴지 전후로 증식시킵니다. 평균 부피 320 μm³ 는 냉동 보존의 한계점이 될 수 있습니다. 세포 부피가 300 μm³ 이하로 떨어지면 T 세포는 분열을 멈추고 총 수가 감소하기 시작합니다. 모든 그룹이 냉동 보존 시점에 비슷한 부피를 가지고 있는지 확인하세요. 일부 그룹은 추가로 배양 작업을 하루가 필요할 수 있습니다. 적절한 냉동 용기(예: 무알코올 용기, 재료표 참조)를 사용하여 분당 -1 °C의 일정한 속도로 셀을 냉동합니다.
   1. 각 배양물을 적절한 튜브(예: 500mL)에 모아 세포 수를 세어 인큐베이터에 보관합니다.
   2. 셀의 총 수와 원하는 알리쿼트 수를 계산하세요.
   3. 원심분리기(300 × g, 10분, 4 °C)에서 상원액을 흡인한 후, 각 배양물을 50% 혈청 무첨가 배지, 40% 열 비활성화 FBS, 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 포함한 냉동 배지를 2× 10^{7 세포/} mL에 재현탁합니다(재료 표 참조).
   4. 세포를 냉동병(250 μL에서 1 mL, 바이알당 5-20 × 10개의⁶ 세포에 해당)으로 분리합니다. 냉동병을 냉동 용기에 넣고 -80°C에서 하룻밤 보관하세요.
   5. 크라이오비알을 액체 질소로 옮겨 장기 보관하세요.
9. T 세포 해동
   참고: 각 T 세포군에 대해 해동 후 DMSO를 희석하기 위해 37°C로 예열한 50mL TCM 튜브를 준비하세요. 플레이트를 위해 추가 TCM을 데워 넣으세요.
   1. 크라이오비얼은 37°C에서 물욕이나 따뜻한 물에서 빠르게 해동하세요.
   2. 액체가 보이면 조직 배양 후드로 이동하여 미리 데워진 TCM 500 μL를 추가하고, 부드럽게 섞은 후 세포를 50mL TCM이 담긴 준비된 튜브로 옮깁니다.
   3. 크라이오비얼을 500 μL TCM으로 세척한 후 같은 튜브에 세척물을 넣으세요.
   4. 세포를 RT에서 10분간 배양하세요.
   5. 원심분리기 셀(300 × g, 10분, 실온)에서 상원액을 흡인한 후 4 ×^{10 6} 세포/mL로 재현탁합니다.
   6. 적절한 배양 용기에 세포를 플레이트로 덮으세요(표 2).
   7. 세포를 인큐베이터에서 하룻밤 동안 쉬게 한 후 후속 실험을 진행하세요.

선박	최소 부피	최대 부피
96-우물	0.1 mL/웰*	0.25 mL/웰
48-우물	0.2 mL/웰	1 mL/웰
24-우물	0.5 mL/웰	2 mL/웰
12웰	1 mL/웰	4mL/웰
6-우물	2 mL/웰	6 mL/웰
T25 (수평)	3 mL	8 mL
T75 (수평)	8 mL	20 mL
T150 (수평)	20 mL	60 mL
* T 세포 전도 증진을 위해 배양 부피를 일시적으로 50 μL/well로 줄입니다

표 2: CAR T 세포 확장을 위한 권장 배양 양. T 세포 확장 중 일반적으로 사용되는 혈기 형식에서 최소 및 최대 배양 배지 부피.

결과

최적화된 워크플로우(그림 1)를 통해 다양한 형질전환 유전자 크기에서 달성한 향상을 입증하기 위해, 우리는 세 가지 렌티바이러스 벡터 크기를 선택했습니다: 5.7 kb(CD19 CAR), 9.2 kb(HER2-MSLN svsNotch), 10.1 kb(HER2-MSLN-CBG svsNotch)(그림 2A). 렌티바이러스는 표준 또는 최적화된 조건 중 하나에서 생성되었습니다(그림 2B: 성병 대 선택 및 표 1).

