폐섬유증의 재현 가능하고 최소 침습 마우스 모델을 위한 정교한 에어로졸 기반 기관내 블레오마이신 전달 방법

요약

여기서는 기관을 통해 전달된 에어로졸화된 블레오마이신을 이용해 쥐의 폐섬유증을 모델링하는 프로토콜을 제시합니다. 이 최적화된 방법은 수술 절개 없이도 균일하고 정량적이며 정확한 전달을 가능하게 하여 블레오마이신 유발 섬유증의 재현성과 신뢰성을 높입니다.

초록

폐섬유증은 폐 실질에 섬유화된 흉터 조직이 점진적으로 침착되어 가스 교환이 심각하게 손상되는 것이 특징입니다. 이 질환은 특히 예후가 매우 좋지 않은 특발성 폐섬유증을 포함한 만성 간질성 폐 질환의 스펙트럼의 근원을 가지고 있습니다. 효과적인 치료법이 부족한 상황에서, 견고한 마우스 모델은 근본적인 병리학적 기전을 밝히고 새로운 항섬유화 중재를 평가하는 데 매우 중요합니다. 블레오마이신 유도 폐섬유증은 가장 널리 사용되는 실험 모델로 남아 있습니다. 쥐에서 일반적인 투여 경로로는 정맥 주사 및 복막 주사, 침습적 개복 기관 주입, 비침습적 기관 점적 투여가 있습니다. 그러나 침습적 수술법은 종종 2차 조직 손상을 일으켜 모델 재현성과 안정성을 저해할 수 있습니다. 반대로 비침습적 기관 드립은 폐엽 전체에 블레오마이신이 고르지 않게 분포하게 만들고, 질식 위험을 초래하여 재현성을 줄이고 기술적 어려움을 증가시킵니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 운영적으로 더 단순하고 최소 침습적이며 재현성이 높고 윤리적으로 우수한 정제된 에어로졸 기관절 내 전달 방법이 개발되어 동물의 고통을 크게 줄여줍니다. 소동물 후두경을 사용해 눈 성문을 직접 관찰한 후, 쥐 기관 직경보다 훨씬 좁은 특수 에어로졸라이징 바늘을 기관에 삽입합니다. 블레오마이신 용액은 정밀하게 조절된 압력 하에 공급되어 미세한 에어로졸을 생성합니다. 이로 인해 병원제가 폐 실질에 균일하고 효율적으로 분포할 수 있습니다. 또한, 적절한 기관지에 바늘을 꽂아 왼쪽 또는 오른쪽 폐를 선택적으로 겨냥할 수 있습니다. 이 최적화된 모델의 용량-반응 관계는 폐 기능, 조직병리학적 증상, 폐 하이드록시프롤린 함량의 변화를 체계적으로 모니터링함으로써 광범위하게 특징지어집니다. 이 정교한 실험 프로토콜은 실험실 표준화를 촉진하여 궁극적으로 새로운 항섬유화 치료제의 개발과 전임상 검증을 가속화할 것으로 기대됩니다.

서론

폐섬유증(PF)은 진행성 폐 실질 손상과 비정상 수리가 특징인 치명적인 질환군으로, 특발성 폐섬유증(IPF)이 30%-40%를 차지합니다. 환자의 진단 중위 연령은 65세이며, 60세 이상이 60세 이상입니다. ². 전 세계적으로 고령화가 심화됨에 따라 IPF 발생률은 해마다 증가하고 있으며, 전 세계 IPF 발생률은 연간 3-9/100,000에 달합니다. 미국에서 진행된 연구에 따르면 65세 이상 인구를 대상으로 한 연구에서는 연간 93.7/100,000/^3,4로 급증했습니다.

