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방법 논문

전안구 이식의 동적 보존 및 이식을 연구하기 위한 돼지 모델 구축

615 조회수

DOI:

10.3791/69179

2025년 11월 25일

이 논문에서

요약

외과적 조달부터 기계 관류 시작까지 상세하고 재현 가능한 돼지 전안구 이식 모델(WET)을 기술하여, 이식 과정에서 WET 동적 보존을 연구할 수 있게 합니다.

초록

최초의 인간 전안구 이식(WET)은 주요 안과 손상으로 시력을 잃은 환자들에게 새로운 희망을 불러일으켰지만, WET를 통한 시력 회복이 가능해지기 위해서는 여전히 해결해야 할 중요한 과제들이 남아 있습니다. 이 중 가장 중요한 과제 중 하나는 체외 보존입니다. 특히 망막과 시신경 같은 신경 구성 요소는 적절한 보존이 보장되지 않으면 몇 분 내에 빠르고 되돌릴 수 없는 퇴행을 겪습니다. 정적 냉장 저장(SCS)은 혈관 합성 동형이식(VCA)에서 여전히 금본위로 자리 잡고 있으나, 대사를 충분히 억제하거나 지원하지 못해 이식편의 생존력과 기능을 잃기 때문에 WET의 체외 보존에는 적합하지 않습니다. 서막기압 기계 관류(SNMP)는 SCS의 유망한 대안으로 부상했으며, 이식편을 보존할 뿐만 아니라 재조정에도 기여할 잠재력을 제공합니다. 우리 연구팀은 SNMP를 고형 장기 이식에서 여러 VCA 모델로 성공적으로 전환하여 그 실현 가능성과 장점을 입증했습니다. 여기서는 돼지에서 WET 보존을 위한 SNMP 적용 사례와 해부학적 모델과 보존 프로토콜을 상세히 설명합니다. 이 접근법은 WET 보존 및 이식 기술을 최적화하는 데 있어 중요한 진전을 의미합니다.

서론

혈관 복합 동형이식(VCA)은 재건 수술에서 중요한 진전을 의미하며, 복잡한 병변을 가진 환자들에게 비할 데 없는 미적 및 기능적 결과를 제공합니다 1,2. 하지만 안구 관련 시력 상실은 얼굴 부상에서 여전히 주요 장애 원인으로 남아 있습니다. 최근 첫 번째 전안구 이식(WET)은 환자들에게 새로운 희망을 불러일으켰습니다. 비록 시력은 회복되지 않았지만, 기능적 영상 검사는 빛 자극에 반응하는 피질 활성화를 보여주었고, 전기망막촬영술(ERG)은 빛에 대한 광수용기 반응이 둔화되었지만 인식 가능한 것으로 나타났다. 탁월한 기술적 성과에도 불구하고, 기능적 WET를 임상적으로 실현하기 위해서는 여전히 상당한 과제가 남아 있습니다. 안구는 허혈에 매우 민감하며, 적절한 산소 공급과 pH 수치가 유지되지 않으면 망막과 시신경은 따뜻한 허혈 시간(WIT) 발생 몇 분 내에 돌이킬 수 없는 퇴행을 겪습니다. 따라서 WET는 VCA 분야에서 특정한 도전 과제를 제기하며, 후방 및 전방 구절뿐만 아니라 외안구 구성 요소 등 여러 요인을 고려해야 합니다. 특히 근육은 성공적인 기능적 결과를 달성하는 데 매우 중요한데, 이는 허혈-재관류로 인해 더욱 악화되는 온열 허혈 손상에 매우 취약하기 때문입니다 7,8. 산소 결핍은 세포 손상과 손상 관련 분자 패턴(DAMPs)의 방출을 초래합니다. 재관류 시 이 DAMPs는 수혜자의 면역 체계를 활성화하여 염증과 면역 세포 침윤을 촉진합니다. 이 염증 환경은 항원 제시와 T세포 활성화를 촉진하여 거부 반응을 가속화합니다. 시신경 재결합과 같은 도전을 극복하는 것과 함께, WET 또는 정적 냉 저장(SCS)으로 인한 손상을 방지하기 위해 최적화된 체외 관류 기술이 필요하며, 궁극적으로 시력 회복 5,7,9,10,11을 달성해야 합니다.

