외과적 조달부터 기계 관류 시작까지 상세하고 재현 가능한 돼지 전안구 이식 모델(WET)을 기술하여, 이식 과정에서 WET 동적 보존을 연구할 수 있게 합니다.
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외과적 조달부터 기계 관류 시작까지 상세하고 재현 가능한 돼지 전안구 이식 모델(WET)을 기술하여, 이식 과정에서 WET 동적 보존을 연구할 수 있게 합니다.
최초의 인간 전안구 이식(WET)은 주요 안과 손상으로 시력을 잃은 환자들에게 새로운 희망을 불러일으켰지만, WET를 통한 시력 회복이 가능해지기 위해서는 여전히 해결해야 할 중요한 과제들이 남아 있습니다. 이 중 가장 중요한 과제 중 하나는 체외 보존입니다. 특히 망막과 시신경 같은 신경 구성 요소는 적절한 보존이 보장되지 않으면 몇 분 내에 빠르고 되돌릴 수 없는 퇴행을 겪습니다. 정적 냉장 저장(SCS)은 혈관 합성 동형이식(VCA)에서 여전히 금본위로 자리 잡고 있으나, 대사를 충분히 억제하거나 지원하지 못해 이식편의 생존력과 기능을 잃기 때문에 WET의 체외 보존에는 적합하지 않습니다. 서막기압 기계 관류(SNMP)는 SCS의 유망한 대안으로 부상했으며, 이식편을 보존할 뿐만 아니라 재조정에도 기여할 잠재력을 제공합니다. 우리 연구팀은 SNMP를 고형 장기 이식에서 여러 VCA 모델로 성공적으로 전환하여 그 실현 가능성과 장점을 입증했습니다. 여기서는 돼지에서 WET 보존을 위한 SNMP 적용 사례와 해부학적 모델과 보존 프로토콜을 상세히 설명합니다. 이 접근법은 WET 보존 및 이식 기술을 최적화하는 데 있어 중요한 진전을 의미합니다.
혈관 복합 동형이식(VCA)은 재건 수술에서 중요한 진전을 의미하며, 복잡한 병변을 가진 환자들에게 비할 데 없는 미적 및 기능적 결과를 제공합니다 1,2. 하지만 안구 관련 시력 상실은 얼굴 부상에서 여전히 주요 장애 원인으로 남아 있습니다. 최근 첫 번째 전안구 이식(WET)은 환자들에게 새로운 희망을 불러일으켰습니다. 비록 시력은 회복되지 않았지만, 기능적 영상 검사는 빛 자극에 반응하는 피질 활성화를 보여주었고, 전기망막촬영술(ERG)은 빛에 대한 광수용기 반응이 둔화되었지만 인식 가능한 것으로 나타났다. 탁월한 기술적 성과에도 불구하고, 기능적 WET를 임상적으로 실현하기 위해서는 여전히 상당한 과제가 남아 있습니다. 안구는 허혈에 매우 민감하며, 적절한 산소 공급과 pH 수치가 유지되지 않으면 망막과 시신경은 따뜻한 허혈 시간(WIT) 발생 몇 분 내에 돌이킬 수 없는 퇴행을 겪습니다. 따라서 WET는 VCA 분야에서 특정한 도전 과제를 제기하며, 후방 및 전방 구절뿐만 아니라 외안구 구성 요소 등 여러 요인을 고려해야 합니다. 특히 근육은 성공적인 기능적 결과를 달성하는 데 매우 중요한데, 이는 허혈-재관류로 인해 더욱 악화되는 온열 허혈 손상에 매우 취약하기 때문입니다 7,8. 산소 결핍은 세포 손상과 손상 관련 분자 패턴(DAMPs)의 방출을 초래합니다. 재관류 시 이 DAMPs는 수혜자의 면역 체계를 활성화하여 염증과 면역 세포 침윤을 촉진합니다. 이 염증 환경은 항원 제시와 T세포 활성화를 촉진하여 거부 반응을 가속화합니다. 시신경 재결합과 같은 도전을 극복하는 것과 함께, WET 또는 정적 냉 저장(SCS)으로 인한 손상을 방지하기 위해 최적화된 체외 관류 기술이 필요하며, 궁극적으로 시력 회복 5,7,9,10,11을 달성해야 합니다.
