TCGA 데이터 및 단일 셀 데이터를 기반으로 한 분석 TRPM4 를 예로 들고

요약

여기서는 전사체 분석과 단세포 분석을 바탕으로 101개의 머신러닝 알고리즘을 활용하여 방광암에서 단일 유전자의 역할을 철저히 분석하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

본 논문에서는 공개된 전사체 데이터셋과 단세포 데이터셋을 기반으로 한 분석 방법을 소개하여, 종양 면역 미세환경 형성, 종양 분자 아형 형성, 종양 환자의 예후 예측 등 단일 유전자의 역할을 포괄적으로 기술할 수 있습니다. 동시에, 단일 유전자 데이터 도입은 단일 전사체 분석으로 인한 무작위성과 이질성을 피할 뿐만 아니라, 유전자가 발현되는 특정 세포 클러스터를 더 깊이 탐구하고, 경로 내에서 유전자가 어떤 역할을 하는지에 대한 추가 연구를 가능하게 합니다. 많은 연구자들이 단일 세포 분석에 능숙하지 않을 수 있음을 고려하여, 이 방법 논문에는 TISCH2(http://tisch.compbio.cn/)라는 온라인 웹사이트가 소개되어 모두가 단일 세포 분석을 완료할 수 있도록 돕습니다. 또한, 101가지 머신러닝 기법의 적용은 가장 정확한 예후 모델 구축에 필수적인 역할을 해왔습니다. 결론적으로, 생물정보학 분석, 머신러닝, 단세포 분석을 결합한 이 통합 단일 유전자 분석 방법은 단일 유전자의 종양 진행 기능 연구뿐만 아니라 경로 내 개별 유전자 기능 연구에도 필수적이고 중요한 역할을 할 수 있다고 믿어집니다.

서론

우리가 모두 알다시피, 방광암(BLCA)은 세계에서 가장 공격적이고 전이성 악성 종양 중 하나이며, 현재 방광암 바이오마커에는 부정확성 등 문제가 여전히 존재^합니다. BLCA 환자의 예후를 확인하고 결과를 예측하기 위해 방광암 바이오마커 탐색과 예후 모델 구축이 매우 중요합니다. 사람들이 바이오마커에 대한 연구 방법을 개발했지만, 대부분의 방법은 현재 전사체학에 한정되어 있어 샘플 내 이질성을 불가피하게 만듭니다². 더불어, 전사체학 데이터만으로는 서로 다른 세포 하위 집단의 역할이나 단일 세포 수준에서 다양한 경로에서 유전자의 기능을 조사하는 데 실패하는 경우가 많아 과거 연구가 덜 정밀^{하고 효과적}이지 않게 만듭니다. 단세포 분석이 초보자에게 어려울 수 있음을 고려하여^{, 단세포} 분석을 위한 온라인 플랫폼이 도입되어 빠르게 기술을 습득할 수 있도록 돕습니다. 마지막으로, 전사체 분석과 단세포 분석을 통해 단일 유전자가 적합한 바이오마커임이 밝혀졌더라도, 그 바이오마커가 모든 코호트에 적용 가능하다는 보장은 없으므로, 결론을 보다 보편^{적으로 적용할} 수 있도록 바이오마커와 연관된 예후 모델을 구축하는 것이 필요합니다. 5. 101 머신러닝 알고리즘은 10가지 서로 다른 머신러닝 알고리즘을 조합하여 최적의 예후 모델을 식별하는 것을 의미합니다. 복잡한 데이터를 더 잘 처리하고 안정성을 보인 랜덤 포레스트, XGBoost, SVM과 같은 알고리즘의 포함으로 이 결합 알고리즘은 놀라운 안정성을 보여주었습니다. 이 예후 모델을 바이오마커와 더 정확하고 관련성 있게 만들기 위해, 먼저 모든 유전자와 바이오마커 간의 상관 분석을 수행한 후, 요구사항에 따라 약 20-30개의 유전자를 선택한 후 101 머신러닝 알고리즘을 사용해 예후 모델을 구축하고, 결과를 최종 확정하기 위한 일련의 분석을 거칩니다.

