질병 진단 및 치료에 개별 sEV의 표면 강화 라만 산란 기반 생체감지 적용 탐구

Summary

여기서는 라벨 없는 표면 증강 라만 분광법(SERS)을 사용하여 개별 작은 세포외 소포(sEV)를 분석하는 프로토콜을 제시하여, 최소 침습 질환 진단과 sEV의 치료 전달 매개체 평가를 가능하게 합니다.

Abstract

이 프로토콜은 표면 강화 라만 분광법(SERS)과 머신러닝(ML)을 통합하여 진단 및 치료적 응용 분야에서 개별 작은 세포외 소포(sEV)를 검출하고 분자적으로 프로파일링하는 포괄적이고 라벨이 없는 플랫폼을 제시합니다. 이 방법은 크기 배제 크로마토그래피 또는 초원심분리를 이용한 sEV 분리로 시작합니다. 분리된 소포는 단일 소포 감도를 가진 설계된 플라즈모닉 금 나노피라미드 2D 배열 기판에서 분석됩니다. 내재적인 라만 생화학적 지문을 활용하여 외부 라벨 없이도 고특이성 검출을 가능하게 합니다. 스펙트럼 획득 후 데이터는 전처리를 거치고 학습된 머신러닝 알고리즘(예: LDA, SVC)을 사용하여 질병 상태를 분류하며, 조직, 혈장, 타액에서 sEV를 사용해 위암과 건강한 대조군을 90.1%, 70.9%, 60.7%의 분류 정확도로 성공적으로 구분합니다. 또한, 단일 sEV에서 독소루비신 부하를 정량화함으로써 치료적 응용이 입증되었으며, 이는 그래핀 코팅 기판을 내부 표준으로 사용하여 더욱 강화된 측정 결과입니다. 이 접근법은 조기 질병 발견과 단일 소포 수준에서의 약물 적재 효율 이해에 필수적인 집단 이질성을 포착하는 고처리량 분석을 가능하게 합니다.

Introduction

작은 세포외 소포(sEV)는 일반적으로 직경 30에서 200 nm 사이이며, 세포에서 자연적으로 생물체액으로 분비되며, 기원세포를 나타내는 단백질, 지질, 핵산을 운반합니다 ^1,2,3. 타액, 소변 및 기타 체액에서 비침습적 바이오마커로 4는 조기 질환 진단, 예후 및 치료 모니터링에 특히 종양학 분야에서 가능성을 지니고 있습니다 ^5,6,7. 그러나 이들의 임상 번역은 높은 이질성과 복잡한 생물학적 행렬에서의 낮은 존재 비율로 인해 제한됩니다⁸. 이러한 도전을 극복하기 위해 이 프로토콜은 표면 강화 라만 분광법(SERS)을 활용하는데, 이는 플라즈모닉 기판 ^9,10,11

Protocol

인간 표본 채취는 헬싱키 선언에 따라 수행되었으며 UCLA 기관심사위원회(IRB)의 승인을 받았습니다. 모든 기증자는 연구 참여 전에 서면 동의서를 제공했습니다.

참고: 총 4개의 세포주(AGS(CRL-1739), A549(CCL-185), NCI-N87(CRL-5822), Hs 738.St/Int(CRL-7869)가 모두 상업 공급업체로부터 구입하여 이 연구에서 사용되었습니다. 이 세포주들은 판매자의 지침과 시약에 따라 엄격히 배양 및 배설되었습니다. 가공된 배지는 -20°C에서 수집되어 저장된 후 처리되었습니다. 한국 삼성의료센터에서는 기증자들이 자발적으로 조직, 혈장, 타액 샘플을 기증했습니다. 위암 조직은 외과적 절제 과정에서 채취되었고, 비암 대조군의 생검은 내시경을 통해 수집되었습니다. 혈장은 표준 임상 프로토콜에 따라 EDTA 튜브에 채취되었습니다. 각 피험자로부터 약 5mL의 자극되지 않은 전체 침을 채취한 후, 4 °C에서 2,600 × g에서 15분간 원심분리했습니다. 세포외 RNA를 보존하기 위해 상출액에 20 U/mL의 SUPERase-In RNase 억제제를 보충하였습니다. 모든 표본은 추가 가공 전까지 -80°C에서 보관되었습니다. sEV는....

