질량분석법을 이용한 혈장 단백질체학의 종합 워크플로우: 전신성 인간 질환에서 바이오마커 발견을 위한 전략

요약

혈장 단백질체학은 최소 침습 샘플링을 통해 전신 질환의 바이오마커 발견을 가능하게 합니다. 플라즈마 복잡성으로 인한 분석적 도전에도 불구하고, 본 연구는 단백질체 커버리지를 높이고 변동성을 줄이며 재현성을 높이는 최적화된 액체 크로마토그래피-질량분석법(LC-MS/MS) 워크플로우를 제시하여 질병과 대조군 샘플 간 정확한 비교를 가능하게 합니다.

초록

혈액의 세포 없는 성분인 혈장은 최소 침습적이고 풍부한 생체분자 정보를 제공하여 전신 질환 연구에 이상적입니다. 고처리량 단백질체학 기술의 등장은 순환 단백질의 대규모 식별 및 정량화를 가능하게 하여 혈장 분석에 혁신을 가져왔습니다. 이러한 발전은 암과 염증성 질환을 포함한 다양한 질환의 조기 진단, 예후, 치료 표적 개발을 위한 바이오마커 발견을 촉진했습니다. 그러나 플라즈마의 고유한 복잡성과 일관되지 않은 샘플 준비 및 분석 방법으로 인해 역사적으로 프로테옴 커버리지와 재현성이 제한되어 왔습니다. 초기 원플라즈마 분석에 의존한 접근법은 일관성이 낮고 배치 효과가 심각하여 임상 코호트 간 신뢰할 수 있는 비교 연구를 방해했습니다.

이러한 한계를 극복하기 위해 본 연구는 견고하고 확장 가능한 플라즈마 프로테오믹스 워크플로우를 도입합니다. 프로토콜은 면역 고갈, 분자량 차단 여과, 동결 건조, 단백질 정량화 및 정규화, 효소 소화, LC-MS/MS 프로파일링 등 주요 준비 단계를 통합합니다. 이 최적화된 전략은 단백질체 깊이를 크게 높이고 변동성을 줄여, 질병 사례와 건강한 대조군 간 단백질 발현 차등 분석을 보다 정확하고 재현 가능하게 합니다. 이 워크플로우는 혈장에서 고품질 프로테오믹 데이터를 생성하려는 연구자들에게 귀중한 플랫폼을 제공하며, 궁극적으로 바이오마커 기반 진단과 개인 맞춤형 의학의 발전에 기여합니다.

서론

혈장은 혈액의 세포 없는 구성 요소로, 질병 연구에 관련된 생물학적 정보의 저장소로서 점점 더 인정받고 있습니다. 단백질과 대사산물부터 지질과 핵산에 이르기까지 다양한 순환 생체분자를 운반하는데, 이는 유기체의 생리적·병리학적 상태를 반영합니다. 이러한 전신적 혈장 특성은 암부터 대사 및 염증성 질환에 이르기까지 질병 병태생리를 조사하는 데 이상적인 생체 표본입니다. 혈장을 샘플로 사용하는 주요 장점은 최소 침습 채취 방식으로, 임상 환경에서 반복 샘플링이 가능하다는 점으로, 이는 질병 진행이나 치료 반응 관찰에 중요합니다. 그러나 혈장은 알부민과 면역글로불린 같은 단백질이 10자릿수 이상에 걸쳐 존재하는 매우 복잡한 프로테옴 매트릭스를 가지고 있어 식별¹을 가립니다.

지난 20년간 혈장 단백질체학은 대규모 단백질^{분석 기술의} 발전에 힘입어 베타-인간 융모성 생식선자극호로핀(β-hCG)과 트로포닌 I과 같은 임상적으로 중요한 바이오마커의 식별을 가능하게 했습니다. 이 도구들은 입력으로 매우 민감한 정보를 받아들이며, 고처리량 특성 덕분에 혈장 단백질의 대규모 프로파일링을 제공합니다. 액체 크로마토그래피-질량분석법(LC-MS/MS) 플랫폼의 등장으로 이제는 10-50 μL 정도의 혈장 입력만으로도 수천 종의 단백질을 분석할 수 있으며, 동적 검출 범위는 수 차원의 ^3,4에 달합니다. 이로 인해 전개 연구에서 플라즈마 단백질체학의 활용이 증가했습니다: 조기 질병 발견, 예후 모델 개선, 새로운 치료 표적 발견⁵.

이 분야의 중요한 이정표는 인간 혈장 단백질체 프로젝트(HUPO-HPPP)의 설립으로, 이 프로젝트는 혈장 단백질을 체계적으로 분류하고 혈장 단백질체학이 확립된 분야로서 실현 가능성을 입증했습니다^. 이후 임상 단백질체 종양 분석 컨소시엄(CPTAC)은 이전에 프로테오^{믹 연구를} 혼란스럽게 했던 재현성 문제를 해결하기 위해 엄격히 검증된 프로토콜과 실험실 간 연구를 채택했습니다. 이 이니셔티브들은 표준화의 필요성을 강조하며, 균일한 혈장 취급, 풍부한 단백질 고갈, 효소 소화, 일관된 LC-MS/MS 매개변수 등 주요 절차를 강조했습니다. Geyer와 동료들의 최근 연구는 표준화된 방법론을 사용할 경우 많은 개인에서 혈장 단백질체 서명을 신뢰성 있게 생성할 수 있음을 보여주었으며, 이는 집단 수준 연구와 바이오마커 검증 과정의 기초가 된다는 것을 보여줍니다^.