지난^6년간 단순 전사체 분석으로 예측된 바이오마커와 비교하면, 단세포 및 전사체 분석의 바이오마커는 조직이나 샘플을 기본 세포 구성 요소로 편향되지 않고 분해할 수 있게 합니다. 이는 T 세포, B 세포, 대식세포 등 다양한 세포 유형의 명확한 분화와 새로운 하위 집단(예: 고갈된 T 세포 및 조절 T 세포)의 발견, 그리고 세포 분화 궤적과 같은 연속적인 동적 과정을 포착할 수 있게 ^합니다4. 과일과 우유를 따로 배열하는 것과 비슷하게, 각 성분과 그 양을 명확하게 시각화할 수 있게 해줍니다. 단일 코호트 Cox 모델⁷과 비교할 때, 101 머신러닝을 사용해 구축된 예후 모델은 데이터에서 변수들 간의 복잡하고 비선형적인 상호작용을 자동으로 학습할 수 있어 더 정확하고 과학적으로 타당합니다. 예를 들어, 특정 유전적 돌연변이의 영향은 특정 연령과 종양 크기의 환자에게만 유의미할 수 있습니다. 랜덤 포레스트나 신경망과 같은 머신러닝 모델은 수동 명세⁸ 없이도 이러한 고차 상호작용을 자동으로 포착할 수 있습니다. 분석에 사용되는 데이터셋이 대부분의 유전자를 포함해야 하는 신호 핵심 적용 제약 조건은 유전자 수가 너무 적지 않고, 예후 모델 구축에 사용되는 유전자 수가 너무 높지 않아 일반적으로 20-30 정도로 유지되어야 하며, 이것이 최적이다. 단일 세포 세트의 품질 관리 기준은 1000 이상이어야 하며, 세포당 UMI 수는 1000 이상이어야 하며, 세포당 유전자 수는 500 9보다 커^{야 합니다.}

여기서는 공개 전사체 데이터셋과 단일 세포 데이터셋에서 새로운 바이오마커를 식별하는 단계별 접근법을 제시하며, BLCA에서 TRPM4 의 역할을 예로 들고 있습니다. 암 게놈 아틀라스-방광암(TCGA-BLCA) 데이터셋, 단세포 데이터셋 GSE145281, BLCA 데이터셋 GSE32894 및 GSE31684 등 다양한 연구 방법과 다양한 데이터셋이 사용되어 종양학에서 바이오마커의 정밀도와 적용성을 높이고 BLCA에서 TRPM4 연구를 진전시키고 있습니다. TCGA-BLCA 데이터셋은 캘리포니아 대학교 산타크루즈 제나(UCSC Xena) 웹사이트에서 수집되었습니다. GSE32894와 GSE31684은 유전자 발현 옴니버스(GEO)에서 다운로드되었으며, 단일 세포 데이터는 GSE145281 Tumor Immune Single-Cell Hub 2(TISCH2)에서 수집되었습니다. 또한, 관련 논문의 보조 스프레드시트 파일에서 BLCA 분자 아형과 처리 반응에 관한 데이터를 추출하였습니다. 이후 생물정보학 분석, 단세포 분석, 머신러닝을 수행하여 통합된 단일 유전자 연구 방법론을 확립합니다.

프로토콜

참고: 이 글에서 사용된 모든 코드는 https://github.com/YaoGeng-nmu/Analysis-of-TRPM4-based-on-TCGA-data-and-single-cell-data-in-BLCA/blob/main/code 웹사이트에서 확인할 수 있습니다.