5.7 kb의 가장 작은 벡터에서는 한 생산 배치에서 T 세포 전이에서 중간 정도의 개선만이 관찰되었습니다(그림 2B: 상단, 희석되지 않은 바이러스 사용 시 73% 대 88%). 일관되게, 렌티바이러스 역가는 약 1.5배 정도 소폭 증가했다(그림 2C: 상단, 10⁸ TU/mL × 2.86 대 10⁸ TU/mL 4.35 ×). 반면, 9.2 kb 벡터는 성능이 크게 향상되었으며, 배치에 따라 최대 T 세포 전이율이 약 5.4배 또는 3.8배 증가했습니다(그림 2B: 중간 8.3%/16.6% 대 희석되지 않은 바이러스 사용 시 45.1%/63.1%), 기능적 역가는 약 3.3배 향상되었습니다(그림 2C: 중간; 3.1 × 10⁶ TU/mL 대 10.1 × 10⁶ TU/mL). 가장 강한 효과는 10.1 kb 벡터에서 나타났으며, 전도율이 약 12.4배 또는 9.8배 증가했으며(그림 2B: 아래 1.4%/1.5% 대 희석되지 않은 바이러스 사용 시 17.3%/14.7%) 기능적 역가가 약 10배 향상되었습니다(그림 2C: 아래, 0.24 × 10⁶ TU/mL 대 2.41 × 10⁶ TU/mL).

다음으로, 건강한 기증자의 T 세포를 표준 또는 최적화된 조건에서 생산된 렌티바이러스 벡터로 변환했으며, 해당 워크플로우를 사용했습니다(그림 3 및 표 1). 전이 효율을 비교하기 위해 각 워크플로우에서 동일한 양의 렌티바이러스를 사용했고, 바이러스 용량은 다중 통합 사건을 방지하기 위해 전도율을 30% 이하로 유지하도록 조정했습니다. 표준 조건과 표준 렌티바이러스 생산을 사용한 T 세포와 비교했을 때, 5.7 kb 벡터는 평균 5.1배, 9.2 kb 벡터는 13.3배, 10.1 kb 벡터는 14.8배 증가했습니다(그림 3A 및 보충표 1). 최적화된 워크플로우로 생성된 선택된 T 세포 배양은 휴식 상태에 도달할 때까지 추가로 확장되었습니다(그림 3B, C). 개체군 증가는 T 세포 기증자에 따라 5.3에서 6.7 사이였습니다(그림 3B). 일일 T 세포 부피 측정에서는 세포 잔해가 거의 없어 증식 중 독성 징후가 없음을 나타냈습니다. 냉동 보존 전에는 CAR/synNotch 수용체 발현 염색 또는 mTag-BFP2¹⁹ 형광 측정을 통해 전도율을 평가했습니다(그림 3C 및 보충 그림 1). 전도율은 5.7 kb 벡터(검은색; 1:512 렌티바이러스 희석)에서 31.2%, 9.2 kb 벡터(빨간색; 1:16 렌티바이러스 희석)에서 29.8%, 10.1 kb 벡터(파란색; 1:4 렌티바이러스 희석)에서 20.2%였습니다. 생성된 svsNotch T 세포와 CAR T 세포의 성능을 검증하는 추가 기능 데이터는 동반 연구¹⁷에서 제시됩니다. 중요하게도, 최적화된 프로토콜로 생성된 효과터 T 세포는 표준 워크플로우로 생성된 것과 비교해 개체군 증가나 T 세포 표현형에 차이가 없었다¹⁷.

