방법 논문

현미경 접근을 위한 Drosophila melanogaster 간접 비행 근육의 해부

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DOI:

10.3791/69185

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2025년 11월 7일

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1Division of Biological and Biomedical Systems, School of Science and Engineering, University of Missouri Kansas City

이 논문에서

요약

초파리는 근발생의 기본 메커니즘을 이해하는 강력한 모델입니다. 흉부 반절편 절편을 해부 및 준비하기 위한 이 프로토콜은 번데기 및 성인 단계 모두에서 간접 비행 근육의 현미경 분석을 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 세포 형태, 단백질 국소화, 근육 구조 및 근형성의 기타 여러 측면의 공초점 이미징을 가능하게 합니다.

초록

Drosophila melanogaster의 간접 비행 근육(IFM)은 근 형성의 기본 원리를 탐구하는 강력한 유전 모델입니다. 수축 메커니즘과 많은 근절 구성 요소는 파리에서 척추동물에 이르기까지 보존되어 전사 조절 및 RNA 처리에서 근육 발달을 지시하고 미세 조정하는 대사 및 기계생물학에 이르기까지 세포 과정을 연구할 수 있습니다. 이러한 세포 경로 중 다수는 인간 근병증에서 변경되며 IFM 연구는 근육 질환의 분자 병인에 대한 관련 통찰력을 제공합니다. 특히, 파리는 근형성 사양에서 근원섬유 형성, 성숙 및 유지에 이르기까지 IFM 근형성의 전체 과정에서 근섬유 및 근절 형태와 기능을 분석하기 위한 현미경 검사에 매우 적합합니다. 여기에서는 현미경 접근법을 위한 번데기 및 성인 시점에서 D. melanogaster IFM의 해부를 위한 프로토콜이 제시됩니다. 후기 번데기 및 성체 IFM의 반흉부 해부와 초기 번데기 IFM의 오픈 북 해부에 대한 그림 프로토콜이 제공됩니다. 고정, 염색 및 샘플 장착 절차와 일반적인 해부 아티팩트가 설명되어 있으며, IFM 해부와 다양한 고정 시약의 호환성을 보여주는 대표적인 데이터가 있습니다. 이 프로토콜은 번데기 형성(APF) 후 26시간, 72시간 APF 및 성인 IFM에서 RNA 결합 단백질 생존 운동 뉴런(Smn)의 저형성 SmnE33 대립유전자를 연구하기 위해 적용되어 척수 운동 위축(SMA) 모델에 대한 새로운 통찰력을 제공하고 이 프로토콜의 일반적인 유용성을 보여줍니다. 이 상세한 프로토콜은 근형성의 원리를 조사하기 위해 IFM 모델 시스템에 대한 액세스 및 고품질 현미경 데이터 획득을 용이하게 합니다.

서론

동물은 보행을 가능하게 하는 것부터 말을 용이하게 하는 것, 도구를 잡는 것까지 다양한 움직임을 제어하는 수백 개의 근육을 가지고 있습니다. 이러한 광범위한 기능을 지원하기 위해 근육은 크기, 부착, 수축 능력, 신진대사 및 유전자 발현이 다릅니다1. 근육 생물학 분야의 주요 초점은 이러한 구조적 및 기능적 차이가 발달 중에 어떻게 발생하고 근육 질환에서 변경되는지 이해하는 것입니다2. 근육 수축은 M-라인3에 고정된 양극성 미오신 함유 두꺼운 필라멘트와 교차하는 Z-디스크에 고정된 액틴 함유 얇은 필라멘트로 구성된 근절체에 의해 구동됩니다. 근절은 근원섬유로 끝에서 끝까지 조직되며, 줄무늬 근육의 이러한 규칙적인 배열은 현미경 하에서 밝은 띠와 어두운 띠가 번갈아 가며 나타나며4, 근절 조립 및 조직의 변화를 모니터링하는 실용적인 시각적 방법을 제공합니다. 유전학 및 생화학적 접근법과 결합하여 현미경은 근육 발달 및 기능을 지시하고 미세 조정하는 전사 조절, RNA 처리, 대사 및 기계적 형질도입과 같은 세포 과정에 대한 중요한 통찰력을 제공했습니다 5,6,7. 이러한 세포 과정 중 다수는 인간 근병증 및 신경근 장애에서 중단되며8,9, 근육 질환의 병인에 대한 통찰력을 얻기 위해 근육 발달을 이해하는 것이 중요하다는 점을 강조합니다. 유전 공학의 발전으로 개별 세포의 조작 및 단백질의 내인성 표지10,11 이미지 획득 및 해상도12,13의 기술 발전과 결합되어 근육 연구에 대한 현미경의 지속적인 중요성이 보장됩니다. 따라서 근육 해부 및 샘플 준비를 위한 명확하고 쉽게 구현된 프로토콜을 갖춘 모델 시스템은 근육 분야에서 가치가 있습니다.

D. melanogaster의 간접 비행 근육(IFM)은 근 형성의 기본 원리를 연구하기 위한 강력하고 잘 특성화된 모델입니다8. IFM은 유충 근육 주형에 형성되는 반흉부당 6개의 등쪽-세로 근육(DLM)과 번데기 발달 중에 새로 구축되는 7개의 등쪽-복부 근육 섬유(DVM)로 구성됩니다14. 정중선 근처의 접근성으로 인해 많은 IFM 연구는 흉부의 전체 1mm 길이에 걸쳐 있는 성인 파리의 가장 큰 근육인 DLM에 초점을 맞추고 있습니다15. 번데기가 시작될 때 IFM 근모세포는 날개 디스크 힌지의 틈새에서 흉부로 이동하여 융합하여 세포융합 근관을 형성합니다16. 27°C에서 약 24시간 APF에 힘줄 부착 후, IFM 근섬유는 점진적으로 세포질과 세포골격을 조직하고 압축하며 30-32시간 APF17에서 근원섬유형성을 시작합니다. 새로운 근절이 근원섬유에 추가되고 근섬유가 성장하여 약 48시간 APF까지 흉부를 채웁니다. 그런 다음 IFM은 성인 대사 및 수축 특성의 획득과 스트레치 활성화를 촉진하는 전사 및 접합의 변화와 일치하는 성숙 과정을 거칩니다18. 성충 파리는 27°C에서 90시간에서 100시간 APF 사이, 25°C에서 약 100시간 APF(암컷은 약 98시간 APF, 수컷은 약 102시간 APF) 번데기 케이스에서 닫힙 케이스에서 닫힙니다19. IFM은 다재다능하고 관련성이 높은 모델 시스템입니다. 그들은 근형성의 모든 단계에서 모니터링될 수 있고, 플라이의 다른 근섬유 유형과 형태학적, 기능적으로 구별되며, 접근 가능한 다양한 유전 도구 및 조작 접근법의 이점을 누릴 수 있습니다 8,20. 수축 메커니즘, 기본 근절 형태 및 많은 구조적 구성 요소는 파리에서 척추동물로 보존되어 5, 파리에서 인간으로 근원성 원리를 번역할 수 있습니다. 실제로, 근긴장성 이영양증, 척수 운동 위축증(SMA), 근원섬유 근병증 및 방선병증과 같은 신경근 질환의 파리 모델은 병인학적 및 치료적 통찰력을 제공했습니다21,22. 특히, 파리는 근모세포 사양에서 근원섬유 형성, 근절 성숙 및 유지에 이르기까지 근형성 전반에 걸쳐 근섬유 및 근절 형태를 분석하기 위한 현미경 검사에 매우 적합합니다.

초파리 IFM은 4년 이상 현미경 응용 분야에 사용되어 근육 성장 및 발달에 대한 이해에 크게 기여해 왔습니다8. 이 기간 동안 IFM 해부 프로토콜은 기술이 발전함에 따라 지속적으로 조정되어 일부 이미징 기술에는 최적이고 다른 이미징 기술에는 차선책인 다양한 수준의 세부 사항으로 제시되는 광범위한 프로토콜이 탄생했습니다. 예를 들어, 전자 현미경을 위해 개발된 프로토콜에는 강력한 고정 조건, 초박막 절편 및 중금속 3,23,24,25를 사용한 조영제 염색이 포함되지만 광학 현미경에는 최적이 아닙니다. 생화학적 분석 또는 분자 분석에 사용하기 위해 흉부에서 IFM을 신속하게 해부하기 위해 개발된 프로토콜26,27 조직 컨텍스트를 잃고 근원섬유 구조를 파괴할 수 있으므로 현미경 접근법에 최적이 아닙니다. 해부 접근법은 유충 근육 또는 성충 복부 근육20,28의 분석을 위해 개발되었지만 온전한 IFM의 분리에는 최적이 아닙니다. 라이브 이미징 접근법은 이미징 과정 동안 IFM 조직을 살아 유지하기 위해 최소 침습 해부 또는 특수 매체가 필요하며29,30, 면역조직화학을 위해 근육을 보존하는 데 필요한 고정 단계를 포함하지 않습니다. IFM 조직의 파라핀 포매 또는 냉동 절편을 위한 여러 프로토콜이 존재하며 조직화학 또는 항체 염색 27,31,32과 호환되지만, 이러한 접근법은 일반적으로 근육 미세균을 변경하고 1차 항체에 의한 특정 항원의 인식을 제한할 수 있는 동결 및 조직 탈수를 포함합니다. IFM을 직접 고정하는 프로토콜은 근육 형태를 보존하고 항원 형태의 변화를 제한하며 많은 면역조직화학 실험에 적합합니다24. 그러나, 이러한 프로토콜은 또한 특정 응용 분야, 예를 들어, 형광, cryoEM 또는 초해상도 현미경 20,33,34에 의한 단일 근원근 분석을 가능하게 하는 IFM을 해리시키는 프로토콜을 표적으로 한다. 다른 예로는 흉부로부터 온전한 IFM 섬유를 해부하는 프로토콜(32,35) 또는 온전한 맥락에서 근섬유 및 근절체의 분석을 가능하게 하는 전체 마운트 또는 반흉부 준비물(20,32,36)를 생성하기 위한 프로토콜이 있다. 신규 사용자가 대부분이 텍스트 기반인 수많은 기존 프로토콜을 정렬하는 것은 어려울 수 있습니다. 연수생과 학부 연구원은 표준 면역조직화학 응용 분야에 적용되는 상세한 IFM 해부 프로토콜의 이점을 누릴 수 있습니다.