기계 관류(MP)는 고형 장기 이식에서 허혈-재관류 손상을 예방하는 방법으로 잘 확립되어 있으며(12,13,14), 뇌하 기계 관류(SNMP)는 다양한 모델에서 SCS보다 우수한 결과를 보였습니다 15,16,17. 우리는 설치류18,19부터 돼지 20,21,22, 그리고 최근에는 비인간 영장류23까지 다양한 동물 모델에 걸쳐 SNMP를 성공적으로 번역했습니다. SNMP는 이식편을 장기간 보존하는 데 효과가 입증되었을 뿐만 아니라, 이식편 재조정과 열허혈성 손상 완화에도 잠재력을 보여주었으며, 조달 후 최대 24시간까지 안전한 재식재를 가능하게 했습니다. 세포 대사를 부분적으로 유지할 수 있는 능력 덕분에 SNMP는 보존 단계를 진단, 치료, 전처리 플랫폼으로 전환하여 VCA의 재이식 및 이식 프로토콜에 통합할 수 있는 새로운 길을 열어줍니다. 우리는 VCA에 특별히 맞춘 최적화된 SNMP 프로토콜을 개발하여 이 도전적인 전안구 이식 시나리오에 적용했습니다.

본 연구에서는 SNMP가 상온(약 20°C)에서 산소가 포함된 동적 장기 보존에 사용됩니다. 이 기술은 연동 펌프와 산소 공급기를 사용해 퍼루세이트를 순환시키고 산소 공급합니다. 돼지 모델이 사용되며, 이는 인간과의 생리학적 유사성, 유사한 혈관 크기, 그리고 외측 안와벽이 없는 독특한 점 때문에 WET 이식 및 보존 연구에 매우 관련성이 있습니다. 이 특징은 외경동맥과 안 동맥이 직접 연결되어 있어 WET를 외경동맥과 경정맥만을 통해서만 얻어도 외부 실험과 생체 내 실험 및 생 내 실험에 적합하게 만듭니다 정교 또는 이종 소위 재이식. 혈액 조달은 순환기 사망 후에 이루어지며, 심장사후 기증 프로토콜과 일치하여 다른 고형 장기가 채취될 때까지 채취를 지연시킬 수 있습니다. 따라서 이 모델은 열허혈 후 고민도 이식편 재조정에 SNMP의 잠재력을 더욱 탐구하고, 이미 다른 장기에 집중하는 기존 이식 연구소 내에서 WET 보존 기술 개발을 지원하며, '3-R' 원칙인 정제, 감소, 교체를 준수합니다29,30. 더불어, 유사한 절차를 거치는 심장박동 조달에도 여전히 유효합니다. 목표는 외경동맥과 경정맥 박자를 기반으로 한 신뢰할 수 있는 보존 모델을 구축하고, 동적 보존 가능성을 평가하는 것입니다. 이식편 조달, 보존, 그리고 SNMP 구현의 주요 측면을 포함한 상세한 절차 단계가 제공됩니다.

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프로토콜

이 연구에 대한 기관 승인은 지역 기관 동물 관리 및 이용 위원회(프로토콜 #2024N000205)로부터 받았습니다. 모든 동물 연구는 동물 연구: 생체 내 실험 보고 지침31 을 따랐으며, 미 육군 동물 관리 및 사용 검토 사무소(ACURO)32의 권고사항을 준수했습니다. 모든 WET는 말기 장기 조달 절차를 받는 돼지로부터 "3-R" 원칙33을 따랐습니다. 30kg에서 50kg 사이의 동물들은 100 IU/kg 헤파린을 투여한 후 출혈로 안락사되었으며, 실험에는 남은 WET 이식편이 사용되었습니다. 적절한 WET들이 대조군 역할을 했습니다. 장기 채취는 사후 180분 미만의 온열 허혈 상태로 이루어졌다. 프로토콜에 사용되는 모든 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

참고: 데이터는 스프레드시트(예: 엑셀)에 기록되었으며, 통계 분석은 적절한 통계 소프트웨어(예: GraphPad Prism)를 사용하여 수행되었습니다. 알파 위험도는 5%로 설정되었고, 양쪽 꼬리가 있었습니다. 각 모니터링 변수에 대해 평균과 표준오차가 산출되었습니다. 스피어먼 검사는 관류 매개변수 간의 상관관계를 연구하는 데 사용되었습니다.