그림 2: 표준 및 최적화된 워크플로우를 따른 렌티바이러스 생산. (A) 해당 형질전환유전자 크기를 가진 렌티바이러스 벡터의 개략적 개요¹⁷. 상단: CD19에 대한 CAR은 인간 신장 인자 1 알파(EF1α) 프로모터에 의해 발현되며, 총 형질전환 유전자 크기는 약 5.7 kb입니다. 중간 및 하단: HER2 합성 노치 수용체는 EF1α 프로모터에 의해 2A 자기 절단 펩타이드(P2A)를 통해 청색 형광 리포터 단백질(BFP2)(가운데) 또는 클릭딱정벌레 녹색 루시페라제(CBG)(아래)와 공동 발현됩니다. 중간선(MSLN) 표적 CAR(MSLN CAR)의 발현은 GAL4 특이적 최소 거대세포바이러스(CMV) 프로모터(GAL4-CMV)에 의해 조절됩니다. 전체 형질전환유전자 크기는 HER2-MSLN svsNotch(가운데)에서 약 9.2 kb, HER2-MSLN-CBG svsNotch(아래)는 약 10.1 kb입니다. SIN = 자가 비활성화 벡터; LTR = 긴 말단 반복 서열. (B) 표준(std) 및 최적화(opt) 조건에서 생성된 렌티바이러스의 연속 희석을 이용한 T 세포의 전도(A)를 이용한 것. 벡터당 두 개의 독립적인 생성(원형과 삼각형)을 각각 두 배치씩, 그리고 두 개의 서로 다른 T 세포 기증자가 배치당 존재합니다. T 세포 기증자 간 전도율을 평균화하였다. (C) 표준(표준, 개방형 원형) 및 최적화된 (OPT형, 폐쇄형 원형) 바이러스 생산의 기능적 역가(B)에 나타난 것. 데이터는 두 개의 독립적인 렌티바이러스 생산에서 각각 두 배치씩, 각 배치마다 두 개의 서로 다른 T 세포 기증자를 사용하여 생성되었습니다. 모든 오차 바는 평균 ± SD를 나타냅니다. 통계적 유의성은 양측 쌍 t 검정을 사용하여 계산되었습니다. *p < 0.03, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. 이 그림은 롬멜 등(¹⁷)의 허가를 받아 수정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 표준 및 최적화된 워크플로우를 적용한 CAR T 셀 생산. (A) 최적화(opt) 워크플로우가 표준(std) 워크플로우에 비해 T 세포 전도율의 폴드 증가(표 S1 참조). 데이터는 서로 다른 기증자를 이용한 두세 개의 독립적인 T 세포 확장과 두 개의 독립적인 렌티바이러스 생성에서 얻어졌습니다. (B) 최적화된 워크플로우를 사용하여 생성된 T 세포 확장의 인구 증가. 각 벡터마다 서로 다른 정상 공여자(ND)로부터 두 개의 독립적인 T 세포 확장이 나타나며, 각각 별도의 렌티바이러스 생성을 사용합니다. (C) 확장 효과터 T 세포에서 7일차(10.1 kb) 또는 10일차(5.7 kb 및 9.2 kb)에 CAR, BFP2, SynNotch 수용체 발현을 보여주는 유세포검사 플롯( 보조 그림 1 참조). 모든 오차 바는 평균 ± SD를 나타냅니다. 통계적 유의성은 양측 쌍 t 검정을 사용하여 계산하였습니다. *p < 0.03, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. 이 그림은 롬멜 등(¹⁷)의 허가를 받아 수정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 1: CAR, synNotch 수용체, BFP2의 발현 평가를 위한 게이팅 전략, 그림 3C와 관련됨. 확장된 T 세포 배양에서 CAR, synNotch, BFP2 발현을 결정하는 데 사용된 게이팅 전략을 보여주는 대표적인 유세포측 플롯. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 표 1: 그림 3A와 관련된 개별 T 세포 확장에 걸친 전도율. 표준 및 최적화된 워크플로우로 생성된 T 세포 확장의 전도율. 이 표는 롬멜 등(¹⁷)의 허가를 받아 수정하였습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

여기서는 svsNotch T 세포와 같은 큰 렌티바이러스 형질전환유전자를 가진 CAR T 세포의 최적화된 생산 워크플로우를 단계별로 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 이 워크플로우는 세포 분류의 필요성을 없애고, 대형 렌티바이러스 형질전환유전자를 가진 효과기 T 세포의 효율적인 생성을 가능하게 합니다. 이 워크플로우를 사용하여 우리는 9-10 kb의 렌티바이러스 형질전환유전자와 최대 60-70%(9 kb) 또는 15-20%(10 kb)의 전이도율을 가진 효과기 T 세포를 일상적으로 생산합니다.

낮은 바이러스 역가나 전이율을 문제 해결할 때 몇 가지 주요 요소를 고려해야 합니다. 첫째, HEK293T 셀의 품질입니다. 세포HEK293T 일정한 일정으로 통과되어야 하며, 50-70% 합류율을 넘지 않도록 하는 것이 중요합니다. 우리의 경험에 따르면, 이전에 과도하게 성장했던 HEK293T 세포에서 생성된 렌티바이러스 벡터는 형태학적으로 회복된 것처럼 보여도 역가가 감소하는 경향을 보입니다. 우리는 30번 통과 이후의 HEK293T 세포를 사용해 고항가 바이러스 벡터를 일상적으로 생성하는데, 이는 세포가 적절히 유지될 경우 더 높은 통과 수가 허용됨을 나타냅니다. 세포 품질 외에도 형질전환 시점에 HEK293T 세포가 합류하는 것도 매우 중요한 요소입니다. 우리는 높은 수합률(90-100%)에서 HEK293T 세포를 형질인화할 때 렌티바이러스 역가가 감소하는 것을 관찰했습니다.