Results

단일 소포 SERS 프로토콜의 성공적인 구현은 개별 sEV에서 뚜렷한 라만 스펙트럼을 얻어 후속 진단 분류와 치료 약물 적재 모니터링을 가능하게 합니다. 그림 1 은 위암 진단 연구와 약물 가중 sEV 모니터링 애플리케이션의 워크플로우를 각각 여기에서 보고한 프로토콜을 보여줍니다.

그림 1: 연구의 흐름도. (A) 위암의 단일 소포 SERS 기반 진단 워크플로우. 임상 소포는 분리되어 플라즈모니 기판에 침착되고, 개별적으로 라만 .......

Discussion

이 프로토콜의 핵심 요소는 기판 준비와 sEV 정제입니다. 라벨이 없는 SERS의 성능은 강한 증강 '핫스팟'을 가진 균일하고 고포각형 플라즈모닉 기판을 생성하는 데 크게 의존합니다. 마찬가지로, 크기 배제 크로마토그래피 를 통한 고순도 sEV 분리는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 SERS 스펙트럼을 생성하는 데 필수적입니다. 단백질 응집체나 지단백과 같은 불순물은 소포 신호를 약화시킬 뿐만 아니라 스펙트럼 잡음을 도입하여 하위 머신러닝 분류를 혼란스럽게 할 수 있습니다.

우리 플랫폼의 큰 장점은 검증된 단일 소포 해상도로, 이는 sEV 이질성 문제를 극복하는 데 중요한 요소입니다. 레이저 스팟은 단일 소포보다 크지만, 금 나노피라미드 기하학에서 발생하는 초선형 신호 증폭 때문에 플라즈모닉 핫스팟에 가장 가까운 sEV가 신호를 지배합니다. 이와 함께 기질의 낮은 소포 밀도가 결합되어 각 스펙트럼은 개별 s.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1배 PBS	써모피셔 사이언티브	J61196. AP
300메시 구리 그리드	전자현미경 과학	EMS200-Cu
4% 파라포름알데히드 용액	시그마 올드리치	1004960700
4&프라임; Si wafers	MSE 서플라이	WA0810	(100) 지향적인...
A549 세포주	ATCC	<강>CCL-185
AGS 세포주	ATCC	CRL-1739
원심분리기 로터 F-35-6-30, 5430	에펜도르프	<강>22654306
CHA 마크 40	CHA 마크 40	https://chaindustries.com/mark-40-system/	전자빔 증발
크로컬 에챈트 해법	시그마 올드리치	651826-500ML
독소루비신  D-4000	LC 연구소	D-4000_3g
ExoView R100 시스템 및 ExoView 휴먼 테트라스패닌 키트	나노뷰 바이오사이언스	https://www.nowmedicalstudios. com/portfolio/nanoview- biosciences-3d-product-illustrations
FeCl3 솔루션	시그마 올드리치	451649
HF 솔루션	시그마 올드리치	695068-500ML
Hs 738.St/Int 세포주	ATCC	CRL-7869
공초점 라만 현미경을 통해	레니쇼	https://www.renishaw.com/en/<브레> invia-confocal-raman-microscope --6260?srsltid=AfmBOoqbZlyW qv2KDdcXV0UZnp8tdLNgYZ0 GbZvGOWI6z1OKi48rg5-b
KOH 솔루션	시그마 올드리치	417661
MaxQ 4000 벤치탑 인큐베이팅/냉장 셰이커	써모 사이언티픽	SHKA4000 (4320)
MCO-19AIC 인큐베이터	산요	8380-30-0035
밀렉스-GP 필터	밀리포어 시그마	SLGPM33RS	그리고 nbsp; 0.22 & 마이크로; m
나노SEM 230 현미경	FEI	SEM-FEI-014
나노사이트 NS300	말번 파날리티컬	https://www.malvernpanalytical .com/en/support/product-support /nanosight-range/nanosight-ns300
NCI-N87 세포주	ATCC	CRL-5822
옵티마 TLX 초심분리기	벡먼 쿨터	8043-30-1197
옥스퍼드 플라즈마랩 80 플러스	옥스퍼드 플라즈마랩	https://plasma.oxinst.com/<브르/> 제품/RIE/플라즈마프로-800-RIE
폴리스티렌 구체	알파 에이사르	<강>AA42711AB	500 nm
qEVoriginal/35nm	아이존	ICO-35
단층 그래핀	MSE 서플라이	ME0408
T-75 플라스크	VWR	156800
TF20 고해상도 전자기(EM)	FEI	https://eicn.cnsi.ucla.edu/project/fei-tf20-tem/
우라닐 아세테이트 용액	전자현미경 과학	22400-1