역사적으로 개발된 최초의 폐섬유증 모델은 블레오마이신 유도 모델로, 학계에서 자주 사용되며, 가장 잘 특성화^{되고 현재 가장} 널리 사용되는 동물 모델입니다. 이 모델은 폐 염증, 상피 손상, 섬유아세포 증식, 과도한 세포외기질 증식(ECM) 침착 등 IPF 및 기타 섬유화된 ILD의 많은 특징을 재현합니다⁶. 또한, 블레오마이신 투여의 용량과 빈도에 따라 급성 및 만성 폐섬유증을 모델링할 수 있습니다. 블레오마이신 노출 후 5-7일 이내에 폐가 급성 염증기에 진입하고, 7일째경부터 섬유화성 단계가 시작된다고 보고된 바 있습니다. 21일째에는 뚜렷한 섬유화 재형성이 관찰되어, 모델이 초기 염증 반응과 후기 단계 섬유화 병리를 시간적으로 정의된 방식으로 재현할 수 있게 합니다⁷(그림 1A). 이를 통해 초기 손상부터 섬유화 단계까지의 전체 질병 과정을 연구할 수 있으며, 이는 모든 단계에서 약물 개발과 기전 연구에 매우 중요합니다 ^8,9.

블레오마이신 모델링 경로는 다양하며, 기관내, 비강, 정맥, 복막 내 경로를 포함하여 국소 또는 전신적으로 투여될 수 있습니다. 가장 흔히 사용되는 방법은 기관내주사입니다. 단점은 마우스에 절개가 생기며, 모델링된 마우스의 생존율에 영향을 준다는 점입니다. 이후¹¹번 쥐에서 기관 삽관 및 점적 주사를 위해 인상 바늘을 사용할 수 있도록 개선이 이루어졌습니다. 하지만 주사기로 밀어내는 약물은 폐 내에서 차단 형태로만 분포할 수 있어, 각 폐엽에서 블레오마이신이 고르게 분포하여 국소 과밀도를 유발하고 마우스 모델의 안정성에 영향을 줄 수 있습니다. 또한 챔버 네뷸라이저 카트리지가 블레오마이신 전달에 사용되었으나, 각 마우스에 흡입된 블레오마이신 에어로졸의 양을 정확히 측정할 수 없으며, 단일 유도 시간은¹²라는 긴 시간입니다. 따라서 폐섬유증의 재현 가능하고 최소 침습적인 마우스 모델을 위해 정제된 에어로졸 기반 기관내 블레오마이신 전달 방법이 개발되었습니다. 블레오마이신은 에어로졸 처리되어 폐 내 균일한 확산과 침착을 가능하게 하여 폐질환 병리를 더 잘 재현합니다. 이 방법의 등장이 폐섬유증을 완전히 치료할 수 있는 약물 연구를 가속화할 것으로 기대됩니다.

프로토콜

모든 동물 시술은 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)가 승인한 기관 지침에 따라 진행되었습니다. 실험 전반에 걸쳐 적절한 동물 복지 조치가 시행되었습니다. 6-8주 된 수컷 C57BL/6마리 마우스, 약 25g을 실험에 선정했습니다. 재료표 에는 이 연구에 사용된 모든 동물, 시약, 장비와 그 상업적 출처가 나열되어 있습니다.

1. 동물 선택 및 적응

1. 모든 쥐는 병원체가 없는 특정 환경에서 12시간 빛과 어둠 주기를 유지하고, 자유롭게 먹이와 물을 섭취할 수 있도록 하세요.
2. 에어로졸 기반 모델을 시작하기 전에 5-7일간 생쥐를 시설에 적응시킵니다.

2. 블레오마이신 용액의 준비

주의: 블레오마이신은 세포독성 항종양제입니다. 인증된 생물안전 캐비닛 안에서 적절한 개인 보호 장비를 착용한 채 모든 단계를 수행하세요.

1. 멸균 1mL 주사기를 사용해 멸균 0.9% 염화나트륨 3mL를 추출하여 15 U의 블레오마이신 염산염 바이알에 주입합니다.
2. 분말이 완전히 녹을 때까지 부드럽게 돌려 5 U/mL 스톡 용액을 만듭니다.
3. 스톡 용액을 멸균 1.5mL 마이크로 원심분리관에 분할 단위로 담아주세요. 멸균 식염수로 희석하여 3.75 U/mL와 2.5 U/mL의 작업 용액을 준비합니다.
   참고: 25g 마우스의 경우 이 농도는 각각 7.5 U/kg과 5 U/kg의 용량에 해당합니다. 마우스 무게가 변하면 농도를 조절하세요.
4. 작업 용액은 최대 1주일간 4°C에서 보관하며, 최대 1개월간 -80°C에서 보관합니다. 사용 전에 해동하고 실온에 두세요.

