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방법 논문

생 체 내 레이저 공초점 이미징을 통한 피하 결합 조직의 침술 유발 역학의 실시간 모니터링

560 조회수

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DOI:

10.3791/69173

⸱

2025년 10월 10일

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1Institute of Acupuncture and Moxibustion, Jianghan University, 2School of Medicine, Jianghan University, 3Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 연구는 살아있는 쥐에서 혈관 확장 및 콜라겐 리모델링과 같은 침술 유발 형태학적 역학을 추적하기 위한 실시간 방법으로 생 체 내 레이저 공초점 이미징을 확립했습니다. 플루오레세인 나트륨 표지를 사용하는 이 접근 방식은 즉각적이고 지연된 조직 반응을 모두 포착하여 침술 및 뜸을 포함한 물리 치료를 정량적으로 평가하기 위한 새로운 도구를 제공합니다.

초록

침술 효과의 실시간 동적 모니터링은 침술의 생물학적 메커니즘을 밝히는 데 중요하지만 전통적인 조직학적 방법은 살아있는 미세 환경에서 일시적인 반응을 포착하지 못합니다. 여기에서 우리는 침술 개입 후 국소 조직의 형태학적 변화를 고해상도로 실시간으로 관찰할 수 있도록 생 체 내 레이저 공초점 이미징을 기반으로 하는 방법론적 프레임워크를 구축했습니다. 쥐에게 플루오레세인 나트륨을 정맥 주사한 후, 침술 중에 미세순환 및 세포외 기질(예: 콜라겐 섬유 배열)의 동적 변화를 추적했습니다. 그 결과 이 방법은 침술에 의해 유발된 즉각적(예: 혈관 확장) 및 지연(예: 염증 반응) 조직 반응을 0.5μm의 공간 해상도와 3.5fps의 시간 해상도로 명확하게 구별하는 것으로 나타났습니다. 후속 정량 분석을 통해 형태학적 매개변수를 객관적으로 측정할 수 있었습니다. 이 연구에서 설명한 이 프로토콜은 침술 메커니즘의 생체 내 연구를 위한 시각화 도구를 제공하고 다른 물리적 자극(예: 뜸)의 효과를 평가하기 위한 기술 참조 역할을 합니다.

서론

전통 의학의 초석인 침술은 복잡한 조직 수준 반응을 통해 치료 효과를 발휘합니다 1,2,3,4. 그러나 기계론적 통찰력은 정적 스냅샷을 캡처하지만 살아있는 조직에서 형태학적 적응(예: 혈관 조절, 세포외 기질 리모델링)의 실시간 역학을 해결하지 못하는 기존 조직학에 의해 제한되어 있습니다5. 생체 내 현미경은 동적 이미징 잠재력을 제공하지만 침술 연구, 특히 물리적 자극에 대한 시공간 반응을 정량화하는 데 적용하는 것은 거의 없습니다 6,7. 대조적으로, 이 공초점 이미징 접근법은 심부 조직(예: 근육층 및 경혈 ST 36/GB 34)에서 적혈구 이동 속도 및 콜라겐 배열의 변화율과 같은 구조적 및 동적 매개변수의 정량적 추출을 가능하게 하여 공간 해상도, 체적 이미징 및 장기 추적에서 기존 생체 현미경의 한계를 극복합니다8.

레이저 공초점 이미징은 세포 해상도9,10,11,12,13에서 생체 내 시각화를 위한 강력한 도구로 등장했습니다. 그러나 기존 연구는 주로 표재성 조직(예: 피부 또는 각막)에 초점을 맞추고 있으며 심부 침술 표적을 다루거나 정량적 형태학적 분석을 통합하는 연구는 거의 없습니다. 결정적으로, 우리가 아는 한, 침술 조작을 살아있는 조직 동역학적 변화와 연관시키는 표준화된 방법론은 존재하지 않습니다.