1. 기계 관류 준비 (실험 하루 전)

  1. 기계 관류 시스템34( 그림 1 참조)를 설정하세요.
    1. 관류 시스템 부품을 조립하세요: 펌프, 산소 공급기, 버블 트랩, 연속 압력 센서, 무게 센서.
      참고: 튜빙 길이는 설치의 모든 구성 요소를 조립하는 데 필요한 최소 길이로 유지해야 합니다. 조립 후 압력 교정은 시스템, 특히 튜빙 길이에 따라 다르다는 점을 명심하세요.
    2. 시스템을 반폐쇄 순환회로로 연결하여 저장소에서 산소 공급기로 흘러들어가고, 그 후 이식편 유입(경동맥)으로 펌프로 보냅니다. 정맥 유출은 다시 저장소로 배수됩니다(보조 그림 1 보조 영상 1).
    3. 압력 센서를 유입 튜브에 연결하세요.
    4. 이식편을 전자 저울에 위치한 3차원(3D) 프린팅 플랫폼 위에 올려놓습니다.
    5. 저울과 압력 센서를 모두 마이크로컨트롤러에 연결하세요.
    6. 마이크로컨트롤러를 운영자의 컴퓨터에 연결하여 실시간 모니터링과 지속적인 데이터 기록을 제공합니다.
    7. 열화상 카메라를 온도 모니터링 준비하세요.
      참고: 부종 형성을 대신하는 체중 모니터링은 관류35 중 이식편 손상의 초기 지표로 매우 중요합니다.
  2. 관류 시작 전에 회로 부품을 철저히 청소하고, 특히 여러 번 사용된 산소 공급기를 특히 주의하세요.
    1. 먼저 모든 튜빙을 70% 에탄올로 따로 세척한 후 멸균 이온수로 세척하세요.
    2. 시스템을 조립하고 멸균 탈이온수 2L를 순환시켜 산소 공급기를 50-100 mL/분의 유량으로 세척하세요.
      참고: 살아있는 동물 재심 연구의 경우, 새로운 멸균 산소 공급기를 사용하고 다른 모든 관류 성분은 에틸렌 옥사이드(ETO)로 멸균하세요
  3. 진수액을 준비하세요. 서비모모 기계의 관류를 위해서는 VCA 최적화 Steen+ 솔루션24, 34, 36을 사용하세요. 총 1.5L을 1이식편에 사용하며, 이전에 보고된 상세 조성에 따라34개를 사용합니다.
  4. 퍼퓨레이트에 수산화나트륨 용액을 첨가하여 pH 7.5-7.6을 만듭니다. 이 초기 값을 의도적으로 높게 설정하세요. 왜냐하면 탄화물 혼합물(산소 95%, 이산화탄소 5%)이 용해될 때 순환 중 pH가 감소하기 때문입니다.
  5. 무게와 압력 센서를 보정하여 정확한 측정을 보장합니다.
    1. 플랫폼 무게를 고려해 저울을 타세요.
    2. 혈관압을 정확히 측정하려면 카테터 게이지와 사용된 유량에 따라 시스템을 보정하세요: 각 카테터 크기별로 정규 유량 간격(0.5 mL 단위, 0에서 20 mL/min 사이)에 적용되는 시스템 압력을 측정합니다.
    3. 실험 중 동맥압을 계산하기 위해 측정 중인 총압력에서 보정 압력을 빼서 계산합니다. 이 실험들에서 사용된 보정 표가 예시로 제공된다(보조 그림 2).
      참고: 보정은 각 세팅마다 다릅니다. 튜빙, 산소 공급 장치 또는 퍼플로세이트가 변경된 후 보정을 반복하세요. 이러한 수정이 시스템 압력에 영향을 줄 수 있습니다.

2. 사후 WET 조달

참고: 심장사 후 기증 및/또는 사후 확보를 시뮬레이션하기 위해, 동물은 지역 IACUC 지침에 따라 안락사되어야 합니다. 연구에 방해가 될 수 있는 약물 독성을 피하기 위해 정맥 주사 펜토바르비탈 주사보다는 출혈 치료를 선호합니다.

