아밀로이드와 교차 베타 구조

요약

아밀로이드 섬유는 수많은 단백질에 의해 형성되며, 그 결과 섬유들은 '교차 β-시트' 구조를 공유합니다. 여기서는 아밀로이드 섬유 샘플이 X선 섬유 회절을 위해 어떻게 준비되는지, 그리고 그 패턴이 어떻게 분석될 수 있는지 설명합니다.

초록

아밀로이드 섬유는 잘못 접힌 자가 조립된 단백질이 잘 정의된 반복 구조로 조직되어 있습니다. 이들은 알츠하이머병과 제2형 당뇨병 등 단백질 오접힘 질환에서 중요한 역할을 하는 것으로 잘 알려져 있는데, 이 질환에서는 불용성 아밀로이드 섬유가 조직에 침착됩니다. 더 나아가, 이들이 많은 생물체에서 중요한 기능적 역할을 하여 강도, 비계, 보호를 제공하는 것으로 밝혀졌습니다. 아밀로이드의 첫 구조 모델은 정렬된 아밀로이드 섬유 다발에서 X선 섬유 회절 데이터를 수집하여 작성되었습니다. 이로 인해 일반적인 교차 β 구조의 초기 모델이 만들어졌으나, 고도로 방향성 및 반결정질 샘플에서 이루어진 보다 상세한 회절 분석으로 대체되어 펩타이드가 반복 구조로 조직되는 세부 사항이 밝혀졌습니다. 여기서는 이러한 섬유의 기저 구조를 규명하는 방법을 설명하는 데 집중했으며, 다양한 병원성, 기능적, 합성적 출처에서 얻은 아밀로이드 섬유의 공통 특징을 기술했습니다. 샘플 준비, 데이터 수집, 그리고 실험 데이터와 비교할 수 있는 모델 구조를 생성하기 위해 그 과정을 설명합니다.

서론

아밀로이드 섬유는 아밀로이도스(Amyloidoses)라는 질환군에서 처음 확인되었으며, 이 질환에서는 단백질성 섬유가 조직의 세포외 공간에 축적^됩니다. 각 질병은 특정 전구체 단백질이 구조 변화를 겪어 고도로 질서가 정돈된 단백질 섬유를 형성하는 것이 특징입니다. ^2,3. 최근의 아밀로이드 섬유 정의는 이제 세포 환경 내에 축적되는 섬유를 포함하게 되었습니다. 최근에는 아밀로이드 구조를 이용해 안정성, 접착, 또는 정보 저장을 제공하는 여러 기능적 시스템이 확인되었습니다. 아밀로이드 섬유를 형성하기 위해 자기 조립할 수 있는 다양한 단백질 구조가 있음에도 불구하고, 이들은 모두 교차 β 구조를 공유합니다⁴. 이 교차 β 배열은 처음에 Astbury가 닭 흰자⁵에 대해 기술했으며, 이후 Geddes가 교차 β 실크⁶에 대해 추가로 설명했습니다. 이 단백질 구조에서 섬유는 섬유 축에 수직으로 뻗은 β가닥으로 구성되며, 이들은 β 시트로 배열되어 측면 사슬을 통해 결합하여 이후 격체 지퍼⁷(steric zippers)이라 불리게 됩니다. 이로 인해 섬유와 평행하게 흐르는 수소 결합을 통해 매우 안정적인 조직이 형성되며, 옆사슬을 통한 소수성, 정전기적, 극성 상호작용도 함께^{이루어집니다.}