1. 전사체학 데이터 준비

1. TCGA-BLCA 데이터셋 준비
   1. UCSC Xena (https://xenabrowser.net/datapages/)¹⁰ 웹사이트에서 모든 TCGA 데이터셋을 다운로드하세요. 다운로드된 데이터셋은 사전 처리되어 유전자 주석¹¹과 같은 추가 작업이 필요 없습니다.
   2. TCGA 데이터셋을 선택한 후 TCGA-BLCA 데이터셋t를 클릭하세요. 그 후 TCGA-BLCA 데이터셋 페이지로 이동하여 Gene Expression RNA-seq를 클릭하고, TCGA-BLCA 데이터셋에서 임상 데이터와 유전자 발현 프로필을 다운로드하세요. 이 데이터셋에는 400명의 BLCA 환자의 mRNA 발현 데이터가 포함되어야 합니다.
   3. 종양 샘플과 인접한 정상 조직 샘플을 구분하기 위해, 01과 11이 끝인 샘플은 종양 샘플을, 11이 있는 샘플은 암 인접 조직(정상 샘플)을 나타내기 위해 분리합니다.
2. GSE32894 및 GSE31684 준비
   1. GEO 웹사이트(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)를 클릭하여 BLCA 데이터셋 GSE32894과 GSE31684^12,13을 다운로드하세요.
   2. 오른쪽 상단의 해당 항목 들을 클릭한 후, 데이터셋 GSE32894와 GSE31684 페이지로 이동하세요.
   3. 다음으로, 해당 mRNA 데이터, 임상 데이터, 생존 데이터를 다운로드하여 GSE32894. GSE32894 데이터셋의 http 버튼을 클릭하세요. 또한, 플랫폼 버튼을 통해 GPL6947 플랫폼 데이터를 다운로드하세요. GSE32894 mRNA 데이터, 임상 데이터, 생존 데이터를 다운로드할 때 GSE32894_series_matrix.txt.gz 버튼을 클릭한 후 시리즈 매트릭스 파일 버튼을 클릭해 GSE32894 다운로드하세요.
   4. 해당 mRNA 데이터, 임상 데이터, 생존 데이터를 다운로드하여 GSE31684. GSE31684 데이터셋의 http 버튼을 클릭하세요. 또한 플랫폼 버튼을 통해 GPL570 플랫폼 데이터를 다운로드하세요. GSE31684 mRNA 데이터, 임상 데이터, 생존 데이터를 다운로드할 때 GSE31684_series_matrix.txt.gz 버튼을 클릭한 후 시리즈 매트릭스 파일 버튼을 클릭하고 GSE31684를 다운로드하세요.
   5. 필터링 단계에서 발현 수준이 0이거나 0에 가까운 무의미한 유전자를 제거합니다. 배치 교정을 위해 sva 패키지¹⁴를 기반으로 한 ComBat 방법을 사용하세요.

2. 단세포 분석 준비

1. GSE145281 준비
   1. 단일 세포 수준에서 연구를 수행하려면 전사체 데이터만으로는 어떤 세포 클러스터가 TRPM4 를 가장 유의미하게 발현하는지 판단하기에 불충분함을 고려하여 BLCA 단일 세포 데이터셋을 찾아야 합니다.
   2. 여기, 단일 세포 종양 분석을 위한 온라인 웹사이트인 TISCH2(http://tisch.compbio.cn/)로 가보세요.
   3. 실험적 필요에 따라 필요한 암 유형을 선택하며, 이 경우 BLCA를 예로 들었습니다.
   4. BLCA 버튼을 클릭하여 GSE145281이라는 데이터셋을 선택하세요.

3. BLCA의 분자 아형 및 치료 선택 데이터에 대한 반응 준비

1. ^{여기서 언급}된 기사에서 BLCA의 분자 아형과 치료 선택에 대한 반응 데이터를 다운로드하세요.
2. PubMed 웹사이트를 열어보세요 (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/). 기사를 검색하고 보조 표를 클릭하세요. 이 압축 파일 패키지에는 총 18개의 파일이 포함되어 있습니다.