이 기사에는 면역조직화학 현미경 접근법을 위한 번데기 및 성체 단계에서 D. melanogaster IFM의 해부 및 준비를 위한 일련의 프로토콜이 포함되어 있습니다. 이 접근법은 IFM 근형성 전반에 걸쳐 RNA 결합 단백질 Bruno137 및 Rbfox138의 발달 기능을 추적하는 최근 간행물에서 사용되었습니다. 이 프로토콜에는 흉부가 정중선을 따라 양분되어 근섬유 구조를 그대로 유지하는 성인 및 후기 번데기(48시간에서 96시간 APF) IFM의 IFM 반흉부 해부를 통해 잠재적 사용자를 안내하는 자세한 그림과 단계별 이미지가 포함되어 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 책을 펴는 것처럼 흉부의 복부 부분을 슬릿하고 들어 올려 등쪽 표피에 부착된 온전한 IFM을 노출시키는 초기 번데기(8시간에서 48시간 APF) 단계의 개봉 책 해부를 다룹니다. 프로토콜의 추가 단계에는 고정, 염색 및 샘플 장착이 포함되며, 대표적인 데이터는 이 접근법이 면역조직화학 및 형광 현미경을 위한 조직을 준비하기 위한 다양한 고정 방법과 호환된다는 것을 보여줍니다. 새로운 사용자가 일반적인 해부 아티팩트를 식별하는 데 도움이 되는 대표적인 예가 제공됩니다. 이 프로토콜은 26시간 APF, 72시간 APF 및 성인 IFM에서 척수 운동 위축(SMA)21,39의 파리 모델로 사용되는 생존 운동 뉴런(Smn)의 저형성 대립유전자인 SmnE33의 발달 IFM 표현형을 분석하기 위해 적용됩니다. 여기에 제시된 데이터는 Smn의 근육 특이적 기능에 대한 통찰력을 제공하고 근육 발달 및 근육 질환의 병인을 연구하기 위한 이 해부 프로토콜의 적용 가능성을 강조합니다.

프로토콜

윤리적 진술:
이 프로토콜의 모든 실험은 전대사 곤충인 Drosophila melanogaster를 사용합니다. 무척추동물은 미국의 동물 복지 규정의 적용을 받지 않으며 사용에는 윤리적 승인이 필요하지 않습니다. 모든 작업은 표준 기관 생물안전 및 실험실 안전 지침에 따라 수행되었으며 프로토콜 번호 21940(22-11)에 따라 미주리 대학교 캔자스시티 기관 생물안전 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 성인 IFM의 반흉부 박리(그림 1)

  1. 생물학 팁이 있는 Dumont #5 집게, Dumont #3 집게, Vannas 스프링 가위 한 쌍, 플라스틱 피펫, 페인트 브러시, 24웰 플레이트, 보푸라기가 없는 물티슈, 현미경 슬라이드 및 극저온 조절기 블레이드를 포함하여 필요한 소모품을 조립합니다( 재료 표 참조). 1x PBS, 0.05% PBS-T 및 고정 용액을 준비합니다( 보충 파일 1 참조). 다음 성인 반흉부 박리의 흐름도 개요를 사용할 수 있습니다(보충 그림 1).
  2. 원하는 유전자형 및 연령의 성인을 수집합니다(예: 새로 폐쇄된 성인, 1일 성인 또는 5일 성인). CO2 또는 얼음 위의 샘플 파리를 마취합니다.
    참고: 이 프로토콜에 사용된 파리는 온도 및 습도 조절 인큐베이터에서 12시간 낮 : 12시간 야간 주기로 성장했습니다. 초파리는 25°C 또는 27°C에서 표준적으로 자라며 18°C에서 자랄 수 있어 성장주기가 10일에서 약 20일로 연장됩니다.
  3. 플라스틱 피펫을 사용하여 1x PBS40 방울을 실체 해부 현미경 아래의 현미경 슬라이드로 옮깁니다.
  4. 페인트 브러시 또는 집게를 사용하여 샘플 파리를 소그룹으로 PBS 방울로 옮깁니다(그림 1A). Vannas 스프링 가위를 사용하여 머리(그림 1B), 날개(그림 1C - D) 및 복부(그림 1E)를 제거합니다. 다리를 부착한 상태로 둡니다(그림 1F).
  5. 브러시 또는 겸자를 사용하여 흉부를 24웰 플레이트의 한 웰에 있는 500μL 고정 용액으로 부드럽게 옮깁니다. 장동/흔들기 셰이커에 원하는 시간(일반적으로 15-60분) 동안 고정합니다.
    참고: 이 프로토콜은 파라포름알데히드, 글루타르알데히드, 메탄올, 글리옥살 용액 등을 포함한 여러 고정 완충액과 호환됩니다. 고정 조건 최적화에 대한 자세한 내용은 대표 결과 및 보충 파일 1 을 참조하십시오. 고정액은 기관의 유해 화학 물질 지침에 따라 장갑과 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 사용하여 다루어야 합니다.
  6. 200μL 피펫으로 고정액을 제거하고 1mL의 0.05% PBS-T를 장동기/흔들기 셰이커에 실온에서 5분 동안 세척합니다.
    알림: 기관의 유해 화학 물질 지침에 따라 고정제를 폐기하십시오. 대부분의 항원의 경우, 고정된 가슴은 절단 및 염색 전에 4°C에서 최대 2주 동안 1mL의 0.05% PBS-T에 보관할 수 있습니다. 세제에 장기간 배양하면 근절 구조가 저하될 수 있으므로 사용 전에 더 높은 농도의 Triton X-100을 테스트해야 합니다.
  7. 200μL 피펫으로 완충액을 제거하고 브러시 또는 겸자를 사용하여 실체 해부 현미경 아래의 현미경 슬라이드에 있는 0.05% PBS-T 방울로 흉부를 옮깁니다.
  8. scutellum이 위를 향하도록 흉부의 방향을 잡고 한 쌍의 Dumont #3 겸자 사이에서 안정화합니다(그림 1G-H).
  9. 극저온 조절기 블레이드를 흉부를 가로질러 밀어 scutellum을 노치한 다음(그림 1H, J, L), 정중선을 따라 한 번의 부드러운 하향 스트로크로 절단합니다(그림 1I, J, L - N) IFM을 노출시키는 흉부 반절을 생성합니다(그림 1K).
    알림: 근절 구조를 손상시키는 늘어나는 아티팩트를 방지하기 위해 IFM을 절단하기 전에 큐티클에 "노치"가 있거나 금이 가는 것이 중요합니다. 이 동작은 IFM을 기계적으로 손상시켜 근원섬유가 닳게 되므로 블레이드를 앞뒤로 "톱질"하지 마십시오. 완충기가 너무 많으면 겸자 사이의 흉부가 불안정해지고 절단이 더 어려워집니다. 대체 접근 방식에는 절단을 용이하게 하기 위해 양면 테이프로 흉부를 한 번에 하나씩 안정화하는 것과 흉부의 복부 쪽에서 절단하는 것이 포함됩니다.
  10. 흉부의 두 반쪽을 슬라이드의 위치로 이동하여 건조를 방지하기 위해 완충 장치로 덮인 상태로 유지되지만 향후 절단을 방해하지 않습니다. 모든 흉부가 절단될 때까지 1.8-1.10단계를 반복합니다.
  11. 겸자를 사용하여 현미경 슬라이드에서 흉부 반절편을 24웰 플레이트의 한 웰에 있는 500μL의 0.05% PBS-T로 옮기고 차단 및 면역염색을 진행합니다(아래 섹션 4 참조).

2. 후기 번데기 IFM의 반흉부 박리(~48시간 내지 96시간 APF)(그림 2, 그림 3)

  1. 원하는 유전자형의 번데기 및 번데기 발달에서 선택된 지점까지의 나이(그림 2). 젖은 붓을 사용하여 수컷 또는 암컷의 흰색 전번데기(그림 2A, B)를 수집하고 60mm 세포 배양 접시에서 젖은 여과지에서 배양합니다. 번데기 병기 결정 및 번데기 케이스로부터의 제거는 이전에 설명되었습니다20,26.
    참고: 번데기는 나이가 들면서 번데기 케이스, 눈 및 강모의 머리 외전 및 색소 침착과 같은 여러 형태학적 변화를 겪습니다19,41 (그림 2C). 이러한 형태학적 특징은 번데기의 나이를 식별하고(그림 2D-E) 정상적으로 발달하지 못하는 번데기를 식별하기 위한 대략적인 지침으로 사용될 수 있습니다(그림 2F). 그러나 정확한 병기 일정을 보장하려면 좁은 시간 창(예: 30분마다 또는 2시간마다 병기 지정)에 흰색 전번데기를 수집하는 것이 좋습니다. 24시간에서 35시간 APF까지 발생하는 세포골격 구조 및 근섬유 길이의 주요 변화를 구별하고 35시간, 48시간, 60시간, 72시간, 80시간 및 90시간 APF에서 근절 구조의 차이를 구별하기 위해서는 긴밀하게 단계화된 시점이 필요합니다18,42.
  2. 페인트 브러시, 생물학 팁이 있는 Dumont #5 집게, Vannas 스프링 가위 한 쌍, 양면 테이프, 현미경 슬라이드, 플라스틱 피펫, 24웰 플레이트, Kimwipes 및 극저온 조절기 블레이드를 포함하여 필요한 소모품을 조립합니다( 재료 표 참조). 1x PBS, 0.05% PBS-T 및 고정 용액을 준비합니다( 보충 파일 1 참조). 다음 번데기 반흉부 박리의 흐름도 개요를 사용할 수 있습니다(보충 그림 2).
  3. 원하는 시점에서 붓을 사용하여 여과지에서 10-20배 배율로 실체 해부 현미경 아래의 현미경 슬라이드에 부착된 양면 테이프 스트립으로 번데기를 옮깁니다(그림 3A,B). 복부면이 아래로 향하도록 테이프에 번데기를 정렬합니다.
  4. 한 쌍의 #5 집게를 사용하여 첫 번째 번데기의 번데기 케이스 전면을 열고 개구부(머리 위 영역)를 부드럽게 제거합니다(그림 3C, D, I).
  5. #5 집게를 조심스럽게 사용하여 날개 바로 등쪽의 번데기 케이스를 따라 자르고 번데기 케이스를 번데기에서 1-2mm 단위로 떼어냅니다. 번데기 케이스를 양면 테이프에 붙이면서 앞쪽에서 뒤쪽으로 작업합니다(그림 3E - G, I). 번데기 자체를 찌르지 말고 번데기 케이스와 번데기를 둘러싼 기저막/번데낭 사이에 집게 끝을 삽입하십시오.
  6. 케이스를 제거한 후 집게로 퍼내는 동작을 사용하여 아래로 들어 올리고(그림 3H, I) 탈수를 방지하기 위해 두 번째 현미경 슬라이드(그림 3J, K)에 있는 1x PBS의 방울로 번데기를 케이스 밖으로 부드럽게 옮깁니다. 번데기 케이스에서 모든 번데기가 제거될 때까지 2.4-2.6단계(그림 3I)를 반복합니다.
  7. Vannas 스프링 가위를 사용하여 해부된 번데기에서 복부를 제거합니다(그림 3L).
    참고: 다음 단계에서 고정액에 의한 더 나은 침투를 가능하게 하기 위해 복부를 제거합니다. 흉부 손상을 방지하려면 복부를 직접 절단하여 복부의 최대 30%를 흉부에 부착시킵니다.
  8. 브러시 또는 집게를 사용하여 흉부(그림 3M)와 함께 번데기 머리를 24웰 플레이트의 한 웰에 있는 고정 용액 500μL로 부드럽게 옮깁니다. 원하는 시간(일반적으로 15-60분) 동안 고정하고 1.5-1.6단계에서 설명한 대로 0.05% PBS-T 1mL로 세척합니다.
  9. 200μL 피펫으로 완충액을 제거하고 브러시 또는 집게를 사용하여 10배 배율의 스테레오 해부 현미경 아래 현미경 슬라이드에 0.05% PBS-T 방울로 흉부를 옮깁니다.
  10. 하나의 샘플을 나머지 샘플에서 분리하고 복부 쪽이 아래로 향하도록 방향을 잡고 한 쌍의 Dumont #3 집게로 안정화합니다(그림 3N).
  11. 기저막과 큐티클이 열릴 때까지 흉부를 가로질러 극저온 조절기 블레이드를 밀어 넣은 다음 정중선을 따라 한 번의 부드러운 하향 스트로크로 잘라 (그림 3O) IFM을 노출시키는 흉부 반쪽 절편을 생성합니다(그림 3P).
    알림: 이 동작은 IFM을 기계적으로 손상시켜 근원섬유가 닳게 하므로 블레이드를 앞뒤로 "톱질"하지 마십시오. 완충기가 너무 많으면 겸자 사이의 흉부가 불안정해지고 절단이 더 어려워집니다. 번데기 흉부는 머리를 부착하고 왼쪽 또는 오른쪽을 향하게 하여 절단할 수 있습니다.
  12. 흉부의 두 반쪽을 슬라이드의 위치로 이동하여 건조를 방지하기 위해 완충 장치로 덮인 상태로 유지되지만 향후 절단을 방해하지 않습니다. 모든 흉부가 절단될 때까지 2.10-2.12단계를 반복합니다.
  13. 겸자를 사용하여 흉부 반절편을 현미경 슬라이드에서 24웰 플레이트의 한 웰에 있는 500μL의 0.05% PBS-T로 옮기고 차단 및 면역염색을 진행합니다(아래 4단계 참조).