  1. 안락사된 동물은 엎드린 자세로 유지하세요. 머리와 목 부위를 면도하고 문지르고 멸균 커튼을 붙이세요.
    참고: 해부학적 모델은 그림 2에 제시되어 있으며, 단계별 해부 가이드는 보조 파일 1에 제공됩니다.
  2. 판막의 피부 무늬를 그려보세요.
    1. 마킹은 안과 가장자리에서 2cm 떨어진 안과 주위를 따라 선을 그리고, 외안각에서 목 쪽으로 1cm 아래로 확장된 절개 부위로 이루어져 있는지 확인하세요.
    2. 절개는 23번 메스로 피부와 피하 조직을 관통하여 안와의 상하부, 골막을 포함한 뼈까지 진행합니다. 피판의 앞뒤쪽 부분에서는 절개가 근막면에 도달하도록 하세요.
  3. 스티븐스 가위와 애드슨 겸자를 사용해 안도 앞쪽 부분부터 해부를 시작하세요.
    1. 골막 엘리베이터를 이용해 골막하 평면의 안와 내용물을 안와벽 쪽으로 올려줍니다.
    2. 안와벽 근처 구조물을 식별하고 분할하는 것은 n°15 칼날 메스로, 사근 삽입부와 전두정맥과 연결되는 안와정맥 신경총을 포함합니다.
      참고: 전두정맥은 안면정맥으로 배수되며, 안정맥이 있는 문합 분지가 보존된다면 시간을 절약하기 위해 얼굴정맥을 희생할 수 있습니다.
  4. 궤도의 후방 측면에 대한 해부를 계속하세요. 메스로 교근의 광골 삽입부를 절제한 뒤, 리스트론 본 커터로 하악의 상행 가지를 절제합니다. 하악골 조각을 외부에서 회전시켜 과두를 수동으로 분리합니다.
  5. 광대 돌기에서 전두뼈까지 뻗은 안와 인대를 분리하여 측두근의 안와 부분에 접근합니다. 측두근을 절제하세요.
  6. 골막 엘리베이터를 사용해 관절궁 아래에서 앞안과 가장자리 쪽으로 하막막 터널을 만듭니다. 왕복톱을 사용해 뼈를 자르세요. 측두근 아래 안와 원추세포 하측부에 위치한 안과 동맥을 확인하세요.
  7. 롱저를 사용해 광대궁과 전하안와벽을 절제합니다.
    참고: 이 단계들은 안와 원추세포의 하측 측면과 혈관 페디클에 접근할 수 있게 해줍니다.
  8. 안과 내용물에 들어가는 두 가지 모두 미세한 스티븐스 가위와 미세수술 겸자로 확인하고 해리하세요.
    참고: 대부분의 혈관(외경동맥과 표면경정맥)은 하악골 아래에 위치하지만, 얼굴정맥은 하악 표면에 위치해 있습니다.
  9. 외경동맥과 경정맥의 원하는 길이를 분리한 후, 메스를 사용해 시신경, 안구운동신경, 혈관 박자를 절단하여 절개를 완료합니다.

3. 관류 준비

  1. 사이드 테이블 위에서 미세수술용 확장기를 사용해 경동맥을 확장하고 혈관카테터를 삽입합니다. 캐닐레이션은 3-0 실크 타이로 고정하세요.
    참고: 이 프로토콜에서는 모든 동맥에 18G 혈관카테터가 사용되었습니다. 동맥 페디클이 짧을 경우, 두 개의 안과 가지 중 하나만 선택적으로 캐닐 삽입을 피하기 위해 카테터를 너무 깊게 삽입하지 않도록 주의해야 합니다. 경정맥은 폐쇄 루프 관류 시스템을 사용하지 않는 한 관통할 필요가 없으며, 이 프로토콜에서는 그렇지 않았습니다.
  2. 경동맥을 세척하려면 관류 장치에 사용된 것과 동일한 압력 센서가 장착된 10 mL 주사기를 사용하세요. 10 mL의 헤파린(100 IU/mL)을 사용해 혈관을 세척하여 유출구가 깨끗하도록 하세요. 35 ± 5 mmHg 이하로 유지하세요. 높은 압력은 미세혈관 손상과 관류 실패를 초래할 수 있습니다.