4. TRPM4의 BLCA 면역 미세환경 분석

1. 서로 다른 TRPM4 그룹에서 133개의 면역조절제 발현을 나타내는 열맵 플롯
   1. TRPM4의 표현에 따라 모든 BLCA 샘플을 고TRPM4군과 저TRPM4군으로 나눕니다.
   2. 모든 샘플 이름과 TRPM4 발현 데이터를 따로 복사한 후, TRPM4 발현의 내림차순으로 정렬하고, 샘플의 전반부는 그룹 열에서 고-TRPM4 그룹으로, 후반부는 TRPM4 표현에 따라 저-TRPM4 그룹으로 분류합니다. 모든 TCGA-BLCA 환자 ID는 보충표 1에 기재되어 있습니다.
   3. 전사체 데이터 분석에 필요한 R 패키지를 설치하세요. 제공된 코드를 약간 수정한 뒤, 파일 위치를 변경한 후 코드를 실행하세요. 유전자 ID와 면역조절제의 ID가 올바르게 일치하는지 신중히 확인하며, 유전자 ID 뒤에 빈틈이나 눈에 띄지 않는 요인이 없는지 확인하세요. 이것이 히트맵 생성 실패의 주요 원인입니다.
2. ESTIMATE R 패키지를 이용한 종양 샘플의 기질 및 면역학적 분석
   1. 전사체 데이터 분석에 필요한 모든 R 패키지가 설치되어 있는지 확인하세요. 코드 요구사항에 따라 필요한 데이터의 이름을 해당 이름으로 지정한 후 실행 버튼을 클릭하세요.
      참고: 이 웹사이트는 온라인 분석 기능도 제공한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 웹사이트(https://bioinformatics.mdanderson.org/estimate/rpackage.html)를 방문해 원하는 결과를 얻을 수 있지만, 이 방법은 스스로 수집한 데이터를 분석하는 데 적합하지 않습니다.
   2. 질병 버튼을 클릭하고 방광 비상피암 옵션을 선택하세요. 그 다음 RNA-seq-V2 플랫폼 버튼을 선택하세요. 모든 샘플의 기질 점수, 면역 점수, 추정 점수를 다운로드하세요.
3. 서로 다른 TRPM4 그룹 간 발현의 바이올린 플롯
   1. 전사체 데이터 분석에 필요한 모든 R 패키지를 설치하세요. 필요한 모든 R 패키지는 보충 표 2에 나열되어 있습니다. 코드 요구사항에 따라 필요한 데이터의 이름을 해당 이름으로 지정한 후 실행 버튼을 클릭하세요.
   2. 유전자 ID가 올바르게 입력되었는지 신중히 확인하며, 유전자 ID 끝에 빈칸이나 눈에 띄지 않는 요소가 없는지 확인하세요. 이것이 바이올린 플롯 작성 실패의 주요 원인입니다.
4. 서로 다른 TRPM4 그룹 간의 삼각형 히트맵 플롯
   1. 전사체 데이터 분석에 필요한 모든 R 패키지를 설치하세요. TIGIT 과 CD80 같은 여러 면역 검사점 유전자의 발현 데이터를 반드시 준비하세요. TCGA-BLCA 전사체 데이터를 열고 면역 체크포인트 유전자 수가 많지 않은 상황에서 각 항목을 개별적으로 검색하세요.
   2. 코드 요구사항에 따라 필요한 데이터의 이름을 해당 이름으로 지정한 후 실행 버튼을 클릭하세요.
5. 서로 다른 유전자와 TRPM4 간의 상관도
   1. 전사체 데이터 분석에 필요한 모든 R 패키지를 설치하세요. 첫 번째 유전자로 TRPM4 를 채우고, 연구 중인 유전자를 두 번째 유전자인 CD3E 로 추가하세요.
   2. Run 버튼을 클릭한 후에는 CTLA4와 같이 분석이 필요한 다른 유전자로 CD3E를 변경하세요.

5. GSE145281 데이터셋에서 TRPM4 의 단일 셀 분석

1. 단일 세포 분석을 이용한 BLCA GSE145281 데이터셋 분석
   1. 웹사이트에 접속해 BLCA를 클릭하세요. 단세포 분석은 전사체 분석과 비교해 어떤 세포 클러스터가 TRPM4 발현이 높은지 더 심층적으로 탐구할 수 있게 해줍니다. 단일 세포 분석 데이터가 GSE130001에서 수집되었는지, 데이터셋당 세포 수가 1000 이상이어야 하고, 세포당 UMI 수가 1000 이상이어야 하며, 세포당 유전자 수가 500 이상이어야 하는지 품질 관리 기준과 비교해 확인하세요. 각 클러스터의 차등 발현 유전자는 로그 변환 접힘 변화(|logFC| >= 0.25)를 기반으로 식별되며, 클러스터링 해상도는 0.5여야 합니다.
2. 서로 다른 셀 클러스터에 대한 셀 주석
   1. 모든 셀 클러스터에 주석이 달려 있는지 확인하세요. 예를 들어, B 세포는 CD19, MS4A1, CD27, IGHD, IGHM, TCL1A, FCRL5로 주석을 줄 수 있습니다. 세포 주석에 사용되는 모든 유전자는 보충표 3에서 확인할 수 있습니다.
   2. 그다음 GSE145281 선택하고 TRPM4의 모든 결과를 다운로드하세요. 전체 버튼을 클릭하여 다양한 클러스터와 세포 유형의 GSE145281 UMAP 플롯을 다운로드하세요.
   3. 유전자 버튼을 클릭하고 분석할 단일 유전자를 선택하세요. GSEA 버튼을 클릭하여 KEGG 경로와 Hallmark 경로^{16, 17} 등 다양한 경로에서 이 단일 유전자의 기능을 관찰하세요.
   4. CCI 버튼을 클릭하면 단일 유전자를 고도로 발현한 클러스터의 세포 채팅 플롯과 세포 채팅 버블 플롯을 찾을 수 있습니다.
   5. 각 클러스터의 강화된 전사체 인자를 보려면 TF 풍부 버튼을 클릭하세요.