기계 관류(MP)는 고형 장기 이식에서 허혈-재관류 손상을 예방하는 방법으로 잘 확립되어 있으며(12,13,14), 뇌하 기계 관류(SNMP)는 다양한 모델에서 SCS보다 우수한 결과를 보였습니다 15,16,17. 우리는 설치류18,19부터 돼지 20,21,22, 그리고 최근에는 비인간 영장류23까지 다양한 동물 모델에 걸쳐 SNMP를 성공적으로 번역했습니다. SNMP는 이식편을 장기간 보존하는 데 효과가 입증되었을 뿐만 아니라, 이식편 재조정과 열허혈성 손상 완화에도 잠재력을 보여주었으며, 조달 후 최대 24시간까지 안전한 재식재를 가능하게 했습니다. 세포 대사를 부분적으로 유지할 수 있는 능력 덕분에 SNMP는 보존 단계를 진단, 치료, 전처리 플랫폼으로 전환하여 VCA의 재이식 및 이식 프로토콜에 통합할 수 있는 새로운 길을 열어줍니다. 우리는 VCA에 특별히 맞춘 최적화된 SNMP 프로토콜을 개발하여 이 도전적인 전안구 이식 시나리오에 적용했습니다.
본 연구에서는 SNMP가 상온(약 20°C)에서 산소가 포함된 동적 장기 보존에 사용됩니다. 이 기술은 연동 펌프와 산소 공급기를 사용해 퍼루세이트를 순환시키고 산소 공급합니다. 돼지 모델이 사용되며, 이는 인간과의 생리학적 유사성, 유사한 혈관 크기, 그리고 외측 안와벽이 없는 독특한 점 때문에 WET 이식 및 보존 연구에 매우 관련성이 있습니다. 이 특징은 외경동맥과 안 동맥이 직접 연결되어 있어 WET를 외경동맥과 경정맥만을 통해서만 얻어도 외부 실험과 생체 내 실험 및 생체 내 실험에 적합하게 만듭니다 정교 또는 이종 소위 재이식. 혈액 조달은 순환기 사망 후에 이루어지며, 심장사후 기증 프로토콜과 일치하여 다른 고형 장기가 채취될 때까지 채취를 지연시킬 수 있습니다. 따라서 이 모델은 열허혈 후 고민도 이식편 재조정에 SNMP의 잠재력을 더욱 탐구하고, 이미 다른 장기에 집중하는 기존 이식 연구소 내에서 WET 보존 기술 개발을 지원하며, '3-R' 원칙인 정제, 감소, 교체를 준수합니다29,30. 더불어, 유사한 절차를 거치는 심장박동 조달에도 여전히 유효합니다. 목표는 외경동맥과 경정맥 박자를 기반으로 한 신뢰할 수 있는 보존 모델을 구축하고, 동적 보존 가능성을 평가하는 것입니다. 이식편 조달, 보존, 그리고 SNMP 구현의 주요 측면을 포함한 상세한 절차 단계가 제공됩니다.
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이 연구에 대한 기관 승인은 지역 기관 동물 관리 및 이용 위원회(프로토콜 #2024N000205)로부터 받았습니다. 모든 동물 연구는 동물 연구: 생체 내 실험 보고 지침31 을 따랐으며, 미 육군 동물 관리 및 사용 검토 사무소(ACURO)32의 권고사항을 준수했습니다. 모든 WET는 말기 장기 조달 절차를 받는 돼지로부터 "3-R" 원칙33을 따랐습니다. 30kg에서 50kg 사이의 동물들은 100 IU/kg 헤파린을 투여한 후 출혈로 안락사되었으며, 실험에는 남은 WET 이식편이 사용되었습니다. 적절한 WET들이 대조군 역할을 했습니다. 장기 채취는 사후 180분 미만의 온열 허혈 상태로 이루어졌다. 프로토콜에 사용되는 모든 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
참고: 데이터는 스프레드시트(예: 엑셀)에 기록되었으며, 통계 분석은 적절한 통계 소프트웨어(예: GraphPad Prism)를 사용하여 수행되었습니다. 알파 위험도는 5%로 설정되었고, 양쪽 꼬리가 있었습니다. 각 모니터링 변수에 대해 평균과 표준오차가 산출되었습니다. 스피어먼 검사는 관류 매개변수 간의 상관관계를 연구하는 데 사용되었습니다.