초기 구조 연구에서는 X선 섬유 회절을 이용해 아밀로이드 섬유의 구조를 조사했는데, 이를 통해 섬유들이 정렬되고 방향을 맞추어 아밀로이드 섬유 다발을 형성하여 회절계 ^9,10의 X선 빔에 배치할 수 있었습니다. 인간 질병 조직에서 추출하거나 시험관 내에서 배양된 여러 아밀로이드 섬유에서 회절 패턴에 맞도록 아밀로이드 섬유의 일반적인 구조가 생성되었으며^, 이는 추가 구조 설명의 기초가 되었습니다¹¹. 최근 몇 년간 고체 상태 핵자기공명(ssNMR), 미세결정 X선 결정학, 극저온 전자현미경(CryoEM) 기술의 발전으로 교차 β 구조¹¹의 원자 세부 정보를 제공했습니다. 그러나 X선 섬유 회절 방법은 여전히 중요하고 유용하며, 단백질의 반복적 조직에 관한 정보를 제공합니다. 또한, 경우에 따라 장거리 명령과 관련된 정보가 접근 가능할 수도 있습니다. 근본적으로, X선 섬유 회절은 다양한 단백질에서 형성된 아밀로이드 섬유의 존재를 확인하는 데 자주 사용되며, 교차 β 패턴은 섬유 조립체가 아밀로이드¹²로 분류되기 위한 주요 조건 중 하나입니다.

여기서는 아밀로이드 섬유를 준비하고 X선 섬유 회절 데이터 수집을 위해 정렬하는 방법에 대해 설명합니다. 더 나아가, 회절 데이터를 어떻게 추가 분석하여 모델 구조를 생성하고, 예측된 회절 패턴을 생성하며, 체외에서 유래한 섬유 데이터와 비교할 수 있는지에 대한 세부 정보를 제공합니다.

프로토콜

1. X선 섬유 회절을 위한 섬유 샘플 준비

1. 선택한 아밀로이도젠 펩타이드의 섬유질 형성에 최적의 조건에서 단백질 또는 펩타이드를 용해하고, 전자현미경 또는 원자력 현미경을 사용해 섬유 형성을 평가합니다. 샘플 준비 및 영상 수행 방법에 대한 자세한 내용은 다른 곳에서 확인할 수 있습니다.¹³. 섬유가 길고 곧으며 분기가 없는지 확인하세요. 예를 들어, 그림 1 에 표시된 섬유들은 투과 전자현미경(TEM)으로 촬영되었습니다. 섬유가 포함된 방울을 전자현미경 그리드에 놓고 우라닐 아세테이트¹⁴로 음염색합니다.
   참고: 그리드 위에 섬유가 고르게 덮이고 분포하는 것이 바람직합니다.
2. 섬유 축이 모두 평행하게 정렬되도록 정렬하세요(그림 2A).
   1. 핫플레이트를 사용해 캔들 왁스를 녹여 액체가 되도록 하세요. 다이아몬드 펜과 같은 유리 절단기를 사용해 1mm 붕규산 유리 모세관을 약 2-3cm 길이로 잘라내고 잠시 액체 왁스에 담갔습니다. 모세관 작용으로 촛불 왁스를 끌어올립니다(모세관 내 길이 약 1-2mm). 섬유 현탁액이 고르게 놓일 수 있도록 왁스 표면이 평평한지 확인하세요.
   2. 플라스티신을 사용해 밀폐된 모세혈관을 페트리 접시에서 왁스로 채운 끝 사이에 0.5mm에서 2mm 사이의 간격을 두고 수평으로 부착합니다(그림 2A).
   3. 피펫을 사용해 두 모세관의 왁스로 채워진 끝 사이에 10 μL 용액 방울을 조심스럽게 떠 놓습니다. 용액이 양쪽 왁스 끝에 닿지만 유리로 이어지지 않도록 하세요.
   4. 페트리 접시를 덮어 샘플을 먼지로부터 보호하세요. 샘플을 하룻밤 동안 증발시키면 섬유가 정렬됩니다( 그림 2A 참조).
      참고: 샘플이 완전히 건조되기까지 며칠이 걸릴 수 있으며, 이는 주변 온도와 습도, 샘플의 점도에 따라 달라집니다.
   5. 접시를 밀봉하세요; 냉장고에서 낮은 온도에서 배양하거나, 밀봉된 상자에서 습기를 유지해 건조 속도를 늦추어 샘플의 정렬을 개선할 수 있습니다.
3. 유리 모세혈관 내 아밀로이드 섬유를 정렬합니다(그림 2B).
   1. 1mL 주사기를 넓은 끝에 작은 고무 튜브 조각을 부착해 직경 0.7mm의 실리콘 유리 모세관으로 고정하고, 2-3cm 섬유 현탁액을 흡인합니다.
   2. 모세관 한쪽 끝은 녹인 왁스로 밀봉하고, 다른 쪽 끝은 열려 증발을 허용하세요. 모세혈관을 수직으로 배열하고 며칠 또는 몇 주에 걸쳐 건조하여 모세관 내에 마른 원반을 형성합니다(그림 2B).
4. 섬유를 '매트' 또는 얇은 필름으로 정렬합니다(그림 2C).
   1. 유리 슬라이드, 파라필름 또는 테플론 조각 위에 고농도(예: > mg/mL)의 섬유질 샘플을 덮고 최소 24시간 자연 건조시킵니다. 이 재료는 얇고 평평한 표면 표면을 형성할 수 있도록 건조됩니다. 이 부분을 메스로 조심스럽게 들어 올린 후 접착제나 플라스티신으로 유리 모세관 튜브에 부착하세요.
   2. 매트는 섬유들이 무작위로 배열되어 있습니다( 그림 2C 참조). 샘플을 고니오미터 헤드에 조심스럽게 장착하여 X선 빔이 샘플 가장자리를 통과하고 필름 평면과 평행하게 지나가도록 하세요(그림 2C).
      참고: 필름 표면을 통과하는 회절은 무작위 정렬로 인해 회절 링을 생성합니다( 그림 2C 참조).
5. 샘플을 조사해.
   1. 광학 현미경 아래 교차편광 장치를 통해 샘플이 얼마나 잘 정렬되었는지 조사하세요. 이중 굴절이 존재한다면, 섬유다발 내 정렬이 잘 이루어져 있음을 시사할 수 있습니다.
   2. 모세관 섬유 샘플을 플라스티신으로 고니오미터 헤드에 부착합니다. 샘플을 X선 빔에 넣을 때 섬유 다발, 매트, 디스크 중 어느 것인지 고려해 보세요.
      1. 샘플 회전 축은 섬유 다발의 경우 섬유 축을 중심으로 배치되지만(그림 2A), 원판에서는 섬유가 튜브 직경을 따라 정렬되는 경향이 있습니다(그림 2B). 매트는 두 가지 뚜렷한 방향(필름 평면에 평행하거나 수직)을 가집니다(그림 2C).
   3. 회절 패턴( 그림 3A에 나타난 것처럼)은 자체 X선 장비(단백질 결정학용 CuKα)나 싱크로트론 방사선을 사용하여 수집합니다. 노출 시간은 X선 빔의 세기에 따라 달라집니다; 회절원의 권장 수집 시간에 따라 이 시간을 조정하세요.