여기에서 우리는 침술로 인한 형태학적 사건을 실시간으로 추적하기 위한 공초점 이미징 기반 방법론 플랫폼을 구축하여 이러한 격차를 해소합니다. 나트륨 플루오레세인(1% 농도, 0.1mL/100g 체중으로 정맥 투여)을 조영제로 사용하여 침술 자극 중 즉각적인 혈관 확장에서 지연된 염증 캐스케이드에 이르기까지 최대 400μm 깊이에서 450μm × 450μm 시야에 걸쳐 미세 순환 및 기질 변화의 고해상도 모니터링(0.5μm 공간/3.5fps 시간 분해능)을 달성합니다. 이 접근 방식은 콜라겐 섬유 재정렬의 3D 재구성 및 매개변수 정량화를 더욱 가능하게 하여 종점 조직학의 한계를 극복합니다.

이 프로토콜의 구현을 위한 실질적인 고려 사항은 (i) 권장 하드웨어에는 ≥0.5μm 해상도 및 ≥3fps 획득 속도를 갖는 공초점 시스템이 포함되고, (ii) 일반적인 제한 사항에는 90초 이상의 연속 이미징 및 호흡 또는 조직 움직임에 대한 민감도가 포함되며, (iii) 깊이 침투는 고밀도 또는 산란 조직에서 감소할 수 있습니다. 우리가 아는 한, 이 연구는 침술 유발 조직 재구성의 첫 번째 동적 아틀라스를 제공할 뿐만 아니라 살아있는 시스템에서 물리 치료(예: 뜸)를 평가하는 선례를 세웠습니다. 일시적인 생리적 반응을 정량화 가능한 지표로 변환함으로써 우리는 신경 조절 요법의 기계론적 연구를 위한 새로운 패러다임을 제공합니다.

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프로토콜

모든 절차는 중국 의학 과학원 침술 뜸 연구소 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다(번호 D2023-01-29-01). 8마리의 수컷 Sprague Dawley(SD) 쥐(8주령, 200-220g)를 Biotechnology Co., Ltd.(라이센스 번호. SCXK (Jing) 2020-0001). 동물은 통제된 조건에서 멸균된 격리 인클로저에 사육되었습니다: 12시간의 명암 주기, 21 ±± 2°C 온도, 표준 차우 펠릿과 물에 대한 임의의 접근. 모든 실험은 기관 지침과 실험 동물의 관리 및 사용 지침을 준수했습니다.

참고: 주요 절차를 강조하는 순서도는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 동물 및 추적자의 제조: 플루오레세인 나트륨(FS)

  1. 1% 플루오레세인 나트륨(FS) 염색 용액을 준비하려면 0.1g의 FS를 10mL의 멸균 식염수(0.9% NaCl)에 녹입니다. 후속 사용을 위해 용액을 실온(RT)에서 보관하십시오.
  2. 이소플루란 유도를 통해 SD 쥐를 마취합니다(유도: 5% 이소플루란, 유지: 2.5% 이소플루란). 전기 이발기를 사용하여 두개골 부위(머리 제외)의 털을 제거한 다음 제모 크림을 5분 동안 바릅니다. 따뜻한 물로 헹구어 잔여 크림과 모발을 제거합니다.
    알림: 정량적 영상 분석을 손상시킬 수 있는 피부 손상을 방지하기 위해 작동 중 클리퍼 블레이드를 피부 표면과 평행하게 유지하십시오. 실험 결과에 영향을 미치는 동물 저체온증을 피하기 위해 따뜻한 물을 엄격하게 사용하여 헹굼해야 합니다.