3. 에어로졸 기반 기관내 블레오마이신 전달

1. 마취 준비 및 투여
   1. 마취제 작용액을 0.1g 펜토바르비탈 나트륨을 멸균 생리식염수 10mL에 녹여 준비합니다. 0.22 μm PES 멤브레인 필터를 사용해 여과합니다. 용액은 빛이 차단된 환경에서 4°C에 보관하고 준비 후 3일 이내에 사용하세요.
   2. 1mL 주사기와 26게이지 바늘을 사용하여 복막 내 주사로 펜토바르비탈 나트륨을 주입하고, 체중 60mg/kg 용량으로 투여합니다. 마취 깊이나 지속 시간이 부족할 경우, 담당 수의사의 지도 아래 동물 반응에 따라 용량을 조절하세요.
   3. 주사 후 몇 분 후 발가락을 단단히 집어 마취 깊이를 평가하고 철단 반사가 없음을 확인한 후 후속 시술을 진행합니다.
2. 에어로졸 전달 장치 준비
   1. 에어로졸 전달 장치를 준비하여 네뷸라이징 바늘, 네뷸라이징 주사기, 투여 기둥이 모두 존재하고 멸균되도록 하세요(그림 1B).
   2. 에어로졸 투여 주사기를 멸균 생리식염수에 담가. 천천히 액체를 흡입하고 8초간 멈추세요. 액체를 빠르게 배출하세요. 이 과정을 세 번 반복해서 시스템을 채우고 세척하세요.
   3. 최종 배출 후에는 주사기에 식염수를 다시 채워주세요. 에어로졸라이징 바늘을 부착하여 접합부에 식염수가 채워지도록 하세요.
   4. 조립된 바늘을 식염수에 담근 후 흡입-정지-배출 과정을 세 번 더 반복하여 기포를 제거하세요.
      참고: 준비 여부를 확인하기 위해 어두운 배경에 식염수를 배출하세요. 빠르게 배출된 식염수가 어두운 배경 위에 부채꼴 모양의 안개를 형성하도록 하세요.
3. 기관내 에어로졸 전달 절차
   1. 에어로졸 바늘에 블레오마이신 작동 용액을 3번 흡입하고 8초 휴식을 취해 배출하세요.
   2. 50 μL 필러 위에 25 μL 도싱 필러를 삽입하여 부피를 보정합니다. 필요한 부피(50 μL)를 흡입합니다. 과잉 액체를 배출하세요.
      참고: 이 투여 구성은 인간의 오류를 최소화하여 일관된 전달을 보장합니다.
   3. 마취된 쥐를 삽관 플랫폼에 올려놓고 윗 앞니를 걸고 팔다리를 고정시키기 위해 테이프로 고정합니다(그림 1C).
      참고: 리드미컬한 가슴 움직임을 확인하세요. 동물이 활동적으로 보이면 추가 마취 용량을 투여하세요.
   4. 곡선형 겸자를 사용해 혀를 부드럽게 당겨 나가세요. 소동물 후두경을 삽입하여 성문을 노출시킵니다(그림 1D).
   5. 에어로졸 바늘을 성문을 수직으로 통과시켜 삽입합니다. 블레오마이신 에어로졸을 빠르게 전달하세요(그림 1E).
      참고: 바늘 끝을 원하는 폐 쪽으로 각도를 맞춰 목표 전달을 위해 주세요. 외상을 막기 위해 너무 깊게 삽입하지 마세요. 네뷸라이저 바늘 끝은 쥐의 기관의 분기점(첫 번째 분기점)에 가까이 위치해야 하며, 최상의 모델링 효과를 얻어야 합니다. 끝을 기관 중앙에만 삽입하면 에어로졸이 기관벽에만 닿아 큰 물방울을 형성하고 기침하거나 삼킬 수 있습니다. 끝이 기관 분기점에 너무 가까우면 기관 손상 위험이 있습니다.