3. 초기 번데기 IFM의 오픈 북 해부(~15시간 내지 48시간 APF)(그림 4)

  1. 위에서 설명한 바와 같이 번데기 발달에서 선택된 지점(그림 2)까지 원하는 유전자형과 나이의 번데기를 단계화합니다(단계 2.1).
    참고: 오픈 북 해부의 경우 번데기는 8-10마리 이하의 파리 그룹으로 해부해야 합니다.
  2. 페인트 브러시, 생물학 팁이 있는 Dumont #5 집게, Vannas 스프링 가위 한 쌍, 양면 테이프, 현미경 슬라이드, 플라스틱 피펫, 검은색 실리콘 해부 접시, 검은색 유리 염색 접시, 곤충 핀 및 보푸라기가 없는 물티슈를 포함하여 필요한 소모품을 조립합니다( 재료 표 참조). 1x PBS, 0.05% PBS-T 및 고정 용액을 준비합니다( 보충 파일 1 참조). 다음 번데기 오픈 북 해부에 대한 흐름도 개요를 사용할 수 있습니다(보충 그림 3).
  3. 원하는 시점에서 2.3-2.6단계에 설명된 대로 번데기 케이스에서 번데기를 제거합니다. 번데기 케이스에서 제거한 후 1x PBS로 채워진 검은색 실리콘 해부 접시로 번데기를 옮깁니다(그림 4A).
  4. 모든 번데기가 번데기 케이스에서 분리된 후 Dumont #5 집게를 사용하여 표면 장력을 극복하고 해부된 번데기를 실리콘 표면으로 부드럽게 밀어 넣습니다. 번데기를 접시 중앙 근처에 일직선으로 배열합니다(그림 4B).
  5. Dumont #5 집게를 사용하여 각 번데기의 복부를 통해 두 개의 방충 바늘을 삽입하여 제자리에 고정합니다(그림 4C,D). 번데기가 복부면이 위로 향하도록 방향이 잡혀 있는지 확인하십시오.
  6. Vannas 스프링 가위를 사용하여 각 번데기의 기저막과 전두부 부위를 잘라냅니다(그림 4E).
  7. 가위를 개구부에 삽입하고 각 번데기의 오른쪽과 왼쪽을 따라 자릅니다(그림 4F, G, Q). 가위를 놓고 발달 중인 노팀 바로 아래를 흉부와 복부 사이의 접합부로 다시 잘라 복부 부분이 있는 다리와 날개를 제거합니다. 가위가 수평으로 삽입되었는지 확인하고 흉부의 등쪽 부분에 닿지 않도록 합니다(그림 4Q).
  8. Dumont #5 집게를 사용하여 번데기의 복부 부분을 잡고 들어 올린 다음 Vannas 스프링 가위로 제거합니다(그림 4H, I, Q).
  9. Dumont #5 겸자를 사용하여 뇌, 복부 신경 코드(VNC), 기관 및 장을 제거합니다(그림 4J,K,Q). 기관 바로 아래에 있는 발달 중인 IFM과 흉부 등쪽 부분의 표피에 부착된 VNC를 방해하지 않도록 주의하십시오.
  10. 200μL 피펫 팁의 팁을 클립하여 더 넓은 구멍을 만듭니다. 팁이 잘린 200μL 피펫을 사용하여 흉부 위에 1x PBS 완충액을 부드럽게 세척하여 나머지 지방체의 대부분을 제거하여 IFM을 노출시킵니다(그림 4L,M). 근섬유를 표피에 연결하는 힘줄 부착물이 찢어지지 않도록 부드럽게 하십시오.
  11. Vannas 스프링 가위를 사용하여 등쪽 흉부의 정중선을 잘라내어 IFM이 포함된 두 개의 "전단지"를 만듭니다(그림 4N).
  12. 가위를 사용하여 등쪽 흉부의 전단지를 복부에서 멀리 자르고(그림 4O, Q), Dumont #5 겸자를 사용하여 검은색 유리 접시에 있는 고정액 300μL로 전단지를 옮깁니다(그림 4P). IFM 근섬유나 힘줄이 손상되지 않도록 집게로 헤드 케이스의 전단지를 잡습니다.
  13. 원하는 시간(일반적으로 15분) 동안 고정합니다. 200μL 피펫을 사용하여 고정액을 조심스럽게 제거하고 500μL의 0.05% PBS-T로 세척합니다. 차단 및 면역염색을 진행합니다(아래 4단계 참조).
    알림: 녹색 유리 접시에 samp르를 두르거나 흔들지 마십시오. 초기 번데기 단계의 근육-힘줄 부착물은 매우 취약하며 지속적인 완충액 교반으로 찢어져 IFM이 손실됩니다. 용액을 교체할 때 샘플이 피펫 팁으로 빨려 들어가지 않도록 접시의 완충액 가장자리 주위를 천천히 조심스럽게 피펫팅하십시오.

4. 고정 IFM 샘플의 면역염색 및 조직화학

  1. 피펫, 피펫 팁, 필요한 항체 또는 염색제를 포함하여 필요한 소모품을 조립합니다. 0.05% PBS-T, 차단 용액 및 항체/염색 혼합물을 준비합니다( 보충 파일 1 참조).
  2. 세척액(0.05% PBS-T)을 샘플에서 피펫팅하고 차단 용액을 추가합니다. 실온에서 최소 30분 동안 스크리닝을 차단 용액에 배양합니다(1-2단계는 흔들리고, 3단계는 흔들지 않음).
    참고: 샘플은 4°C에서 밤새 차단할 수도 있습니다. 이 프로토콜에서 샘플은 0.05% PBS-T의 5% 정상 염소 혈청(NGS)에서 차단되었습니다. 차단 솔루션 옵션에 대한 자세한 내용은 보충 파일 1에 나와 있습니다.
  3. 피펫을 사용하여 흉부에서 차단 용액을 제거합니다. 1차 항체 혼합물을 첨가하고 실온에서 최소 2시간 또는 4°C에서 밤새 배양합니다(1-2단계는 흔들림, 3단계는 흔들지 않음).
    참고: 이 프로토콜은 대부분의 1차 항체와 호환됩니다. 항체는 차단 용액으로 희석해야 합니다. 이 프로토콜로 테스트된 1차 항체 희석액은 1:10에서 1:2000 사이이며 각 개별 항체에 대해 실험적으로 결정됩니다. 1차 항체 염색의 최적화에 대한 자세한 내용은 보충 파일 1에 제공됩니다.
  4. 피펫을 사용하여 1차 항체 혼합물을 제거하고 0.05% PBS-T에서 샘플을 각각 10분 동안 3회 세척합니다.
  5. 2차 항체 또는 염색 혼합물을 샘플에 추가합니다. 표백을 최소화하기 위해 알루미늄 호일 조각으로 샘플을 덮습니다. 실온에서 최소 2시간 또는 4°C에서 밤새 배양합니다(1-2단계는 흔들리고, 3단계는 흔들지 않음).
    참고: 대부분의 2차 항체 및 형광 세포 염색은 이 프로토콜과 함께 사용할 수 있습니다. 많은 2차 항체가 1:500 희석으로 사용됩니다. 아래의 대표 데이터(대표 결과 참조)에서 핵은 DAPI(1mg/mL 스톡, 0.05% PBS-T에서 1:1000 희석) 및 로다민 팔로이딘(300 단위/mL 스톡, 0.05% PBS-T에서 1:500 희석)으로 표지되었습니다.
  6. 피펫을 사용하여 2차/염색 혼합물을 제거하고 실온에서 0.05% PBS-T에서 각각 10분 동안 샘플을 4회 세척합니다. 세탁 후 바로 장착(5단계)을 진행합니다.