4. 서비모 기계 관류

  1. 이식편의 캐뉰레이드 동맥을 기계 관류 시스템의 유입 튜브에 연결하고 이식편을 스케일에 넣습니다.
  2. 분당 2-4 mL로 설정된 펌프를 시작하세요.
    참고: 관류 유량과 압력 속도는 사용되는 프로토콜에 따라 다릅니다. VCA의 경우, 모세혈관 손상과 부종 형성을 방지하기 위해 안정적이고 저유량 요법을 사용합니다.
  3. 1mL 주사기를 사용해 유입과 유출의 각 사전 정해진 시점에서 생존 지표를 평가하고, 혈액 가스 시스템 기계로 샘플(예: 혈액 가스 지표 [pH, pCO2, pO2, 락테이트, 염기 과잉, 중탄산염], 포도당, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 염화물)을 분석합니다. 이를 통해 표 1에 제시된 방정식에 따라 이식편의 대사 상태를 계산할 수 있습니다.
    참고: 이 프로토콜에서는 관류가 18시간 동안 지속되며, 첫 6시간 동안 유입과 유출 샘플을 매시간씩, 나머지 12시간 동안 3시간마다 채취합니다.

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결과

6시간 동안 SNMP 검사를 진행한 예비 타당성 테스트가 실시되었고, 이어서 전체 이식편의 적절한 재관류와 재이식 시뮬레이션을 위해 2시간간 전혈을 이용한 정상 관류(NMP)를 실시했습니다. SNMP 단계 동안 안정적인 유출이 관찰되었고, 이후 전혈 재관류 시뮬레이션에서 전체 이식편의 성공적인 색 재변이 입증되었습니다. 관류 매개변수는 이 기술의 실현 가능성을 더욱 확인시켜 주었습니다(보충 그림 3).

이후 7번의 복제 시리즈에서는 2 mL/min에서 3 mL/분 사이의 안정적인 저유량 요법 하에서 실험이 수행되었으며, 관류 시작 시 평균 동맥압은 57.6 ± 4.0 mmHg에서 시작하여 실험 종료 시점에 점차 감소하여 관류 종료 시 평균 36.7 ± 4.2 mmHg에 도달했습니다. 관류 종료 시 평균 체중 증가는 9.3%± 3.3%였습니다. 혈관 압력과 무게 프로파일의 대표적인 예가

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토론

첫 임상 사례가 발생한 지 20년이 넘었지만, VCA는 여전히 심각한 면역학 및 체외 보존 문제에 직면해 있어 광범위한 보급이 제한되고 있습니다37. 이러한 도전은 시력 회복에 흥미로운 가능성을 제공하지만, 성공적인 시신경 재연결, 전방 및 후방 구절의 기능 보존, 안와 주위 구조의 완전성 유지 등 독특한 장애물이 존재하는 WET의 경우 더욱 두드러집니다. 안구 VCA의 경우, 적절한 산소 공급과 pH 수준이 유지되지 않으면 망막이 몇 분 내에 돌이킬 수 없는 기능 손실을 겪을 수 있으므로 이식 전에 허혈성 손상을 예방하는 것이 특히중요합니다. 따라서 보존의 질과 지속 기간을 향상시키는 것은 WET를 임상 현장에 성공적으로 전환하여 시력 회복 가능성을 극대화하는 데 매우 중요합니다. 기계 관류는 최근 VCA에서 잠재적 해결책으로 부상했으며, 고형 장기 보존 개선에 대한...

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공개 사항

일부 작가들은 상충하는 이해관계를 선언하기도 합니다. 우이군, 렐루치 박사, 세트룰로 박사는 이 연구와 관련된 특허 출원을 가지고 있습니다. 코르쿳 위군 박사와 바삭 위군 박사는 고영하 장기 보존 기술 개발에 집중하는 실바티카 바이오텍(Sylvatica Biotech Inc.)의 과학 자문 위원회에서 재정적 이해관계를 가지고 있습니다. MGH 조사관들의 상포하는 이해관계는 MGB가 이해충돌 정책에 따라 관리합니다. 나머지 모든 저자들은 이해 충돌이 없다고 선언한다.