2. 데이터 분석

1. 데이터 분석을 위한 CLEARER 사용¹⁵.
   참고: X선 섬유 회절 패턴 분석 프로그램은 교신저자로부터 학술 사용자에게 무료로 제공됩니다. 회절 분석에는 다른 방법들도 있습니다^16,17 (www.esrf.fr/computing/expg/subgroups/data_analysis/FIT2D)¹⁸. 괄호 안의 이탤릭체는 메뉴 명령을 나타냅니다.
   1. 회절 패턴을 .tiff 파일로 변환한 후 CLEARER(그림 4)에 업로드합니다.
   2. 회절 설정(회절 패턴: 회절 설정)을 입력하라. 여기에는 TIFF 이미지의 픽셀 크기, X선 소스, 시료와 검출기 사이의 거리가 포함된다.
   3. 회절 패턴이 자오선이 수직으로 정렬되도록 하세요(이미지 처리: 회전). 중심 모듈(회절 패턴: 중심 이미지) 을 사용해 이미지를 중심에 맞추세요. 두 주요 축(자오선과 적도)을 정의합니다: - 이 모듈은 패턴의 두 축을 따라 강도를 비교합니다. 중심 맞추기가 완료되면 이미지를 저장하고 다음 단계에 사용되도록 하세요.
   4. 적절한 각도(두 주요 축[자오선과 적도]를 따라 설정)를 지정하고, Radial Average 모듈 (회절 패턴: Radial Average)(그림 4A)을 사용해 회절 신호 위치를 강도에 대한 그래프로 출력합니다.
   5. 피크 파인드 모듈(회절 패턴: 반경 평균: 피크 파인드)을 사용하여 회절 신호 위치를 측정하고 자동으로 출력합니다(그림 4B). 피크 탐색 폭을 조정하면서 잡음이 감지되지 않도록 하여 모든 회절 신호가 정확히 검출되고 있는지 확인하세요.
   6. Zoom & Measure 모듈(회절 패턴: Zoom & Measure)을 사용하여 Peak Find에서 출력하는 신호 위치를 확인하세요. 모든 신호 위치가 표시되어 있고 올바른 축에 할당되어 있는지 확인하세요.
   7. 유닛셀 최적화 모듈(회절 패턴: 유닛 셀 최적화)(그림 5A)을 사용하여 관찰된 회절 신호를 생성할 단위 셀 치수(b와 c)를 탐색합니다. 적도에서 발견된 강한 신호를 분석하여 단위 셀 입력 테이블에 입력할 초기 추정을 생성하고, CLEARER가 잠재적 셀을 검색하는 최소 및 최대[hkl] 지수를 지정하세요(차원은 자오선이며 기본값은 4.76 Å입니다).
   8. 잠재 단위 셀 치수를 계산하고 예측된 회절 신호 위치를 관측된 반사와 비교합니다. 단위 셀은 예측된 신호와 실험 신호 간의 일치 정도에 따라 점수가 매겨집니다. 상위 20개 경기가 표시됩니다. 펩타이드 전구체 길이와 전자현미경, AFM, 또는 고체 상태 핵자기공명(ssNMR)에서 얻은 기타 정보를 고려하여 데이터와 샘플에 가장 적합한 단위 셀을 선택하는 데 도움이 됩니다.

3. CLEARER를 이용한 구조 모델링 및 모델 테스트

1. 분자 모델(PDB 형식) 구성.