5. 현미경 분석을 위해 슬라이드에 염색된 샘플 장착(그림 5)

  1. 페인트 브러시, 집게, 반투명 현미경 슬라이드, 커버슬립(#1 두께), 투명 매니큐어, 마운팅 매체, 보푸라기가 없는 물티슈 등 필요한 소모품을 조립합니다( 재료 표 참조).
  2. 현미경 슬라이드의 반투명 필기 영역에 관련 샘플 번호 또는 선호하는 식별 정보(날짜, 유전자형, 항체, 슬라이드 번호 등)로 라벨을 붙입니다.
  3. 커버슬립 스페이서(#1 커버슬립)를 추가하고 샘플 배치를 위해 커버슬립 사이에 약 1cm를 남겨둡니다(그림 5A-C). 50% 글리세롤을 소량 방울로 사용하여 스페이서를 제자리에 고정합니다(그림 5A, D).
    참고: 스페이서는 두꺼운 샘플을 장착할 때 샘플 왜곡을 방지합니다. 성인 흉부에는 일반적으로 2개의 커버슬립 두께의 스페이서가 필요하고, 48시간 APF 흉부에는 1개의 커버슬립 두께의 스페이서가 필요하며, 오픈 북 전단지는 스페이서가 없습니다.
  4. 커버슬립 스페이서 사이의 웰에 마운팅 매체 한 방울을 추가하거나, 초기 번데기 샘플을 장착하는 경우 현미경 슬라이드 중앙에 마운팅 매체를 추가합니다(그림 5C-D). 슬라이드를 실체 해부 현미경 아래에 놓습니다.
    참고: 여러 유형의 마운팅 미디어를 사용할 수 있습니다. 자체 경화 배지를 사용하는 경우 배지가 경화되기 전에 샘플의 방향을 적절하게 지정할 수 있는 충분한 시간을 허용하기 위해 경화 시간이 몇 시간인 배지를 고려하십시오. 마운팅 매체는 근절 치수 43,44,45에 영향을 미치는 것으로 나타났으므로 실험의 모든 샘플에 동일한 시약을 사용해야 합니다.
  5. 피펫을 사용하여 샘플에서 가능한 한 많은 세척 완충액을 제거합니다. 집게나 붓을 사용하여 샘플을 슬라이드의 마운팅 매체 방울에 즉시 옮깁니다(그림 5E).
  6. Dumont #5 겸자를 사용하여 샘플을 행과 열로 구성하고 샘플이 겹치지 않는지 확인하고 IFM이 위를 향하도록 흉부의 방향을 지정합니다(그림 5F,J,Q,S). 방향을 잡으려면 강모/큐티클이 위를 향하는 샘플을 조심스럽게 뒤집어야 할 수 있습니다(그림 5G,H,K, L,R). 접촉하면 근절 구조가 손상되므로 IFM을 만지지 않도록 주의하십시오(대표 결과 참조).
  7. 흉부 샘플 위에 #1 커버슬립(18 x 18mm 또는 22 x 22mm)을 조심스럽게 추가합니다(그림 5M). 스페이서를 사용하는 경우 샘플의 양쪽에 있는 스페이서에 닿을 때까지 커버슬립을 부드럽게 누릅니다(그림 5N).
  8. 피펫 팁 또는 스포이드를 사용하여 모든 흉부가 둘러쌀 때까지 샘플 영역을 장착 매체로 다시 채웁니다(그림 5O). 이미지 획득을 방해하는 기포를 생성하지 마십시오.
  9. 투명 매니큐어를 사용하여 습식 마운트를 밀봉하십시오. 샘플 커버슬립과 스페이서 커버슬립 주변을 모두 밀봉하는 것을 잊지 마십시오(그림 5P,S).
    알림: 탑 코트나 속건성 매니큐어는 밀봉이 잘 되지 않고 마운팅 매체가 증발하면서 기포가 형성되므로 사용하지 마십시오.
  10. 실온에서 10분 동안 슬라이드를 건조시킵니다. 4°C의 슬라이드 케이스에 보관하십시오. 슬라이드는 며칠 또는 몇 주 동안 이미지화할 수 있습니다.
  11. 실험 설계에 따라 형광 현미경, 공초점 현미경 또는 기타 시스템에서 샘플을 이미지화합니다. 획득 및 이미지 분석을 위한 프로토콜은 다른 곳에서 사용할 수 있습니다 14,30,46,47,48.

결과

위에 제시된 해부 프로토콜은 오픈 북 방법(3단계)을 사용하여 번데기 형성(APF) 후 빠르면 8시간부터 반흉부 해부 접근법(1단계 및 2단계)을 사용하여 성인 단계까지 IFM 근섬유 및 근절모 형태의 현미경 분석을 위한 고품질 샘플을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 해부는 무엇보다도 근육 및 근절 형성 18,42,49, 전사 인자 기능 50,51 및 RNA 조절37,38을 조사하는 데 적용되었습니다. 아래에 제공된 대표적인 결과는 이 프로토콜과 다양한 고정 방법의 호환성을 보여주고, 일반적인 해부 인공물을 자세히 설명하며, SmnE33 돌연변이 표현형을 사용하여 IFM 모델에서 형태학적 및 세포 생물학적 문제를 해결하기 위한 이 프로토콜의 유용성을 설명합니다.

IFM 해부는 여러 고정 방법과 호환됩니다.

조직화학 또는 면역형광 시료를 위한 시료 전처리의 중요한 측면은 고정을 통한 세포 구조의 정확한 보존입니다. 고정액은 가교를 통해 분해를 방지하고 단백질 및 지질 구조를 안정화함으로써 조직 구조와 형태를 보존합니다52,53. 예를 들어, 알데히드 기반 대 유기 용매와 같은 다른 종류의 고정제는 서로 다른 침투 및 가교 효율을 가지며 서로 다른 작용기를 표적으로 삼아 항체-표적 인식에 차등적으로 영향을 미칩니다53,54. IFM 해부는 4% 파라포름알데히드(PFA), 9% 글리옥살 및 메탄올 고정(그림 6)을 포함한 여러 고정 방법과 호환되므로 이 해부 프로토콜의 일반적인 유용성을 강조합니다.

근절의 크기와 형태를 다른 고정 방법의 적용과 비교하기 위해 1일 성인 w1118 파리의 반흉부 절제술을 수행했습니다. 인산염 완충 식염수(PBS)(그림 6A,E) 또는 이완 용액(RS)(그림 6B,F)에서 4% PFA 고정을 비교했습니다. 이완 용액은 ATP를 함유하고 있으며 이완 상태에서 근절을 보존하기 위해 근절 치수를 정량화할 때 사용하는 것이 좋습니다(보충 파일 1 참조). 4% PFA 고정은 근절 형태를 효과적으로 보존하지만 PBS와 RS에서 4% PFA 고정 사이에 근절 폭의 유의미한 차이가 나타났습니다(그림 6I,J). 메탄올 고정은 근섬유 및 근절 구조를 보존했지만(그림 6C,G), 근절은 4% PFA 고정보다 현저히 짧고 얇았습니다(그림 6I,J). IFM은 하룻밤 사이에 9% 글리옥살 고정(그림 6D,H)(3% 글리옥살 고정은 효과가 없음)으로 효과적으로 보존될 수 있었으며, 이는 또한 4% PFA 고정과 비교하여 근절 폭을 크게 변경했습니다(그림 6I,J). 결론적으로, IFM 헤미토레이스는 여러 고정제로 효과적으로 보존될 수 있습니다. 그러나 고정제와 완충액 모두 근절 치수 측정에 영향을 미칠 수 있으므로 실험은 적절한 대조군과 잘 정의되고 일관된 고정 프로토콜로 설계되어야 합니다.

IFM의 일반적인 해부 및 고정 아티팩트

특히 신규 사용자와 연수생의 경우 현미경 검사의 한 가지 과제는 기술적 인공물을 골간 표현형과 구별하는 것입니다. 초파리 IFM에서 이러한 구별을 돕기 위해 가장 일반적으로 관찰되는 인공물 및 해부 실패에 대한 대표 데이터가 제시됩니다(그림 6). 고정 프로토콜은 과소 또는 과다 고정을 피하기 위해 고정의 유형, 농도 및 길이의 최적화가 필요합니다 52,53,54. 이완 용액의 4% PFA에서 배양한 w 1118 1일 성인 반흉부 박리의 고정 시간 경과를 사용하여 15분 또는 30분의 고정 시간은 근절 형태를 정확하게 보존하는 반면, 7분 고정은 일관되지 않은 근절 형태를 생성하는 것으로 관찰되었습니다(그림 6K-M). 또한 조직은 고정 시간이 짧고 단단성이 낮기 때문에 IFM을 손상시키지 않고 흉부를 절단하고 이등분하기가 더 어렵습니다. 절단 및 장착 과정에서 추가 아티팩트가 발생할 수 있습니다. IFM 근섬유 구조는 블레이드가 무뎌져 찢어지거나 닳거나 닳거나 블레이드가 미끄러지거나 절단이 기울어진 경우(그림 6O)가 불규칙하게 나타날 수 있습니다. 집게가 취급 또는 장착 중에 고정 IFM과 직접 접촉하면 디봇이나 스트레칭으로 이어질 수 있는 인상을 남기고 사르코메어가 분리될 수 있습니다(그림 6P). 절단, 취급 또는 장착 중에 흉부가 늘어나거나 변형되면 근절이 분리되어 명확하게 구분된 Z-디스크가 손실됩니다(그림 6Q). 마지막으로, 겸자나 칼날로 IFM을 "톱질" 또는 "문지르기"하면 특히 근섬유 표면에서 근원섬유의 마모 및 풀림, 해어짐 및 무질서가 발생합니다(그림 6R). 잠재 사용자는 이러한 기술적 아티팩트에 익숙해지고 표현형 분석에서 제외해야 합니다.

IFM에서 Smn E33 표현형의 발달 진행

오픈 북 및 반흉부 해부는 근육 표현형의 발달 궤적을 추적하고 발달 중 관심 유전자가 작용하거나 근원섬유 표현형이 발생하는 시기를 정확히 찾아내는 데 특히 유용합니다. RNA 결합 단백질 생존 운동 뉴런(Smn)39의 저형성 대립유전자인 SmnE33의 IFM 발달 표현형은 오픈 북 및 반흉부 해부의 광범위한 유용성을 보여주는 대표적인 데이터로 제시됩니다.

스플라이소좀을 형성하는 작은 핵 리보핵단백질(snRNP)은 스플라이싱 반응을 촉매하여 mRNA를 생성하는 거대분자 복합체입니다.7, SMN 복합체에 의해 조립됩니다. 생존 운동 뉴런(Smn)과 Gemin 단백질로 구성된 SMN 복합체는 모든 유기체의 생존 가능성에 필요합니다56. 인간의 SMN 수치 감소는 심각한 유전성 신경근 장애인 척수 운동 위축(SMA)21을 유발합니다. 초파리는 저형성 대립유전자 SmnE33의 발달을 포함하여 SMA의 병인과 Smn의 세포 기능을 이해하기 위한 모델로 사용되었습니다. SmnE33 파리는 생존 가능하고 번식력이 있지만 날거나 점프할 수는 없습니다39. SmnE33 파리는 운동 뉴런 수목화 결함을 가지고 있지만 무질서한 IFM 구조와 비행 근육 특이적 Actin88F 발현 손실을 나타냅니다39,57. SMN은 파리와 생쥐의 Z-디스크에서 알파-악티닌과 공동 국소화되어있으며39, 이는 Smn이 근육 특이적 기능을 가질 수 있음을 시사합니다.