플라즈마 프로테오믹스의 발전은 품질 관리(QC)와 성능 지표가 실험 설계의 핵심 요소로 인식되면서 크게 형성되었습니다. 전통적으로 소화 효율, 펩타이드 식별률, 기기 성능의 차이는 연구 간 불일치를 초래하여 재현성에 영향을 미쳤습니다. 이 문제를 해결하기 위해 많은 연구가 진행되었습니다. Gawor 등은 샘플 준비와 질량분석 성능에 대한 측정 가능한 품질 지표를 제시하여, 단백질 프로파일링 파이프라인의 견고성을 체계적으로 평가하는 방법을 제시했습니다⁹. Tsantilas 등은 연구자들이 플랫폼과 실험실 간 데이터셋을 비교할 수 있도록 하는 컴퓨터화된 벤치마킹 도구를 제시했으며, 이를 통해 단백질체학 데이터 제시의 투명성을 높였습니다¹⁰. 더불어, 면역 고갈, 크기 배제 분할, 데이터 독립적 획득(DIA)과 같은 방법론의 발전으로 단백질체 범위가 확대되고 기술적 편향이 감소했습니다^11,12. 이러한 품질 보증 조치는 혈장 단백질체 데이터가 재현 가능하도록 보장하며, 향후 임상 번역 연구의 기반이 됩니다.

이러한 중요한 발전에도 불구하고, 플라즈마의 고유한 복잡성은 여전히 도전 과제를 품고 있습니다. 조잡 혈장을 직접 분석할 경우 단백질이 저생물 지표 후보인 저농도 분석물을 압도하기 때문에 프로테옴 커버리지가 최적이 아닌 경우가 흔합니다. 더불어, 단백질 정량 변동, 소화 불완전, 정화 부족으로 인한 기술적 변동이 배치 인공물과 코호트 비교 가능성 감소에 기여할 수 있습니다¹³. 이러한 한계는 프로테옴 깊이, 재현성, 확장성을 균형 있게 조절하는 고도로 최적화된 워크플로우의 필요성을 강조합니다. 본 연구 프로토콜은 면역 고갈, 분자량 차단 여과, 동염건조, 단백질 정규화 및 정량, 효소 소화, LC-MS/MS 프로파일링을 결합한 최적화된 플라즈마 단백질체학 워크플로우를 시연하여 이러한 요구를 충족합니다. 프로테옴 커버리지를 확대하고 기술적 변동을 줄임으로써, 이 방법론적 틀은 질병 영향군과 대조군 간의 일관된 상대적 정량화를 가능하게 합니다. 확장성을 도입하고 하위 분석을 수용함으로써, 이 워크플로우는 플라즈마 단백질체학에서 임상적으로 중요한 정보를 추출하는 실용적이고 재현 가능한 방법을 제공합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 전신 염증성 질환에서 바이오마커 발견을 위한 혈장 단백질체학을 향상시키기 위해 설계된 간소화된 워크플로우를 개략적으로 제시합니다^14,15. 이 연구는 제도윤리위원회와 1975년 헬싱키 선언(2000년 개정)에 따라 수행되었습니다. 참가자들로부터 사전 동의를 받았습니다. 초기에는 혈장 샘플에서 고농도 단백질을 제거하기 위해 면역 소모 처리를 거치고, 이후 분자량 기반 여과를 통해 샘플 복잡성을 줄입니다. 샘플은 이후 동결 건조 및 정량화되어 단백질 농도가 하위 가공에 적합한지 확인합니다. 정규화 후에는 단백질을 트립틱 소화하여 분석에 적합한 펩타이드를 생성합니다. 마지막으로, 질량분석법을 활용해 저농도 단백질을 검출하고 정량화하여 건강한 상태와 질병 상태 간의 신뢰할 수 있는 비교를 가능하게 합니다(그림 1)는 혈액 단백질체학 파이프라인을 보여줍니다.

1. 샘플 수집:

1. 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA) 진공관 참가자로부터 무균 조건 하에 정맥 정맥을 정맥 천공하여 3mL의 혈액을 채취합니다. 이 작업은 훈련된 채혈사가 수행합니다.
2. 플라즈마를 분리하기 위해, 시료를 12× 15mL의 고정각 로터로 704g에서 10분간 원심분리합니다. 혈장 샘플은 -80 °C 온도에서 보관하여 다음 검사를 기다려야 합니다.