둘째, 이 프로토콜에서 명시된 시기, 농도, 부피를 엄격히 준수하는 것이 필수적이며, 이전 연구에서 많은 단계가 철저히 최적화되었습니다¹⁷. 예를 들어, 공중합자 강화제( 재료표 참조)는 독성 검출 없이 전도율을 극대화하도록 조절되었습니다. 농도가 높아질수록 전도가 더 증가할 수 있지만, 독성을 유발하고 T 세포 확장도 감소시킵니다. 마찬가지로, 권장 30-36시간 간격(예: 24시간 또는 48시간)을 벗어나 렌티바이러스 상청액을 채취하면 해당 시간 실험¹⁷에서 낮은 역가가 나타났습니다. 반면, 1:1 CD4-CD8 T 세포 비율을 엄격히 준수할 필요는 없으며, 변화된 CD4/CD8 분포를 가진 벌크 T 세포를 사용할 때 전도 효율에 유의미한 차이가 관찰되지 않았습니다. 하지만 이 비율에서 벗어나면 팽창 기간과 인구 두 배 증가 횟수에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 우리는 일반적으로 실험 간 일관성을 위해 CD4 대 CD8 비율을 1:1로 유지합니다.

향후 최적화 노력은 특수 배지 제형이나 맞춤형 사이토카인 요법과 같이 더 큰 렌티바이러스 형질전환유전자를 이용해 T 세포 전도를 개선하는 추가 전략에 집중할 수 있습니다. 이 워크플로우를 자연 살해 세포와 대식세포 등 다른 면역 세포 유형으로 확장하면 치료 응용 분야가 넓어질 수 있습니다. 중요한 점은, 이 워크플로우의 임상 번역이 렌티바이러스 변형 세포 치료 제품의 제조 비용 절감에도 도움이 될 수 있다는 것입니다.