근원섬유 구조가 손실되고 근육 발달에 Smn 기능이 필요한 시기를 더 잘 이해하기 위해 26시간 APF, 72시간 APF 및 1-5일 성인에서 IFM에서 SmnE33 표현형의 발달 시간 경과 분석을 수행했습니다. 72시간 APF와 성인 모두에서 대조군 w1118 IFM은 강한 팔로이딘 염색 F-액틴 신호(그림 7E,E',I,I') 및 규칙적인 근절 구조(그림 7G,G',K,K')를 갖는 반면, 팔로이딘 신호는 극적으로 감소하고(그림 7F,F',J,J') SmnE33에서 근절 구조가 없습니다(그림 7H,H',L,L') IFM입니다. 대신 F-액틴은 핵 주변의 그물 모양 구조 또는 세포질의 불규칙한 다발 또는 "스타버스트" 구조에서 관찰되며(그림 7H,H',L,L'), Act88F 발현18, 39의 손실 및 얇은 필라멘트를 조립할 수 없음과 일치합니다. 26시간 APF에서 SmnE33 표현형을 조사하기 위해 오픈 북 해부를 수행했으며 초기 IFM 발달이 SmnE33에서 정상적으로 진행되는 것으로 나타났습니다. w1118 대조군 IFM(그림 7A,A',C,C')과 비교할 수 있듯이, SmnE33 파리는 반흉부당 6개의 등쪽 세로 IFM 섬유를 가지며, 근섬유 형성 전에 근섬유 주변에 조직화된 F-액틴 케이블을 형성하고(그림 7B,B'), 근섬유 전체에 메쉬 모양의 F-액틴 네트워크를 표시합니다(그림 7D,D'). 이러한 결과는 IFM 분화의 초기 단계가 정상적으로 진행되는 반면, Smn은 Act88F 발현을 유지하고 근절을 구축하기 위해 IFM 발달의 후기 단계에서 필요하다는 것을 나타냅니다. 중요한 것은 이러한 대표적인 결과가 오픈 북 및 반흉부 해부로 달성할 수 있는 표현형 세부 사항과 해상도를 보여준다는 것입니다.

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그림 1: 성인 IFM의 반절편 해부. (A) 현미경 슬라이드의 1x PBS에 성인 파리를 배치합니다. (B) 집게(청록색, 점)를 사용하여 플라이를 안정시키고 가위(주황색)로 머리를 제거합니다. (CE) 왼쪽(C)과 오른쪽(D) 날개와 복부(E)를 제거합니다. (F) 머리, 복부, 날개를 버리고 흉부를 고정제로 옮깁니다. (G,H) 집게를 사용하여 방향(H)을 안정화하기 위해 집게를 사용하여 후방(P)과 盾칼이 위를 향하도록 (G)하는 1x PBS-T 방울로 슬라이드에 고정된 흉부를 방향을 지정합니다. (아이케이) 극저온 조절기 블레이드를 사용하여 흉부를 반으로 자르고(I-J) 두 개의 흉부 반단면(K)을 생성합니다. (L) 반절편을 생성하기 위한 시상 절단의 위치를 보여주는 극저온 조절기 블레이드와 흉부의 다이어그램. 칼날을 오른쪽으로 밀어 흉부의 盾칼에 노치를 낸 다음 부드러운 동작(노란색 화살표)으로 아래쪽으로 움직여 흉부(빨간색 점선)를 자릅니다. (M,N) 주요 근육 그룹의 위치와 절단 위치(노란색 삼각형 사이)를 보여주는 흉부의 관상(M) 및 가로(N) 보기의 개략도. 흉부의 방향이 표시됩니다(L, 왼쪽; R, 오른쪽; V, 복부; D, 등쪽; A, 전방; P, 후방). 스케일 바 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 번데기 병기 및 번데기 발달의 특징. (A) 수컷 및 (B) 암컷 번데기는 0-2시간 APF에서 흰색 사전 번데기로 구별할 수 있습니다. 수컷 번데기는 뒤쪽(화살표)을 향해 한 쌍의 둥근 반투명 구조(발달 중인 고환)를 가지고 있습니다. (C) 번데기 발달의 특징이 되는 특징 표. 특징으로는 번데기 케이스의 성숙, 머리 외전, 번데기에서 번데기 분리, 눈 색소 침착의 발달, 강모, 날개, 다리, 에판드리움 및 큐티클의 색소 침착, 처녀 반점(태변)의 가시성 등이 있습니다. 눈 색깔과 색소 침착은 점진적으로 어두워집니다. 표의 각 열 상단에 표시된 번데기 발달의 시기와 단계(검은색 텍스트로 표시된 시점, 아래 파란색 텍스트로 표시된 번데기 발달의 해당 단계)는 이전에 Bainbridge 및 Bownes19,41에 의해 정의되었습니다. (D-E) 적목 눈이 있는 온전한 번데기에서 0-2시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간 APF에서 번데기 발달의 시간 경과(D; Mef2-Gal4, fln-GFP) 그리고 번데기 케이스에서 해부된 주황색 눈을 가진 번데기(E; Fln-Gal4)을 사용합니다. 48시간에서 96시간 APF까지 눈과 강모가 점진적으로 어두워지는 것을 주목하십시오. (F) 발달의 초기, 중기 및 후기 시점에서 번데기 치사율의 예. Pharate 치명적인 파리는 완전히 형성되지만 번데기 케이스에서 완전히 닫히지 못합니다. 스케일 바 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 번데기 IFM의 반절편 해부(>48시간 APF). (AH) 번데기 케이스에서 번데기 제거. 번데기를 양면 테이프 스트립(A,B)에 붙입니다. 전방 능선(C)에서 열리고 한 쌍의 Dumont #5 겸자를 사용하여 개골(D)을 제거합니다(파란색, 화살표는 이동 방향을 나타내고 점은 고정되어 있음). 집게를 사용하여 번데기 케이스를 스트립(G)으로 잘라내고(E) 벗겨냅니다(F). 번데기 케이스의 스트립이 양면 테이프에 부착됩니다. 복부를 노출시킨 후 번데기를 케이스(H)에서 들어 올립니다. (I) 번데기 케이스에서 번데기를 해부하는 과정을 보여주는 개략도. 회로도의 각 단계에 해당하는 그림 패널에는 레이블이 지정되어 있습니다(하단). 빨간색 점선은 번데기를 손상시키지 않고 집게를 삽입하여 번데기 케이스를 잘라낼 수 있는 위치를 표시합니다. (J-L) 케이스(J)에서 번데기를 제거하고 1x PBS(K) 방울로 현미경 슬라이드로 옮긴 후 가위를 사용하여 복부(L)를 제거합니다. (M) 복부를 버리고 흉부를 고정제로 옮깁니다. (N) 고정 후, 번데기 흉부를 1x PBS-T 방울의 슬라이드로 옮깁니다. 번데기 등쪽을 위로 향하게 하고 집게로 안정시킵니다. (O-P) 극저온 조절기 블레이드(O)를 사용하여 번데기 반절편(P)을 절단합니다. 절단 배치는 그림 1 M-N과 동일합니다. 스케일 바 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 번데기 IFM의 오픈 북 해부(<48시간 APF). (A) 그림 3 A-I와 같이 번데기 케이스에서 번데기를 제거한 후, 번데기를 블랙 실리콘 해부 접시에서 1x PBS로 옮깁니다. (B-D) 집게(B)를 사용하여 번데기를 실리콘 접시 표면으로 부드럽게 밀고 두 개의 곤충 핀(C,D)을 사용하여 복부 쪽을 위로 고정합니다. (E) 가위(주황색)를 사용하여 머리의 기저막(bm)과 큐티클을 엽니다. (에프,지) 오른쪽(F)과 왼쪽(G)을 따라 자릅니다. 절단 위치는 (Q)에 표시되어 있습니다. (H,I) 집게(H)로 복부 부분을 들어 올리고 가위(I)로 제거합니다. (J,K) 겸자를 사용하여 뇌(J), 외측 몸통 기관 및 장(K)을 제거합니다. (L-M) 피펫에서 부드러운 완충액 흐름을 사용하여 지방체를 제거하고 IFM을 노출시킵니다. (N) 흉부를 두 개의 전단지로 자릅니다. (O,P) 전단지를 잘라내어 고정제로 옮깁니다. (Q) 오픈 북 해부의 단계를 요약한 개략도. 각 단계에 해당하는 그림 패널에는 레이블이 지정되어 있습니다(하단). 상단 및 측면 view번데기의 왼쪽과 오른쪽에 있는 컷(빨간색 점선)의 배치를 설명하기 위해 제공됩니다. 날개, 다리 및 코(라벨링)는 번데기의 등쪽과 복부를 구별하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 현미경 슬라이드에 샘플 장착. (A-D) 커버슬립 스페이서는 두꺼운 흉부 반절편 샘플을 장착하는 데 사용됩니다. 글리세롤(A)은 스페이서(#1 커버슬립)를 라벨이 붙은 슬라이드(B)에 부착하는 데 사용되며, 샘플은 스페이서(C) 사이의 공간에 있는 마운팅 매체에 장착됩니다. 늦은 번데기와 성체 흉부에는 두 개의 #1 커버슬립 스페이서(D)가 필요합니다. 중간 번데기 시점에는 단일 #1 커버슬립 스페이서가 필요하며 초기 번데기 해부는 스페이서 없이 장착할 수 있습니다. (E-H) 성인 반흉부 샘플은 집게나 붓(E)을 사용하여 장착 매체로 옮겨집니다. 흉부는 처음에 무작위로 방향화되며(F), IFM이 커버슬립(H)을 향하도록 겸자(G)를 사용하여 뒤집어야 할 수도 있습니다. (I-L) 초기 번데기 열린 책 해부의 전단지는 겸자(I)를 사용하여 장착하기 위해 옮겨집니다. 전단지는 무작위로 방향이 지정되고(J) IFM이 커버슬립(L)을 향하도록 집게(K)를 사용하여 뒤집을 수 있습니다. (MP) 샘플의 방향이 적절하게 지정되면 샘플(M) 위에 커버슬립을 놓고 스페이서(N)에 대고 두드립니다. 샘플 주변에 마운팅 매체(O)를 채우고 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 커버슬립과 스페이서의 모든 열린 가장자리를 매니큐어(P)로 밀봉하여 장착 매체의 증발을 방지합니다. (Q-R) IFM이 커버슬립(R, 10x 배율)을 향하도록 방향을 잡은 적절하게 장착된 성인 흉부 샘플(Q, 20x 배율)의 이미지. (S) 스페이서와 매니큐어 사이에 IFM-up을 향한 샘플이 있는 완성된 슬라이드의 개략도는 모든 열린 가장자리를 밀봉합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6: IFM 해부는 다른 고정제와 호환됩니다. (AH) 근섬유 구조(A-D)의 공초점 z-투영 또는 대조군 w 1118 성인 IFM의 근원섬유 및 근절 구조(E-H)의 단일 평면 이미지. 반흉부 해부는 인산염 완충 식염수(PBS)(A,E) 또는 이완 용액(RS)(B,F), 메탄올(C,G) 또는 9% 글리옥살 용액(D,H)의 4% 파라포름알데히드(PFA)를 포함한 여러 고정 방법과 호환됩니다. DAPI(1:1000), 파란색; 팔로이딘(1:500)은 F-액틴을 염색하고 회색입니다. (나,제이) EH에서 근절 길이(I)와 너비(J)의 정량화. 고정 방법과 완충액은 근절 길이와 너비의 측정에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 메탄올 고정 시 3.040 ± 0.2935 μm의 근절 길이는 PFA(PBS), PFA(RS) 및 9% 글리옥살 고정으로 측정된 길이 3.271 ± 0.2736 μm, 3.190 ± 0.2586 μm, 3.217 ± 0.2023 μm보다 유의하게 짧았습니다(p < 0.001). 근절 폭은 테스트된 모든 고정 방법(PFA(PBS), 1.410 ± 0.1331 μm; PFA(RS), 1.284 ± 0.2514μm; 메탄올, 1.280 ± 0.1538 μm; 및 9% 글리옥살 고정, 1.137 ± 0.2032 μm). 상자 그림은 검은색 점으로 표시된 이상치 데이터 포인트가 있는 Tukey 수염으로 표시됩니다. 유의성은 사후 Tukey 테스트(**, p < 0.01; ***, p < 0.001)를 사용하여 ANOVA에 의해 결정되었습니다. (K-M) RS 고정에서 4% PFA에서 성인 w1118의 고정 시간 경과의 단일 평면 공초점 이미지는 7분(K)과 비교하여 15(L) 또는 30(M)분의 고정 시간이 잘 보존되고 일관된 근절 구조를 초래한다는 것을 보여줍니다. (N,O) 근섬유의 해부 인공물을 보여주는 4% PFA에 고정된 성인 Act88F-Gal4 IFM의 Z-스택 투영. 일반적인 아티팩트에는 무딘 칼날(N) 또는 각진 절단(O)으로 인한 절단, 닳음 또는 부분적인 근섬유가 포함됩니다. (P-R) PBS에서 4% PFA로 고정된 성인 w1118 샘플의 단일 평면 공초점 이미지는 근절매 및 근원섬유의 일반적인 해부 인공물을 보여줍니다. 일반적인 기술적 인공물로는 장착 중 겸자와의 접촉으로 인한 근절의 불규칙한 스트레칭(P), 세로 절단 중 근섬유를 늘려 Z-디스크가 레지스터에서 당겨지는 것(Q), 마찰 또는 무딘 칼날로 인한 근원섬유의 닳거나 무질서하거나 말리는 것(R). DAPI(1:1000), 파란색; 팔로이딘(1:500)은 F-액틴을 염색하고 회색입니다. 스케일 바 = 100 μm(A-D, N-O), 5 μm(E-H, K-M, P-R). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 7: SmnE33의 발달 IFM 표현형을 조사하기 위한 해부 적용. (A-D) 26시간 APF에서 초기 번데기의 근육 구조. 대조군(A, A', C, C') 및 SmnE33(B, B', D, D')에서 근섬유 구조(A, A', B, B') 및 근섬유 및 근절 구조(C, C', D, D')의 단일 평면 공초점 이미지. 대조군과 SmnE33 모두 반흉부당 6개의 IFM 근섬유를 가지며 F-액틴 케이블을 형성합니다. (E-H) 72시간 APF에서 후기 번데기의 근육 구조. 대조군(E, E') 및 SmnE33(F, F')에서 근섬유 구조의 Z-투영 이미지. SmnE33의 IFM은 DAPI 염색을 기반으로 존재하지만 강력한 F-액틴 신호가 부족합니다. 단일 평면 공초점 이미지는 제어 IFM이 고도로 조직화된 근절 구조(G, G')를 가지고 있음을 보여줍니다. 대조적으로, SmnE33 IFM(H, H')은 비정상적인 별과 같은 F-액틴 구조(노란색 화살표)를 가지며 대조군 IFM에서 관찰되는 조직화된 근절 구조가 부족합니다. (I-L) 제어되는 성인 근육 구조(I, I', K, K') 및 SmnE33(J, J', L, L'). Z-투영(I,J) 및 단일 평면 공초점 이미지(K,L)는 SmnE33IFM에서 크게 감소된 F-액틴 함량과 비정상적인 액틴 구조(노란색 화살표)를 보여줍니다. DAPI(1:1000), 파란색; 팔로이딘(1:500)은 F-액틴, 자홍색 또는 회색으로 염색되었습니다. 스케일 바 = 50 μm(A, B), 10 μm(C, D, G, H, K, L), 100 μm(E, F, I, J). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 텍스트에 사용된 고정 및 염색 방법, 특히 그림 6 및 그림 7에 표시된 데이터를 생성하는 데 사용된 방법에 대한 자세한 설명입니다. 1차 항체의 희석액 결정에 대한 추가 정보가 포함되어 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 버퍼 구성 요소 및 레시피 목록도 제공됩니다. 이러한 데이터는 해부 프로토콜에 동기를 부여하고 공초점 현미경 및 발달 IFM 표현형 분석에 대한 유용성을 보여줍니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: 성인 IFM의 반흉부 해부 단계의 흐름도. 반흉부 IFM 절편을 준비하기 위한 그림 1 의 단계에 대한 텍스트 요약. 해부, 고정 및 흉부 이등부 후 현미경 분석을 위해 절편을 염색합니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: 번데기 IFM의 반흉부 박리 단계의 흐름도. 번데기 IFM의 반흉부 절편을 준비하기 위한 그림 3 의 단계에 대한 텍스트 요약. 번데기 케이스에서 제거한 후 번데기를 고정하고 이등분하고 현미경 검사를 위해 염색합니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 3: 초기 번데기 IFM의 오픈 북 해부 단계의 흐름도. 48시간 APF 전에 번데기 IFM의 오픈 북 해부를 수행하기 위해 그림 4 에 표시된 단계의 텍스트 요약. 해부 및 고정 후, IFM이 부착된 상피 전단지를 현미경 검사를 위해 염색합니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 프로토콜은 D. melanogaster 성인(그림 1) 및 후기 번데기(48시간 - 96시간 APF)(그림 3) IFM의 반흉부 해부 절차와 초기 번데기(8시간 - 48시간 APF)(그림 4) 시점. 이 프로토콜은 면역조직화학 및 형광 현미경 응용 분야에 최적입니다. 프로토콜은 해부 절차의 개략도와 단계별 사진으로 설명됩니다. 개요 다이어그램을 통해 초 파리 분야에 처음 접하는 과학자는 물론 학부 연구원 및 초기 단계 연수생도 프로토콜에 접근할 수 있습니다. 프로토콜 사용자가 아티팩트를 선의의 근절 표현형과 구별할 수 있도록 불량한 고정 및 샘플 준비 아티팩트의 대표적인 예가 포함되어 있습니다.