1. 기계 관류 준비 (실험 하루 전)
2. 사후 WET 조달
참고: 심장사 후 기증 및/또는 사후 확보를 시뮬레이션하기 위해, 동물은 지역 IACUC 지침에 따라 안락사되어야 합니다. 연구에 방해가 될 수 있는 약물 독성을 피하기 위해 정맥 주사 펜토바르비탈 주사보다는 출혈 치료를 선호합니다.
3. 관류 준비
4. 서비모 기계 관류
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6시간 동안 SNMP 검사를 진행한 예비 타당성 테스트가 실시되었고, 이어서 전체 이식편의 적절한 재관류와 재이식 시뮬레이션을 위해 2시간간 전혈을 이용한 정상 관류(NMP)를 실시했습니다. SNMP 단계 동안 안정적인 유출이 관찰되었고, 이후 전혈 재관류 시뮬레이션에서 전체 이식편의 성공적인 색 재변이 입증되었습니다. 관류 매개변수는 이 기술의 실현 가능성을 더욱 확인시켜 주었습니다(보충 그림 3).
이후 7번의 복제 시리즈에서는 2 mL/min에서 3 mL/분 사이의 안정적인 저유량 요법 하에서 실험이 수행되었으며, 관류 시작 시 평균 동맥압은 57.6 ± 4.0 mmHg에서 시작하여 실험 종료 시점에 점차 감소하여 관류 종료 시 평균 36.7 ± 4.2 mmHg에 도달했습니다. 관류 종료 시 평균 체중 증가는 9.3%± 3.3%였습니다. 혈관 압력과 무게 프로파일의 대표적인 예가
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첫 임상 사례가 발생한 지 20년이 넘었지만, VCA는 여전히 심각한 면역학 및 체외 보존 문제에 직면해 있어 광범위한 보급이 제한되고 있습니다37. 이러한 도전은 시력 회복에 흥미로운 가능성을 제공하지만, 성공적인 시신경 재연결, 전방 및 후방 구절의 기능 보존, 안와 주위 구조의 완전성 유지 등 독특한 장애물이 존재하는 WET의 경우 더욱 두드러집니다. 안구 VCA의 경우, 적절한 산소 공급과 pH 수준이 유지되지 않으면 망막이 몇 분 내에 돌이킬 수 없는 기능 손실을 겪을 수 있으므로 이식 전에 허혈성 손상을 예방하는 것이 특히중요합니다. 따라서 보존의 질과 지속 기간을 향상시키는 것은 WET를 임상 현장에 성공적으로 전환하여 시력 회복 가능성을 극대화하는 데 매우 중요합니다. 기계 관류는 최근 VCA에서 잠재적 해결책으로 부상했으며, 고형 장기 보존 개선에 대한...
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일부 작가들은 상충하는 이해관계를 선언하기도 합니다. 우이군, 렐루치 박사, 세트룰로 박사는 이 연구와 관련된 특허 출원을 가지고 있습니다. 코르쿳 위군 박사와 바삭 위군 박사는 고영하 장기 보존 기술 개발에 집중하는 실바티카 바이오텍(Sylvatica Biotech Inc.)의 과학 자문 위원회에서 재정적 이해관계를 가지고 있습니다. MGH 조사관들의 상포하는 이해관계는 MGB가 이해충돌 정책에 따라 관리합니다. 나머지 모든 저자들은 이해 충돌이 없다고 선언한다.
이 연구는 국립보건원(NIH)의 R01AR082825호(BEU), R01EB028782(KU), 국방부 RTRP RT240044(KU, AGL, CLC), Shriners Children's 84308(YB), ARPA-H 하위 수학금 FY25.1065.001(CLC), 그리고 국립과학재단의 보조금 번호 하에 부분적으로 지원받았습니다. EEC 1941543 (KU). HO와 YB는 Fondation des Gueules Cassées로부터 자금을 지원받았습니다. 프랑스 성형외과 및 재건 및 예술 협회(SOFCPRE, 프랑스)의 HO 및 YB에 대한 지원에 깊이 감사드립니다.
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