4. 시술 후 회복

1. 체온을 유지하기 위해 마우스를 온열 패드 위에 올려놓으세요. 쥐가 마취에서 회복할 때까지(보통 1-2시간) 계속 관찰하세요.
2. 발가락을 꼬집어 반사 신경을 확인하고 쥐가 살아있는지 확인하세요.
3. 체중, 활동량, 그루밍, 호흡기 징후를 포함하여 21일간 매일 임상 모니터링을 수행하세요.
4. 다음 기준 중 하나라도 충족되면 동물을 안락사하십시오: (i) >치료 전 기준치에 비해 체중 20% 감소, 또는 ≥15% 감소와 기타 임상적 고통 징후; (ii) 안정 시 지속적이고 심한 호흡 곤란(힘겹거나 복부 호흡, 뚜렷한 빈호흡 또는 서호흡, 코 팽창, 입 벌린 호흡), 사지 청색증 유무; (iii) 음식이나 물을 구할 수 없거나, 뚜렷한 무기력, 또는 쇠약한 외모(다루어도 반응 없음 및/또는 올바른 방향 감각 반사 상실); 또는 (iv) 주치의 수의사가 판단한 심한 탈수, 저체온증 또는 돌이킬 수 없는 악화의 다른 징후. 이러한 인도적 종점에 도달하면, 동물을 펜토바르비탈 나트륨(≥150 mg/kg, i.p.) 과다복용으로 안락사시키고, 이어서 2차 신체적 방법(예: 경추 탈구)을 시행하여 사망을 보장하고 통증과 고통을 최소화합니다.

5. 말단 폐 기능 측정 및 조직 수집

1. 21일째에는 같은 마취 용액 90 mg/kg으로 마취하여 깊은 마취를 유도하고 호흡을 억제합니다.
2. 발가락 집기 로 완전 마취 확인. 기관을 노출시키기 위해 피부를 자르고 근육을 분리하세요.
3. 기관에 작은 경사 절개를 하고 삽관 바늘을 삽입하세요. 수술용 결찰로 고정하세요.
4. 마우스를 컴퓨터 제어 소형 동물 폐 기계용 인공호흡기로 옮겨. 기계적 환기를 시작하고 자연 호흡을 방지하세요. 인공호흡기 시스템을 이용해 폐 기능 지표를 측정하세요.
5. 폐가 하얗게 변할 때까지 5-10mL 멸균 식염수로 우심실을 관류하세요.
6. 폐 전체를 해부하세요. 왼쪽 폐를 중립 완충 포르말린에 24시간 고정하세요.
7. 고정된 폐 조직을 파라핀에 삽입하고 절절 처리한 후 H&E 염색, 매손 염색, COL1A1과 α-SMA에 대한 면역조직화학적 염색을 수행합니다.
8. 오른쪽 폐를 2mL 균질화 튜브에 비즈를 넣으세요. 하이드록시프롤린 키트 프로토콜에 따라 물을 추가하세요. 균질화하고 분석으로 진행하세요.

결과

본 연구에서는 블레오마이신을 이용해 쥐에서 폐섬유증을 유도하는 에어로졸 기반 기관지 내 전달 방법을 제안했습니다. 예비 실험에서는 녹색 염료를 에어로졸화하여 다양한 쥐의 폐에 투여했습니다. 염료는 폐 전반에 걸쳐 점점 분포 패턴을 보였으며, 이는 에어로졸 기반 기관지 내 투여가 모든 폐엽에 균일하게 확산되었음을 나타냈다(그림 1F). 그림 1F 에 표시된 녹색 잉크 전달은 이후 블레오마이신 투여 시 사용된 것과 동일한 절차를 사용했습니다.