여기에 제시된 포괄적인 단계별 프로토콜은 대형 렌티바이러스 형질전환유전자를 가진 CAR T 세포를 생산하는 실용적 참고 자료를 제공하며, 고형암과 혈액암에 대한 새로운 CAR T 세포 개발의 기초를 마련합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
항체 - 항-CD19 CAR	사이토아트	200101	Anti-CD19 CAR (이디오타입), AF647 공액, 1:100
항체 - 항HER2 신노치	R& D 시스템즈	FAB95471G	항-트라스투주맙(특징형), AF488-결합, 1:80
표백제	클로록스	살균 표백제
셀 냉동 용기	생체 시시전	FTS30	무알코올
원심분리기 (대형)	써모 사이언티픽	레전드 XTR
원심분리기 (미니)	피셔 사이언티브	스프라우트 플러스
원심분리기 (소형 )	에펜도르프	5425
컬터 카운터	벡먼 쿨터	멀티사이즈 4	전기 임피던스 기반 셀 카운터로 셀 수와 셀 부피를 결정합니다
냉동 튜브	써모 사이언티픽	375418
디메틸 설폭사이드 (DMSO)	세포 신호 전달 기술	12611P
DPBS (칼슘, 마그네슘 없음)	깁코	14190-136
다이나비즈 (CD3/CD28)	깁코	40203D	T 세포 자극에 사용되는 활성화 구슬
에탄올	디콘 연구소	200 프루프
FBS (열 비활성화)	아반토르 (VWR)	97068-091
유세포계	BD	LSRFortessa (647177)
냉동고 (-80도 & 도; C)	파나소닉	MDFU76VA-PA
냉동고 (액체 질소)	MVE HEco	1500-190
냉장고 (4 & deg; C)	피셔 사이언티브	아이소템
장갑 (니트릴)	할야드	55082
글루타맥스 보충제	깁코	35050-061	L-알라닐-L-글루타민
HEPES (1 남성)	깁코	15630-080
얼음 (건식)	N.A.	N.A.
얼음 (습식)	N.A.	N.A.
아이스 버킷	피셔 사이언티브	07-210-108
실험복 (일회용)	카플러	PVS112WH-MD
렌티바이럴 패키징 플라스미드	독점	N.A.	pTRP 가그-폴, pTRP RSV-레브, pTRP 코칼-G
렌티바이럴 이식 플라스미드	독점	N.A.	예: pTRPE svsNotch
리포펙타민 3000 형질전환 시약	인비트로젠	L3000015	상업용 지방 반응 시약; 리포펙타민 3000(L3000)과 그 증강제 시약(P3000)을 포함하고 있습니다.
마그네틱 스탠드 (대형)	스템셀	이지 18103년 9월	5 mL/15 mL의 경우
자기 스탠드 (작음)	인비트로젠	다이나매그-2 12321D	1.5 mL 튜브의 경우
자기 교반봉	피셔 사이언티브	14-513-82	스티어바 키트
자기 교반 플랫폼	써모 사이언티픽	S88857100
측정 실린더 (100 mL)	VWR	76019-316
MQ 물	머크	Q-POD	울트라푸에수; Millipak 40 익스프레스 최종 필터, 0.22 마이크론 (MPGP04001) 사용
멀티채널 피펫	피셔 사이언티브	댓글 참고하세요	30-300 및 마이크로; L:  FBE1200300; 5-50 및 마이크로; L:  FBE1200050
옵티-MEM (L-글루타민, 페놀 레드 포함)	깁코	31985-070	DNA 형질전환에 사용되는 환원 혈청 최소 필수 배지
페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL, 10,000 및 미량; g/mL)	깁코	15140-122
피펫	피셔브랜드	댓글 참고하세요	50 mL: 13-678-11F; 25 mL: 13-678-11; 10 mL: 13-678-11E; 5 mL: 13-678-11D
피펫(흡입)	팔콘	357558	2 mL
피펫	길슨	피펫맨 P10/P20/P200/P1000
피펫 컨트롤러	히르슈만	피페투스 Z314951
피펫 팁	토마스 사이언티픽	댓글 참고하세요	1000 & 마이크로; L: 1159M42; 200 & 마이크로; L: 1159M40; 20 & 마이크로; L: 1159M43; 10 & 마이크로; L: 1159M41
플라스틱 저장병 (500 mL)	코닝	430282
시약 저장소	셀트리트	3054-2007
RPMI-1640 (L-글루타민, 페놀 레드 포함)	깁코	11875-085
규모	오하우스	개척자	최소 정확도는 0.1g이어야 합니다
스테리플립 필터 (0.45 & 마이크로; m)	밀리포어	SE1M003M00
신페론 F 108 (SF108)	시그마-올드리치	07579-250G-F	T 세포 전도 증진을 위해 사용되는 블록 공중합체
조직 배양 플라스크 - T150	코닝	430825
조직 배양 플라스크 - T25	코닝	430639
조직 배양 플라스크 - T75	코닝	430641U
조직 배양 후드	써모 사이언티픽	1300 시리즈 A2
조직 배양 인큐베이터	써모 사이언티픽	헤라셀 150i
조직 배양 플레이트 - 6-웰	코닝	3516
조직 배양판 - 96웰 평바닥	팔콘	353072
조직 배양 플레이트 - 96웰 둥근 바닥 및 nbsp;	팔콘	353077
트립신-EDTA (0.05%)	깁코	25300-054
튜브 - 1.5ml 스크류 캡	사르스테트	72692005
튜브 - 15 mL	팔콘	352099
튜브 - 5 mL	MSP	62-1028-2
튜브 - 500 mL	코닝	431123
튜브 - 50ml	팔콘	352098
초원심분리기	벡먼 쿨터	옵티마 XPN-100
버킷이 장착된 초원심분리기 로터	벡먼 쿨터	SW 32 Ti
초원심분리기 튜브 어댑터 (원뿔형 튜브용)	세튼 사이언티픽	4230
초원심분리기 튜브(원뿔형)	세튼 사이언티픽	5067
소용돌이	피셔 사이언티브	02215414
수욕 (37 & deg; C)	피셔 사이언티브	아이소온도 210	물 대신 Lab Amor Beads(Gibco)와 함께 사용했습니다
엑스-비보-15	론자	04-418Q	T 세포 냉동에 사용되는 혈청 없는 배지