   참고: Pymol(DeLano)¹⁹ 또는 Insight II(Accelerys) 등과 같은 단백질 모델링 프로그램을 활용하여 β가닥 구조와 β 종 배열로 전구체 펩타이드의 PDB 좌표를 생성하세요. 이 절에서는 직방계 단위자(모두 90° 각도)에 사용되는 간단한 과정을 설명합니다. 회절에 대한 더 전문적인 지식이 필요한 경우에는 직교가 아닌 조직도 가능합니다. 이러한 요소들은 더 복잡한 단위 셀에 대해서는 CLEARER에서 탐구할 수 있습니다.
   1. 결정된 단위 세포에 맞게 β 시트 배열로 펩타이드를 3차원 배열로 만듭니다. 이 모델이 셀 내 모든 대칭 관련 객체를 포함하는지 확인하세요.
   2. PDB 모델을 구조 체인 생성기 모듈(회절 시뮬레이션: 구조: 구조 체인 생성기)에 로드하여 구성된 구조 좌표를 확인하세요. 광섬유 축과 빔 축이 올바르게 할당되었는지 확인하세요. 결정된 단위 셀 치수를 입력하세요. 선택한 셀 차원에서 충돌이 발생하는지 확인하세요(그림 5B).
   3. PDB 모델 좌표를 Fiber Diffraction Simulation 모듈 (회절 시뮬레이션: Fiber Frifraction Simulation)에 업로드합니다.
      1. 광섬유 축 방향, 빔 방향, 3.1.2단계에서 선택한 단위 셀 치수, X선 광원 및 검출기 설정을 입력한 후 시뮬레이션을 클릭하세요. 직교 단위 셀 시뮬레이션에서, 섬유 축은 사용되는 모델 내 섬유 축의 방향과 관련된 데카르트 축에 의해 정의됩니다.
      2. 빔 축이 광섬유 축에 수직으로 위치하는지, 즉 다른 두 축 중 하나에 있는지 확인하세요. 시뮬레이션 설정을 .html 파일로 저장하세요 (파일: 다른 이름으로 저장). 이 자료들은 업로드 및 편집하여 최적의 모델 구조를 반복적으로 탐색할 수 있습니다.
      3. 생성된 시뮬레이션 패턴을 원본 형식으로 저장하여 나중에 업로드하여 추가 분석에 사용할 수 있고, .tiff 형식으로 저장하세요(이 형식은 추가 대비 정보가 폐기됨) (시뮬레이션: TIFF로 보이는 이미지를 저장하기). 그런 다음 실험 패턴과 비교해 보세요.
2. 시뮬레이션된 회절 패턴과 실험 패턴을 비교해 보세요.
   1. 2.1.5-2.1.6단계를 사용하여 시뮬레이션된 회절 신호를 측정하고 실험 패턴에서 측정한 신호와 비교하세요(그림 6). 이 자료들을 표에 기록하세요.
   2. Layers (회절 패턴: 레이어)라는 모듈을 사용하여 시뮬레이션된 패턴과 실험 패턴을 겹쳐 신호 위치를 비교하세요(그림 6C).
   3. 실험 패턴과 시뮬레이션 패턴 간의 신호 위치와 상대적 강도를 비교하므로, 시뮬레이션 패턴의 사분면을 실험 패턴과 나란히 배치합니다(그림 6B에 나타난 참조)^{8, 20, 21}.
   4. 제안된 단위 셀과 모델의 타당성을 평가한 후, 시뮬레이션된 패턴과 실험 회절 패턴 간의 유사성을 개선하기 위해 모델과 셀을 반복적으로 수정합니다.
   5. 3.1단계에서 제시한 절차를 사용하여 다양한 모델과 셀의 결과를 광범위하게 비교하여 여러 대안을 테스트합니다. TEM, AFM, NMR 등 다른 기법에서 수집한 정보가 모델링을 제약^{하고 데이터에 가장} 적합한 구조적 표현에 도달하는 데 도움이 되도록 고려^하세요.