주요 실험에서는 쥐들에게 5 U/kg 또는 7.5 U/kg 체중의 에어로졸 블레오마이신을 투여하거나 정상 식염수를 가짜 대조군으로 투여했습니다. 21일째에는 기관에서 승인한 프로토콜에 따라 동물을 안락사시켰고, 이후 앞서 설명한 폐 기능 검사와 폐 조직 채취가 이루어졌습니다(

토론

본 연구는 쥐에서 블레오마이신 유발 폐섬유증에 대한 최적화된 비침습적 기관 분비 모델을 제안하였습니다. 소동물 후두경을 사용해 성문을 찾았고, 작은 분비 바늘을 쥐의 기도에 삽입했습니다. 압력을 수동으로 가해 약물을 폐 안으로 네뷸리화하여 비침습적 주사에 사용되는 유지 바늘과 관련된 불편함과 질식을 줄였다^13,14. 또한, 이 에어로졸은 쥐의 폐엽 전반에 반점이 있는 패턴으로 균일하게 분포할 수 있습니다. 이 모델은 3R 원리와 실험적 안정성을 균형 있게 유지하여, 쥐에게 추가 피해를 주지 않으면서도 블레오마이신 용량과 폐 분포를 정밀하게 조절하여 폐섬유증 전임상 약물 개발에 더 신뢰할 수 있는 도구를 제공합니다¹⁵.

이 모델의 장점은 기관 수술의 복잡성을 피하면서 에어로졸...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.22 & mu; M 폴리에테르설폰 주사기 필터	세포과학	CSTPE3320
일회용 주사기 1mL	BD	300481
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브	서비스바이오	EP-150-M
2.0 mL 강화 용해관	서비스바이오	HT-200-M
4 & deg; C 실험실 냉장고	메이링	BCD-402WPCX
50 mL 원뿔형 원심분리기 튜브	서비스바이오	EP-5001-J
-80 & 도; C 초저온 냉동고	하이얼 바이오메디컬	DW-86L828J
절대 에탄올	시노팜 화학 시약 주식회사	100092683
산성 분별 해법	서비스바이오	G1039
소동물 삽관용 에어로졸 마이크로스프레이어	상하이 위옌 인스트루먼트 유한회사	얀-30012
기본 외과 기구 세트	상하이 위옌 인스트루먼트 유한회사	얀-21A3
블레오마이신 염화 용액	한후이 제약유한회사	H20055883
블루잉 시약	서비스바이오	G1040
컴퓨터 제어 소형 동물 폐 기계 인공호흡기	EMKA 바이오텍 베이징 유한회사.	FX-2
전기 절연 테이프	3M	1500
이오신 Y 염색 용액	주하이 바소 바이오테크 유한회사	BA4022
녹색 표시 잉크	파일럿	치쿠린
헤마톡실린 염색 용액	서비스바이오	G1004
하이드록시프롤린 정량 분석 키트	앱캠	AB222941
층류 후드	HDL	DL-CJ-1N
소동물 시술용 후두경	선전 비리드 생물학 기술 주식회사	DXSHJ0
광학 현미경	니콘	E100
저독성 탈왁스 용액	서비스바이오	G1128
매송의 트리크롬 스테인 키트	주하이 바소 바이오테크 유한회사	BA4079B
흡광도 검출이 가능한 마이크로플레이트 리더	애질런트	시너지 H1
중성 완충 포르말린	서비스바이오	G1101-3ML
중성 장착 매체	시노팜 화학 시약 주식회사	10004160
재조합 토끼 단일클론 항-COL1A1 항체	화비오	HA722517
냉장 원심분리기	에펜도르프	5424R
RNase 없는 물	제너럴바이오올	TYJC002
소동물 기관삽관 플랫폼	상하이 위옌 인스트루먼트 유한회사	CG-02M
멸균 0.9% 염화나트륨 용액	중국 오츠카 제약 주식회사	H12020024
조직 균질화	서비스바이오	KZ-III
자일렌	시노팜 화학 시약 주식회사	10023418
지르코니아 분쇄 비즈	서비스바이오	G0203