6. 101 TRPM4와 관련된 예후 모델 구축을 위한 머신러닝

1. 전사체 데이터 분석에 필요한 모든 R 패키지를 설치하세요. 단일 머신러닝 접근법이 항상 예후 예측에 최적의 방법은 아닐 수 있음을 고려할 때, 101가지 머신러닝 기법을 활용해 예후 모델을 구축할 수 있습니다. TCGA-BLCA 코호트와 GSE32894 및 GSE31684 코호트, TRPM4 간의 모든 유전자 간 상관관계 분석을 수행하라.
2. TRPM4와 강하게 연관된 유전자 수를 기준으로, TRPM4와 상관관계가 0.6 이상이거나 -0.6 이하인 모든 유전자를 선택합니다. 모든 코호트에서 TRPM4와 강하게 연관된 모든 유전자를 선택하라.
3. GSE32894 및 GSE31684 코호트의 모든 데이터를 합쳐 검증 세트를 만들고 TCGA-BLCA를 훈련 세트로 사용하세요.
4. 코드 요구사항에 따라 필요한 데이터의 이름을 해당 이름으로 지정한 후 실행 버튼을 클릭하세요.

결과

전사체학을 이용해 개별 유전자의 면역 미세환경을 분석하는 핵심 이점은 개별 유전자와 유전자 발현 수준에서 면역 세포 및 분자와의 동적 상호작용 간의 직접적인 상관관계를 가능하게 하여 면역 특성을 직접 관찰하고 개별 유전자 발현이나 변화가 높거나 낮은 그룹 간 침투 세포 비율 차이를 식별할 수 있다는 점으로 잘 알려져 있습니다 면역 체크포인트 분자의 발현에¹⁸. 생물정보학 분석의 대표적인 결과는 면역 미세환경 및 바이올린 플롯 등과 같은 면역 분자 분석과 관련된 것입니다. 단일 세포 분석의 대표적인 결과는 각 세포 클러스터의 목표 유전자 발현 수준과 각 세포 클러스터의 경로 열맵 분석입니다. 101개의 머신러닝 모델의 대표적인 결과는 예후 모델을 구축하는 데 사용되는 알고리즘의 히트맵입니다.

우선, 히트맵 플롯은 133개의 면역조절자가 저TRPM4 그룹에서 더 많...

토론

이전 연구에서는 단일 유전자에 대한 생물정보학 분석이 피상적, 부정확성, 적용 가능성 제한 등의 문제에 자주 부딪혔습니다¹⁹. 더욱이 이전 단일 유전자 연구는 대개 전사체 데이터에 국한되어 왔습니다. 더불어, 전사체 데이터에만 집중할 때는 샘플 이질성과 무작위성 같은 문제가 발생할 수 있어 보편적인 패턴을 식별하기 어려울 수 있습니다²⁰. 따라서 앞서 언급한 문제를 해결하기 위해 단일 세포 데이터를 도입하여 경로 수준에서 개별 유전자의 중요한 역할을 더 잘 이해하려 했습니다. 이 글의 핵심 단계는 단일^{세포 분석을 위한} 온라인 웹사이트 TISCH2(http://tisch.compbio.cn/)가 도입되었다는 점입니다. 품질 관리를 위해 사용되는 표준은 데이터셋당 세포 수가 1000 이상, 세포당 UMI 수가 1000 이상, 세포당 유전자 수가 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
R 4.3.3	전혀 없습니다	전혀 없습니다	전혀 없습니다