감사의 글

이 연구는 국립보건원(NIH)의 R01AR082825호(BEU), R01EB028782(KU), 국방부 RTRP RT240044(KU, AGL, CLC), Shriners Children's 84308(YB), ARPA-H 하위 수학금 FY25.1065.001(CLC), 그리고 국립과학재단의 보조금 번호 하에 부분적으로 지원받았습니다. EEC 1941543 (KU). HO와 YB는 Fondation des Gueules Cassées로부터 자금을 지원받았습니다. 프랑스 성형외과 및 재건 및 예술 협회(SOFCPRE, 프랑스)의 HO 및 YB에 대한 지원에 깊이 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
애드슨 겸자파인 사이언스 툴즈11019-12수술 도구
어피니티 픽시 산소 공급 시스템메드트로닉BBP241산소 공급 장치
앙지오카테스 (24 G)벡턴 디킨슨381112캐뷓레이션 카테터
보빈 혈청 알부민시그마-올드리치A9647퍼퓨지트 성분
염화칼슘 이하이드레이트시그마-올드리치223506퍼퓨지트 성분
이산화탄소 산소에어가스UN3156이산화탄소 산소 혼합물; 가스와 NBSP;
카테터 24 G더처921048동맥 관개
D-(+)-포도당 단수화물시그마-올드리치49159퍼퓨지트 성분
덱사메타손시그마-올드리치D2915퍼퓨지트 성분
덱터른열과학406271000퍼퓨지트 성분
확장기 겸자AROSurgical11.946.1102수술 도구
엑셀 마이크로소프트스프레드시트
헤파린 나트륨 주사유지아 파마63739-953-25퍼퓨지트 성분
휴물린 일반 인슐린 휴먼릴리0002-8215-01퍼퓨지트 성분
하이드로코르티손 석신산나트륨화이자0009-0011-03퍼퓨지트 성분
리가클립에티콘MCS20수술용 혈관 클립
리스트론 본 커터파인 사이언스 툴즈16104-19수술 도구
염화마그네슘 헥사-하이드레이트시그마-올드리치M9272퍼퓨지트 성분
마스터플렉스 L/S콜-파머77200-32롤러 펌프
미세수술 겸자파인 사이언스 툴즈11253-20수술 도구
골막 엘리베이터AROSurgical46.415.18수술 도구
폴리에틸렌 글리콜 35000시그마-올드리치25322-68-3퍼퓨지트 성분
염화칼륨시그마-올드리치7447-40-7퍼퓨지트 성분
압력 모니터, 휴대형, PM-P-1생명 시스템 계측PM-P-1압력 센서
프리즈앤앤그래프패드v. 10.1.1통계 분석 소프트웨어
Radnoti  버블 트랩 컴플라이언스 챔버라드노티130149버블 트랩
RAPIDPoint 500지멘스500혈액 가스 시스템
재가공 톱스트라이커5100-37수술 도구
롱귀르파인 사이언스 툴즈16002-18수술 도구
메스 칼날 (n15)파인 사이언스 툴즈10015-00수술 도구
메스 칼날 (n23)파인 사이언스 툴즈10023-00수술 도구
실크 봉합 3-0에티콘P683H봉합사
중탄산나트륨시그마-올드리치S5761퍼퓨지트 성분
염화나트륨시그마-올드리치S9888퍼퓨지트 성분
수산화나트륨시그마-올드리치72068퍼퓨지트 성분
인산나트륨 모노바시크 디하이드레이트 시그마-올드리치71505퍼퓨지트 성분
스티븐스 가위AROSurgical07.367.13수술 도구
주사기 1 mLBD309659샘플 조달
주사기 10 mL더처300912이식 플러시
열화상 카메라플리르 원https://www.flir.fr/products/flir-one-gen-3/?vertical=condition+monitoring&segment=solutions관류 온도 모니터링
튜빙 (n° 16)마스터플렉스13-310-282기계 관류 설정
반코마이신 하이드로클로라이드슬레이트 운영 제약국70436-021-82퍼퓨지트 성분

참고문헌

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