IFM 반흉부 해부에서 가장 어려운 단계는 흉부의 이등분술입니다(그림 1I,J,L 및 그림 3O). 이 단계를 마스터하려면 시간과 연습이 필요합니다. 절단하는 동안 추가적인 안정성을 위해 개별 흉부를 양면 테이프에 놓고36을 절단할 수 있지만 IFM이 건조되지 않도록 주의해야 합니다. 등쪽이 아래를 향하도록 흉부의 복부에서 절단하는 것도 가능하므로 새로운 사용자는 설정에 어떤 접근 방식이 가장 효과적인지 테스트할 수 있습니다. IFM이 손상되지 않도록 날카로운 새 날로 절단해야 하며, 날이 무뎌지면 교체해야 합니다. 마이크로톰(극저온 조절기) 블레이드는 바늘, 겸자 또는 메스 블레이드를 사용하는 다른 프로토콜과 비교하여 이 프로토콜에서 흉부를 깨끗하게 절단하는 데 사용됩니다(24, 32, 36). 면도날은 흉부를 깨끗하게 이등분하는 또 다른 대안입니다. 가볍게 고정된 조직은 안정적으로 보존되지만 "질퍽"하고 절단하기가 더 어려울 수 있으므로 이등분술 전에 고정도 중요합니다. 30-60분의 고정 시간은 항원 가용성과 절단을 용이하게 하는 조직 강성의 균형을 맞추고 경험을 통해 15분으로 단축할 수 있습니다.

반흉부 제제의 한 가지 한계는 항체 침투입니다. 반흉부는 두꺼운 샘플(32)이며, 최고 품질의 공초점 현미경 사진은 IFM의 상단 10-20μm(42, 58)에서 얻어집니다. 세제 농도가 너무 낮거나 투과 시간이 너무 짧으면 염색이 약하고 일관되지 않을 수 있습니다. 항체 침투는 또한 1차 항체에서 더 길은(2-3일) 배양에 의해 개선될 수 있습니다. 2광자 시스템 또는 작업 거리가 더 큰 대물렌즈도 이미징 깊이를 증가시킬 수 있습니다59. 실험자가 IFM 근섬유의 전체 직경을 이미지화해야 하는 경우 시상면에서 마이크로톰24, 58 또는 냉동 절편27 과 같은 대체 접근법을 고려해야 합니다.