결과

CcbMet 예^{시 24}: 그림 1은 X선 섬유 샘플 준비에 적합한 격자 위에 아밀로이드 섬유가 고밀도로 표시된 전자현미경 사진을 보여줍니다. 그림 2는 섬유 샘플 섬유 다발(그림 2A), 디스크(그림 2B), 매트/필름(그림 2C)에서 생성될 수 있는 다양한 텍스처를 설명하며, X선 빔의 방향을 보여줍니다. 그림 3A는 스트레치 프레임 정렬 섬유(도면 2A에 텍스처 표시)에서 얻은 회절 패턴을 보여주...

토론

X선 섬유 회절은 샘플이 아밀로이드 구조를 형성하는지 평가하고, 섬유 내 전구체 단백질 또는 펩타이드의 분자 조직에 대한 추가 통찰을 얻는 데 활용될 수 있습니다. 여기서는 섬유질 샘플을 X선 섬유 회절을 위해 준비하는 방법, 데이터를 얻고 분석하는 방법을 설명했습니다. 중요한 점은, 얻어지는 데이터의 품질이 각 섬유 내 차수에 따라 달라진다는 점입니다. 따라서 초기 샘플 준비가 매우 중요하며, 섬유가 합성 섬유인지 조직에서 추출한 것인지도 데이터 품질에 영향을 미칩니다. 아밀로이드 섬유 조립을 위한 최적의 완충제를 찾는 것이 중요할 수 있는데, 과도한 염분이 패턴을 가릴 수 있기 때문입니다. 인산 버퍼와 같은 염 완충제에서 만든 섬유를 세척하면 섬유의 품질과 정렬 정도를 모두 개선하여 더 높은 품질의 데이터를 얻을 수 있습니다. 정렬 방법의 최적화는 2절의 방법에서 선택하거나 샘플 건조 속도를 늦춰 정렬 시간을 늘리는 방식으로 품질을 향상시킬 수도 있습니다. 섬유들이...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.7 mm 직경 X-ray  석영 유리 모세관	GLAS, W. Muller, D-13503, Berlin, Germany	Q-07-001-80
유리 모세관 1,5 mm 붕규산염	Harvard appatus Ltd, (Edenbridge, Kent, UK)	BS4 30-0074	다른 제조업체에서 예제 사용 가능
단백질 결정학 X-ray 회절계	다양한		다양한 제조업체