2. FS 주입

  1. 쥐를 고정하십시오.
    1. 1.0g/kg의 용량으로 10% 우레탄(1g/10mL, 식염수)을 복강내 주사하여 털을 제거한 쥐를 마취합니다.
    2. 완전 마취가 완료되면 동물을 수술 플랫폼에 누운 자세로 고정합니다. 집게를 사용하여 뒷발에 발가락을 부드럽게 꼬집고 금단 반사가 없는지 관찰합니다. 촉촉한 면봉 끝으로 각막을 가볍게 만져 각막 반사의 상실을 확인합니다.
    3. 시술을 진행하기 전에 지속적인 무반응과 안정적인 호흡수를 확인하십시오. 마취 중에는 37°C의 가열 패드로 동물의 체온을 유지합니다.
      참고: 이미징 창의 재배치를 손상시킬 수 있는 비자발적 움직임을 방지하기 위해 전체 마취를 확인해야 합니다.
  2. 체중 100g당 0.1mL의 용량으로 꼬리 정맥을 통해 1% FS 용액을 정맥 주사합니다.
    1. 27G 바늘이 장착된 1mL 주사기를 사용하여 꼬리 정맥 주사를 수행합니다. 따뜻한 물로 꼬리를 부드럽게 닦아 혈관 확장을 촉진한 후 70% 에탄올로 소독합니다.
    2. 정맥의 세로 축을 따라 얕은 각도(≤15°)로 바늘 베벨업을 삽입합니다. 용액을 0.1-0.2mL/min의 속도로 천천히 주입합니다.
    3. 기술적 저항 없는 흐름, 혈관 주위 부종의 부재를 확인하고 동공, 귓바퀴 및 발의 노란색 변색으로 성공적인 주사를 확인합니다.
      참고: 우발적인 동맥 내 주사는 엄격히 피해야 합니다.

3. 생체 내 프로브 공초점 레이저 내시경(pCLE) 설정

  1. pCLE 시스템을 활성화하고 스캐닝 프로브 커넥터와 원위 팁의 청결도를 확인합니다.
  2. 생리 식염수에 적신 면봉을 사용하여 프로브의 원위 끝(스캐닝 팁이라고도 함)을 청소한 다음 렌즈 조직으로 부드럽게 말립니다.
  3. 레이저 프로브를 대상 관찰 부위(예: 허벅지 내측 부위)에 배치합니다. 조정 가능한 클램프를 사용하여 공초점 이미징 프로브를 고정하여 압축 아티팩트 없이 조직 표면과의 안정적인 접촉을 보장하고 조정 손잡이를 조여 고정합니다.
  4. 프로브를 pCLE 시스템에 연결하고 획득 매개변수(예: 시야[FOV], 저장 디렉토리)를 구성합니다. 이 실험에 사용된 특정 매개변수는 다음과 같습니다. 깊이: 18μm; 레이저: 219mW; 밝기: 76%; 속도: 1920 × 540; 이득: 2400; 줌: 1×(464μm); 필터: LP 515; 조회 테이블: 회색 스캔.
    참고: 이미징 매개변수(스캐닝 깊이/레이저 출력)는 조직 구조의 뚜렷한 시각화가 달성될 때까지 반복적으로 최적화되었습니다. 일관된 강도는 종단 이미지 비교 가능성에 매우 중요합니다. 프로브-조직 계면에 37°C 식염수 방울을 추가하면 초기 반복에서 관찰된 신호 손실이 제거되었습니다. 이 연구에 사용된 레이저 출력은 생체 내 공초점 이미징에서 광독성에 대해 일반적으로 허용되는 임계값보다 낮습니다.

4. pCLE 및 획득을 통한 조직 구조 이미징

  1. 프로브를 피부 표면에 배치하고 데이터 수집을 시작하여 조직 구조를 시각화합니다.
    1. 연필 그립 방식으로 프로브를 잡습니다. 표적 영역(예: 시야 내에 맥관 구조 또는 섬유성 결합 조직이 있는 영역)으로 조작하고 원위 팁을 이미징 영역에 직접 배치한 다음 프로브 암을 통해 안정화합니다.
  2. 먼저, 생리학적 조건에서 1분 동안 기본 조직 구조를 획득한 후 침술 개입 중에 5분 동안 기록합니다. 개입 후 획득을 종료합니다. 데이터 파일은 3.3-3.4단계에서 지정한 디렉토리에 자동으로 저장됩니다.
    참고: 파일은 레이어 스택(.tiff) 및 개별 프레임(.tiff)으로 저장됩니다.