기본 프로토콜에서 다루지 않는 중요한 측면은 이미지 데이터 분석입니다. 10x 또는 20x 이미지에서 IFM 근섬유를 분석하기 위해(그림 6A-D, 그림 7A, B, E, F, I, J), 표준 분석에는 근섬유가 부착되어 있는지, 근섬유의 총 형태가 손상되지 않았는지 확인하는 것이 포함됩니다37, 38. 실험에 따라 정량화할 수 있는 매개변수의 예로는 길이, 너비, 수, 부착된 수 또는 찢어진 근섬유의 수37, 60이 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 형광 현미경과의 호환성 및 60배 또는 100배의 더 높은 배율에서 근절 및 근원섬유 형태를 분석할 수 있는 능력입니다(그림 6E-H, 그림 7C,D,G,H, K,L). 근절 형태는 기술적 인공물이 없는 샘플에서 분석해야 합니다(그림 6K-P). 가능한 근원섬유 및 근절 표현형의 여러 범주가 이전에 정의되었습니다60. 가장 일반적으로, 근절 길이와 폭은 이미지 처리 소프트웨어에서 Z-디스크에서 Z-디스크까지의 선을 그리고 측정하거나, 또는 자유롭게 이용 가능한 여러 자동화 도구 중 하나를 번갈아 사용함으로써 측정된다18, 45, 61. 근절 형태의 평가는 Z-디스크 또는 M-라인 또는 두껍거나 얇은 필라멘트 30, 34,58을 표시하는 마커를 포함함으로써 향상될 수 있습니다. 이러한 데이터는 이 해부 프로토콜을 사용하여 준비된 대조군과 테스트 샘플 사이의 근섬유, 근원섬유 및 근절 표현형을 정량적으로 설명하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜 사용자는 고정이 근섬유 및 근절 형태를 보존하는 동안 고정제, 완충액 및 마운팅 매체가 조직 수축 또는 팽창을 유발할 수 있으며 형태학적 매개변수의 측정에 영향을 미칠 수 있음을 알고 있어야 합니다45. 전자 현미경 검사에 필요한 글루타르알데히드 고정 및 탈수는 근절 직경을 감소시키는 것으로 알려져 있으며43, 섬유 스키닝 및 당화는 근절 직경을 증가시키는 것으로 나타났습니다44,45. 이 현상은 문헌에서 근절 매개변수의 차이의 기초가 될 수 있으며 각 실험에 대조군 및 테스트 샘플을 포함하는 것의 중요성을 강조합니다. 대조군 및 테스트 IFM은 근절 정량적 매개변수의 정확한 비교를 위해 동일한 완충액에서 동시에 처리되어야 합니다.

이 세부 프로토콜은 면역조직화학 및 형광 현미경을 위한 성인 및 번데기 IFM 해부를 초보 및 고급 초반 초반 및 고급 초반 분석자가 더 쉽게 접근할 수 있도록 하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 다른 곤충뿐만 아니라 극저온 전자 현미경(cryo-EM), 단일 분자 형광 제자리 혼성화(smFISH) 또는 공간 전사체학과 같은 다른 이미징 기술에 사용하도록 조정될 수 있습니다. 강력한 초파리 유전학 도구와 형광 현미경의 조합은 근형성 및 근육 기능의 보존된 원리를 조사할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. IFM은 분자 및 생화학적 접근법26, 27에도 적합하기 때문에 분자 표현형을 근육 형태, 세포 생물학 및 기능과 연결하는 향후 연구는 근 발생 및 근육 장애의 병인에 대한 더 깊은 이해를 제공할 것입니다.

공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

저자는 SmnE33 대립유전자를 제공하고 Smn에 대한 유용한 토론을 해준 Gregory Matera에게 감사를 표합니다. 저자는 유용한 토론과 지원을 해준 Frank Schnorrer, Cornelia Schoenbauer, Manuela Weitkunat 및 Aynur Kaya-Copur에게 감사를 표합니다. 저자는 파리를 제공한 블루밍턴 스톡 센터를 인정합니다. 이 작업은 미주리 대학교 캔자스시티(UMKC) 과학 공학 대학, 생물 및 생물 의학 시스템 부서(MLS), UMKC 우수 프로그램 기금 지원(MLS) 및 UMKC 학부 연구 및 창의적 장학금 사무국(SF, MLS)의 창업 자금 지원으로 지원되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
60mm 조직 배양 접시피셔 사이언티브FB01292160mm, 스티렌
아세트산, 빙하 (인증 ACS)피셔 사이언티브A38S-212
아데노신 삼인산 (ATP)밀리포어 시그마A1852
알루미늄 호일, 중장비아마존12인치. x 1000피트.
검은색 실리콘 해부 접시: 활성탄 분말밀리포어 시그마C9157대부분의 약국에서도 구입할 수 있습니다
검은색 실리콘 해부 접시: 실가르드 184밀리포어 시그마761036실리콘 해부 요리를 만들려면 실가르드 부품을 지퍼백에 넣어 잘 섞으세요. 활성탄 가루(~200 mg)를 실가드(~50g)에 넣고, 잘 섞은 뒤 봉지 모서리를 잘라서 60mm 배양 접시를 채우고, 피펫 팁으로 기포를 제거한 뒤 하룻밤 경화시킵니다.
골판지 슬라이드 트레이, 리서치 프로덕츠 인터내셔널 코퍼레이션피셔 사이언티브50-136-7558
정초점 현미경, 니콘 AXR 역방향 공초점니콘www.microscope.healthcare.nikon.com/
공초점 현미경, 자이스 LSM 780 역방향 공초점자이스www.zeiss.com
다윈 곤충 사육실(인큐베이터)피셔 사이언티픽/다윈 챔버스IN034빛, 온도, 습도를 조절하는 인큐베이터
해부 접시 (검은 유리)미크로스콥 테크닉 디트헬름398011림프베켄(염색 그릇/림프탱크), 검은 유리, 4x4 cm, 투명 유리 덮개
듀몽 #3 겸자파인 사이언스 툴즈11231-30듀목셀 직선 팁 12cm 겸자, 0.17 x 0.1 mm 팁 & nbsp;
듀몽 #5 겸자파인 사이언스 툴즈11252-20이녹스 직선 팁 11cm 겸자, 생물학 등급, 0.05 x 0.02 mm 팁 & nbsp;
EGTA (에그타직산)밀리포어 시그마324626
에탄올, 절대 (200 프루프)피셔 사이언티브BP28184분자생물학 등급
피셔브랜드 프리미엄 커버 글라스 (18 x 18 mm), 커버슬립피셔 사이언티브12548A유리, 정사각형, #1 두께 (0.13 - 0.16 mm)
피셔브랜드 프리미엄 커버 글라스 (22 x 22 mm), 커버슬립피셔 사이언티브12548B유리, 정사각형, #1 두께 (0.13 - 0.16 mm)
평평한 바닥 세포 배양 플레이트 (24웰)피셔 사이언티브7200740
형광 해부 현미경 카메라, 인피니티8 카메라텔레다인 (비주얼 다이나믹스)600만 화소, 저조도, 단색
비행: Smn[E33]플라잉 스톡; 그레고리 마테라의 기증
파리: w[1118]블루밍턴 가축 센터RRID:BDSC_3605플라이 스톡
글리세롤피셔 사이언티브BP229-1분자생물학 등급
글리옥살 용액 (H2O에 40 중량 %)밀리포어 시그마128465그리고 nbsp; 이건 40% 순정 용액입니다
이미지 처리 소프트웨어, Affinity Designer 2친화력https://affinity.serif.com/en-us/
이미지 처리 소프트웨어, Image J (피지)이미지J2https://imagej.net/software/fiji/
곤충 핀파인 사이언스 툴즈26002-10스테인리스 스틸, 직경 0.1 mm (미분 핀)
염화마그네슘 (MgCl2)피셔 사이언티브AA12315A1
메탄올 (HPLC)피셔 케미컬 (피셔 사이언티픽)A452-4-20도에서 진정하세요? 사용 전
현미경 슬라이드, 서리 낀 상태입니다피셔 사이언티브12-550-400비충전 기록 영역, 75 mm x 25 mm x 1 mm
현미경 슬라이드, 일반 유리피셔 사이언티브12-544-4미리 청소된 상태, 75mm x 25mm
MX35 울트라 미세토름 블레이드에프레디아 (피셔 사이언티픽)3053835저프로파일, 34도; 절단 각도; C35 페더 80mm 블레이드는 잘 작동합니다
네일 폴리시, 투명 (샐리 한센 익스트림 웨어 네일 폴리시)아마존0.4 플로리 온스.
일반 염소 혈청밀리포어 시그마S26리터
누테이터 (미니 튜테이팅 록커, 벤치마크)미드웨스트 사이언티픽H3D102024rpm, 고정; 8 x 6인치. 움푹 들어간 매트가 있는 플랫폼
페인트브러시 (라운드 0번)아마존라운드 No. 0 또는 비슷한 브러시는 어떤 미술 용품에서든 구입할 수 있습니다
파라포름알데히드 (PFA)밀리포어 시그마158127-500G
인산염 완충식염수(PBS): KCl밀리포어 시그마529552-250GM콜드 스프링 하브 프로톡에 따라 PBS를 준비하세요; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
인산염 완충 식염수(PBS): KH2PO4밀리포어 시그마P0662-500G콜드 스프링 하브 프로톡에 따라 PBS를 준비하세요; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
인산염 완충 식염수(PBS): Na2HPO4밀리포어 시그마S9763-500G콜드 스프링 하브 프로톡에 따라 PBS를 준비하세요; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
인산염 완충식염수(PBS): NaCl피셔 케미컬 (피셔 사이언티픽)S271-1콜드 스프링 하브 프로톡에 따라 PBS를 준비하세요; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
PR1MA 피펫 팁 (10 & 마이크로; L)미드웨스트 사이언티픽PR10XLRK-NS유니버설 10 & 마이크로; L 피펫 팁
PR1MA 피펫 팁 (1000 & 마이크로; L)미드웨스트 사이언티픽PR-1000RK-FL유니버설 1000 & 마이크로; L 피펫 팁
PR1MA 피펫 팁 (200 & 마이크로; L)미드웨스트 사이언티픽PR-200RK-NS유니버설 200 & 마이크로; L 피펫 팁
로다민-팔로이딘인비트로젠, 분자 탐침R415
스카치 양면 테이프스카치/3M (스테이플스)649280양면에 0.5" x 7야드 크기의 접착제 코팅이 적용되어 있으며, 대부분의 사무용품 취급업체에서 구할 수 있습니다
인산염 이수산화나트륨 (NaH2PO4)피셔 사이언티브AAA1131636
소프트웨어: 그래프패드 프리즈그래프패드 프리즘www.graphpad.com
소프트웨어: 인피니티 애널리 7텔레다인 (비주얼 다이나믹스)https://www.teledynevisionsolutions.com/products/infinity-analyze/
소프트웨어: 마이크로스코프트 엑셀마이크로소프트https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
티슈/킴텍 사이언스 킴와이프스 섬세한 작업 와이퍼, 1겹피셔 사이언티브06-666표준 티슈
트랜스퍼 피펫피셔 사이언티브13-711-9 AMDD플라스틱 피펫
트리션 X-100밀리포어 시그마T9284-100ML
반나스 스프링 가위파인 사이언스 툴즈15000-00절단날 3mm, 끝 직경 0.05mm, 길이 8cm
벡타쉴드와 DAPI벡터 연구소H-2000
DAPI 없는 벡타쉴드벡터 연구소H-1900
왓먼 논문밀리포어 시그마WHA1004070필터 페이퍼 서클, 4등급, 70mm
Z10 형광 입체 해부 현미경비주얼 다이너믹스 (미드웨스트 사이언티픽)http://www.visualdynamix.net/
Z850 인체공학 스테레오 줌 해부 현미경비주얼 다이너믹스 (미드웨스트 사이언티픽)http://www.visualdynamix.net/