5. 침술 개입

참고: 이미징 단계의 획득은 개입 중에 수행됩니다.

  1. 1쿤(중국 길이 측정 단위는 약 13mm) 일회용 스테인리스 스틸 바늘을 프로브로 관찰한 조직에 인접한 경혈에 삽입합니다. 하나의 리드를 스테인리스 스틸 바늘에 연결하고 다른 기준 전극을 쥐의 꼬리에 고정합니다.
  2. 다음 매개변수를 사용하여 전기 침술(EA) 자극을 적용합니다: 1mA 강도, 조밀분산파(2/15Hz), 5분 동안.
    참고: 이미지 안정성을 손상시키는 EA 유발 진피 떨림을 방지하기 위해 바늘 삽입 부위와 프로브 사이에 충분한 거리(>3mm)를 유지하십시오.

6. 이미지 분석

  1. ImageJ에서 획득한 이미지 스택을 엽니다. 공간 보정을 마이크로미터로 변환하고 플러그인 호환성을 위해 이미지 형식을 8비트로 변환합니다(이미지 > 유형 > 8비트).
    참고: 기본 이미지 크기는 인치(시스템별 설정)입니다.
  2. 관심 영역(ROI)을 정의합니다: 미세 순환: 단일 모세관 세그먼트, 매트릭스 구조: 콜라겐 섬유 영역. 종단적 일관성을 위해 순차적 이미지에서 동일한 ROI를 유지합니다.
  3. 미세순환 분석
    1. 관찰해야 하는 적혈구가 포함된 영역을 선택하고 이미지를 잘라 다른 간섭 영역을 제거합니다(직사각형 > 이미지 > 자르기). 임계값 도구를 사용하여 적혈구(RBC)를 독점적으로 분할합니다(이미지 > 임계값 조정 도구>).
    2. MTrack2 플러그인을 로드합니다. 간섭을 배제하고 정확한 RBC 추적을 보장하기 위해 RBC 크기(이 실험에서는 10-42픽셀)를 기반으로 적절한 추적 매개변수를 설정합니다(플러그인 > 추적> MTrack2).
  4. 매트릭스 구조 해석
    1. 방향 성 플러그인을 로드하고 푸리에 성분 모드를 선택한 다음 0°에서 180° 방향에 걸쳐 콜라겐 섬유의 분포 비율에 대한 통계 분석을 수행합니다(방향성 > 분석).

7. 데이터 마무리

  1. 명명 규칙 [Group]_[Date].extension을 사용하여 분석된 데이터를 TIFF/XSL 형식으로 내보냅니다. 모든 원시 및 처리된 파일을 지정된 보안 서버에 백업합니다. 통계 분석을 위해 요약 스프레드시트에 정량적 출력을 기록합니다.

8. 안전 및 폐기물 관리

  1. 개인 보호 장비(PPE): 우레탄, 이소플루란 또는 플루오레세인 나트륨을 취급할 때는 니트릴 장갑, 실험실 가운, 보안경을 착용하십시오.
  2. 마취제 취급: 흡입 노출을 최소화하기 위해 흄 후드 내에서 우레탄 또는 이소플루란과 관련된 절차를 수행합니다.
  3. 날카로운 물건 주의사항: 모든 바늘과 날카로운 물건은 지정된 천공 방지 날카로운 물건 용기에 즉시 폐기하십시오.
  4. 전기침(EA) 안전성: EA 장비의 전기적 절연을 확인하고 리드 연결을 고정하여 누설 전류나 단락을 방지합니다.
  5. 폐기물 처리: 기관 지침에 따라 이소플루란 병을 의료 폐기물로 폐기하십시오. 염료로 오염된 물질(예: 면봉, 조직) 폐기물은 밀봉된 유해 폐기물 용기에 폐기하십시오. 인증된 날카로운 물건 처리 상자에 날카로운 물건을 수거하십시오.
    알림: 모든 절차는 기관 안전 및 환경 보건 규정을 준수해야 합니다.