참고문헌

  1. Schiaffino, S., Reggiani, C., Murgia, M. Fiber type diversity in skeletal muscle explored by mass spectrometry-based single fiber proteomics. Histol Histopathol. 35 (3), 239-246 (2020).
  2. Plantié, E., Migocka-Patrzałek, M., Daczewska, M., Jagla, K. Model organisms in the fight against muscular dystrophy: lessons from Drosophila and zebrafish. Molecules. 20 (4), 6237-6253 (2015).
  3. Reedy, M. C., Beall, C. Ultrastructure of developing flight muscle in Drosophila. I: assembly of myofibrils. Dev Biol. 160 (2), 443-465 (1993).
  4. Henderson, C. A., Gomez, C. G., Novak, S. M., Mi-Mi, L., Gregorio, C. C. Overview of the muscle cytoskeleton. Compr Physiol. 7 (3), 891-944 (2017).
  5. Luis, N. M., Schnorrer, F. Mechanobiology of muscle and myofibril morphogenesis. Cells Dev. 168, 203760(2021).
  6. Romani, P., Valcarcel-Jimenez, L., Frezza, C., Dupont, S. Crosstalk between mechanotransduction and metabolism. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (1), 22-38 (2021).
  7. Nikonova, E., Kao, S. -Y., Spletter, M. L. Contributions of alternative splicing to muscle type development and function. Semin Cell Dev Biol. , (2020).
  8. Jawkar, S., Nongthomba, U. Indirect flight muscles in Drosophila melanogaster as a tractable model to study muscle development and disease. Int J Dev Biol. 64 (1-3), 167-173 (2020).
  9. Sparrow, J., Hughes, S. M., Segalat, L. Other model organisms for sarcomeric muscle diseases. Adv Exp Med Biol. 642, 192-206 (2008).
  10. Khan, A. O., Simms, V. A., Pike, J. A., Thomas, S. G., Morgan, N. V. CRISPR-Cas9 mediated labelling allows for single molecule imaging and resolution. Sci Rep. 7 (1), 8450(2017).
  11. Atoki, A. V., et al. Exploring the versatility of Drosophila melanogaster as a model organism in biomedical research: a comprehensive review. Fly (Austin). 19 (1), 2420453(2025).
  12. Ling, Y. -P., Li, J. -J., Liu, J. -W., Zeng, B., Chen, G. -L., Wang, N. Technical innovations of signal amplification in fluorescence in situ hybridization. Gene. 964, 149647(2025).
  13. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  14. Fernandes, J., Bate, M., VijayRaghavan, K. Development of the indirect flight muscles of Drosophila. Development. 113 (1), 67-77 (1991).
  15. Swank, D. M. Mechanical analysis of Drosophila indirect flight and jump muscles. Methods. 56 (1), 69-77 (2012).
  16. Dobi, K. C., Schulman, V. K., Baylies, M. K. Specification of the somatic musculature in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (4), 357-375 (2015).
  17. Gunage, R. D., Dhanyasi, N., Reichert, H., VijayRaghavan, K. Drosophila adult muscle development and regeneration. Semin Cell Dev Biol. 72, 56-66 (2017).
  18. Spletter, M. L., et al. A transcriptomics resource reveals a transcriptional transition during ordered sarcomere morphogenesis in flight muscle. eLife. 7, e34058(2018).
  19. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 66, 57-80 (1981).
  20. Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
  21. Matera, A. G. Chaperone dysfunction in motor neuron disease: new insights from studies of the SMN complex. Genetics. 229 (3), iyae223(2025).
  22. Jagla, K., Kalman, B., Boudou, T., Hénon, S., Batonnet-Pichon, S. Beyond mice: emerging and transdisciplinary models for the study of early-onset myopathies. Semin Cell Dev Biol. 64, 171-180 (2017).
  23. Reedy, M. K., Reedy, M. C. Rigor crossbridge structure in tilted single filament layers and flared-X formations from insect flight muscle. J Mol Biol. 185 (1), 145-176 (1985).
  24. Fyrberg, E. A., Bernstein, S. I., VijayRaghavan, K. Chapter 14: basic methods for Drosophila muscle biology. Methods Cell Biol. 44, 237-258 (1994).
  25. Volk, T., Fessler, L. I., Fessler, J. H. A role for integrin in the formation of sarcomeric cytoarchitecture. Cell. 63 (3), 525-536 (1990).
  26. Kao, S. -Y., Nikonova, E., Ravichandran, K., Spletter, M. L. Dissection of Drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches. J Vis Exp. (152), e60309(2019).
  27. Bryantsev, A. L., Castillo, L., Oas, S. T., Chechenova, M. B., Dohn, T. E., Lovato, T. L. Myogenesis in Drosophila melanogaster: dissection of distinct muscle types for molecular analysis. Methods Mol Biol. 1889, 267-281 (2019).
  28. Wang, W., Yoder, J. H. Drosophila pupal abdomen immunohistochemistry. J Vis Exp. (56), e3139(2011).
  29. Segal, D. Live imaging of myogenesis in indirect flight muscles in Drosophila. Bio Protoc. 7 (13), e2377(2017).
  30. Lemke, S. B., Schnorrer, F. In vivo imaging of muscle-tendon morphogenesis in Drosophila pupae. J Vis Exp. 132, e57312(2018).
  31. Kucherenko, M. M., Marrone, A. K., Rishko, V. M., Yatsenko, A. S., Klepzig, A., Shcherbata, H. R. Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles. J Vis Exp. (46), e2438(2010).
  32. Hunt, L. C., Demontis, F. Whole-mount immunostaining of Drosophila skeletal muscle. Nat Protoc. 8 (12), 2496-2501 (2013).
  33. Szikora, S., Novák, T., Gajdos, T., Erdélyi, M., Mihály, J. Superresolution microscopy of Drosophila indirect flight muscle sarcomeres. Bio Protoc. 10 (12), e3654(2020).
  34. Szikora, S., et al. Nanoscopy reveals the layered organization of the sarcomeric H-zone and I-band complexes. J Cell Biol. 219 (1), e201907026(2020).
  35. Xiao, Y. S., Schöck, F., González-Morales, N. Rapid IFM dissection for visualizing fluorescently tagged sarcomeric proteins. Bio Protoc. 7 (22), e2606(2017).
  36. Chakraborty, K., VijayRaghavan, K., Gunage, R. A method to injure, dissect and image indirect flight muscle of Drosophila. Bio Protoc. 8 (10), e2860(2018).
  37. Nikonova, E., et al. Bruno 1/CELF regulates splicing and cytoskeleton dynamics to ensure correct sarcomere assembly in Drosophila flight muscles. PLoS Biol. 22 (4), e3002575(2024).
  38. Nikonova, E., Mukherjee, A., Kamble, K., Barz, C., Nongthomba, U., Spletter, M. L. Rbfox1 is required for myofibril development and maintaining fiber type-specific isoform expression in Drosophila muscles. Life Sci Alliance. 5 (4), e202101342(2022).
  39. Rajendra, T. K., Gonsalvez, G. B., Walker, M. P., Shpargel, K. B., Salz, H. K., Matera, A. G. A Drosophila melanogaster model of spinal muscular atrophy reveals a function for SMN in striated muscle. J Cell Biol. 176 (6), 831-841 (2007).
  40. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
  41. Chyb, S., Gompel, N. Atlas of Drosophila morphology. , Academic Press. San Diego. (2013).
  42. Weitkunat, M., Kaya-Çopur, A., Grill, S. W., Schnorrer, F. Tension and force-resistant attachment are essential for myofibrillogenesis in Drosophila flight muscle. Curr Biol. 24 (7), 705-716 (2014).
  43. Chakravorty, S., et al. Flightin maintains myofilament lattice organization required for optimal flight power and courtship song quality in Drosophila. Proc Biol Sci. 284 (1854), 20170431(2017).
  44. Tanner, B. C. W., Farman, G. P., Irving, T. C., Maughan, D. W., Palmer, B. M., Miller, M. S. Thick-to-thin filament surface distance modulates cross-bridge kinetics in Drosophila flight muscle. Biophys J. 103 (6), 1275-1284 (2012).
  45. Görög, P., et al. A myofilament lattice model of Drosophila flight muscle sarcomeres based on multiscale morphometric analysis during development. bioRxiv. , (2025).
  46. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nat Protoc. 15 (5), 1585-1611 (2020).
  47. Brown, J. R., Phongthachit, C., Sulkowski, M. J. Immunofluorescence and image analysis pipeline for Drosophila motor neurons. Biol Methods Protoc. 4 (1), bpz010(2019).
  48. Elliott, A. D. Confocal microscopy: principles and modern practices. Curr Protoc Cytom. 92 (1), e68(2020).
  49. Kaya-Çopur, A., et al. The Hippo pathway controls myofibril assembly and muscle fiber growth by regulating sarcomeric gene expression. eLife. 10, e63726(2021).
  50. Schönbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
  51. Zhang, X., et al. Mechanoresponsive regulation of myogenesis by the force-sensing transcriptional regulator Tono. Curr Biol. 34 (18), 4143-4159.e6 (2024).
  52. Kouchmeshky, A., McCaffery, P. Chapter six: use of fixatives for immunohistochemistry and their application for detection of retinoic acid synthesizing enzymes in the central nervous system. Methods Enzymol. 637, 119-150 (2020).
  53. Konno, K., Yamasaki, M., Miyazaki, T., Watanabe, M. Glyoxal fixation: an approach to solve immunohistochemical problem in neuroscience research. Sci Adv. 9 (28), eadf7084(2023).
  54. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. J Oral Maxillofac Pathol. 16 (3), 400-405 (2012).
  55. Schönbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
  56. Monani, U. R. Spinal muscular atrophy: a deficiency in a ubiquitous protein; a motor neuron-specific disease. Neuron. 48 (6), 885-896 (2005).
  57. Imlach, W. L., Beck, E. S., Choi, B. J., Lotti, F., Pellizzoni, L., McCabe, B. D. SMN is required for sensory-motor circuit function in Drosophila. Cell. 151 (2), 427-439 (2012).
  58. Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
  59. Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).
  60. Schnorrer, F., et al. Systematic genetic analysis of muscle morphogenesis and function in Drosophila. Nature. 464 (7286), 287-291 (2010).
  61. Baheux Blin, M., Loreau, V., Schnorrer, F., Mangeol, P. PatternJ: an ImageJ toolset for the automated and quantitative analysis of regular spatial patterns found in sarcomeres, axons, somites, and more. Biol Open. 13 (6), bio060548(2024).

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