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결과

이 프로토콜은 침술이 미세순환 및 세포외 기질 구조에 미치는 영향을 실시간으로 동적으로 평가하기 위한 pCLE의 유용성을 보여줍니다. 꼬리 정맥을 통해 플루오레세인 나트륨을 정맥 투여한 후, 국소 모세혈관 내 적혈구 속도의 변화와 콜라겐 섬유 배열의 재구성을 관찰하여 변화를 평가했습니다.

침술 후 5분의 대표적인 결과는 가속화된 적혈구 이동(P < 0.05, t-테스트)(그림 2A)과 콜라겐이 질서 정연한 다발 모양 구조로 재정렬되는 것으로 나타났습니다(그림 2B,C). 침술로 인한 국소 혈역학적 가속 및 간질 삼투압 이동은 섬유 다발 분리를 초래했으며, 이는 영상에서 밝은 영역이 증가하여 확장된 섬유간 공간으로 나타납니다...

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토론

결과에서 입증된 바와 같이, 본 연구에서 확립된 생체 내 공초점 이미징 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 표준 장비와 일상적인 형광 표지를 사용하여 침술 개입 중 미세순환 및 세포외 기질 역학의 동시 정량적 분석을 가능하게 합니다. 이 프로토콜의 성공은 두 가지 중요한 단계, 즉 플루오레세인 나트륨 주입의 정확한 타이밍, 지속적인 미세혈관 조영제 보장14 및 종단 콜라겐 섬유 추적에 필수적인 엄격한 동물 고정에 달려 있습니다.

기술적 문제를 해결하기 위해 표적 최적화가 구현되었습니다: 프로브-조직 인터페이스에 37°C 식염수 방울을 추가하면 초기 반복에서 관찰된 신호 손실이 제거되었으며, 전기 침술 부위와 프로브 사이의 >3mm 거리를 유지하여 진동 아티팩트를 줄였습니다. 이러한 개선으로 데이터 재현성이 크게 향상되었습니다.

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국가 중점 연구 개발 프로그램(2024YFA1209900, 2024YFA1209903, 2024YFA1209904)의 자금 지원을 받았습니다. 중국 국가자연과학재단(82050006) 특별기금; 후베이성 한의학 관리국(ZY2025Z015)의 한의학 연구 프로젝트; 장한대학교 연구기금(2024JCYJ13).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 쿤 침술 바늘Hwato, 쑤저우, 중국해당 사항 없음13mm/0.25mm
10% 플루오레세인 나트륨Guangxi Wuzhou Pharmaceutical Co Ltd, 중국H45021477
동물 마취 기계RWD, 심천, 중국R620IE
체온 모니터RWD, 심천, 중국69026
전기 침술 장치Hwato, 쑤저우, 중국SDZ-III
제모 크림Veet, 프랑스
이미지J미국 국립보건원(National Institutes of Health)https://imagej.nih.gov/ij/
생체 내 프로브 공초점 레이저 내시경 검사Optiscan, 오스트레일리아뷰엔비보B30직경: 4mm 휴대용 강성 프로브, 굽힘에 강하고 시간이 지나도 구조적 무결성을 유지합니다. 길이: ≥ 46mm. 스캐닝 모드: 줌 스캐닝 기능.
이소플루란RWD, 심천, 중국
R510-22-16
우 레 탄Sigma-Aldrich, 미국94300

참고문헌

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