2. 면역 저하

참고: 면역 고갈은 혈청, 혈장, 뇌척수액(CSF)과 같은 생물학적 체액에서 고농도 단백질을 선택적으로 제거하는 친화 크로마토그래피 기반 방법입니다. 고정된 항체가 담긴 스핀 카트리지는 알부민, 면역글로불린(IgG, IgA, IgM), 트랜스페린, 보체 C3 등 14가지 흔한 고풍부도 단백질을 표적으로 표적으로 포착합니다. 이 단백질들은 카트리지 내에 보관되고, 저점유 단백질은 추가 분석을 위해 통과합니다. 이 기술은 샘플 복잡도를 줄이고 잠재적 바이오마커 검출을 개선하여 프로테옴 프로파일링을 향상시킵니다. 이 접근법은 감도와 재현성을 높이기 위해 플라즈마 프로테오믹스에서 널리 채택되고 있습니다^16,17.

1. 탄약 준비
   1. 0.45mL 스핀 카트리지를 냉장고에서 꺼내세요. 주변 온도에 맞게 평형을 맞추세요.
   2. 처리한 샘플 수에 따라 버퍼 A 에퀴클/로드/워시 및 버퍼 B 용출을 준비합니다. 10 μL 혈장 샘플당 약 5mL의 버퍼 A와 2mL의 버퍼 B를 도포합니다. 50mL 멸균 원심분리기 튜브에 디캔트합니다.
   3. 멸균 루어-록 5mL 주사기 두 개를 완충 A, B(완충 B)로 라벨을 붙입니다.
2. 혈장 샘플 준비
   1. 각 10 μL 혈장 샘플을 190 μL 버퍼 A로 희석하여 최종 부피 200 μL로 만듭니다.
      참고: 가공 중 혈장 단백질 분해를 방지하기 위해 버퍼 A에 프로테아제 억제제를 첨가하세요.
   2. 혈장 샘플에는 입자 물질이 포함될 수 있습니다. 카트리지가 막힐 수도 있어요. 막힘을 방지하고 시료 투명도를 높이기 위해 희석된 시료를 0.22 μm 스핀 필터에 1분간 원심분리하여 16,000 × 4 °C에서 원심분리합니다.
3. 카트리지 설치
   1. 카트리지 캡과 하단 캡을 분리하고 나중에 사용할 수 있도록 보관하세요.
   2. 스핀 카트리지에 루어-록 어댑터를 부착하세요.
   3. "A"라고 표시된 주사기에 버퍼 A 4mL를 채취한 후 주사기를 루어-록 어댑터에 연결하세요.
   4. 서서히 버퍼 A를 카트리지 안에 흐르게 하여 수지가 평형을 이루고 갇힌 공기를 밀어내도록 합니다.
   5. 멸균 마이크로피펫으로 카트리지 상단의 과잉 버퍼를 흡입하세요.
   6. 루어-록 어댑터를 제거하고 스핀 카트리지를 F1이라고 표시된 나사 캡 수집관에 넣으세요.
4. 시료 하딩 및 분획 수집
   1. 여과되고 희석된 플라즈마 200 μL를 레진 베드에 직접 첨가합니다.
   2. 카트리지를 100 × g 에서 4 °C에서 1분간 원심분리합니다. 카트리지를 캡 없이 하거나 느슨하게 캡을 닫아 원활한 흐름을 유지하세요.
   3. 표지된 수집관에서 유동 분획 F1을 수집합니다. 원심분리 후 수지 베드와 프릿이 촉촉하게 유지되도록 하세요.
   4. 카트리지를 실온에 5분간 두세요.
5. 흐름 분수의 세척과 회수
   1. 400 μL 버퍼 A를 수지 베드에 추가하고 100 × g 에서 4 °C에서 2.5분간 원심분리합니다. 이 리루테이트를 F1 수집관에 추가하세요.
   2. 카트리지를 F2라고 표시된 새 수집관으로 옮기세요.
   3. 버퍼 A 400 μL를 추가하고 100 × g 원심분리기에서 4 °C에서 2.5분간 가열합니다. F2 튜브에 루에이트를 모으세요.
6. 결합 단백질의 용출
   1. F2 튜브에서 카트리지를 빼고 루어-록 어댑터를 부착하세요.
   2. "B"라고 적힌 주사기에 버퍼 B 2.5mL를 채우고 카트리지에 부착합니다.
   3. 버퍼 B를 천천히 카트리지에 밀어 넣어 결합된 고농도 단백질을 신선한 채집관으로 용출하세요.
      참고: 추가 분석이 필요할 경우 결합 분획을 저장하세요; 그렇지 않으면 적절히 버려야 합니다.
7. 카트리지 재평형
   1. 버퍼 B가 든 주사기를 카트리지에서 꺼내고, 5mL의 버퍼 A가 들어 있는 "A"라고 표시된 주사기를 부착합니다.
   2. 버퍼 A를 천천히 수지 베드를 통과시켜 카트리지를 분당 0.5 mL의 유량으로 다시 평형화합니다.
      참고: 레진 베드나 프릿이 건조되도록 하지 마세요. 보관할 때 프릿 위에 소량의 버퍼를 남겨두세요.
   3. 평형이 맞으면 카트리지는 다음 샘플을 위한 준비가 됩니다.
8. 하류 사용
   1. 저함량 단백질의 최대 회수를 위해 F1과 F2 플로우스루 분획을 결합하세요.
      참고: F1과 F2는 미분 분석이 필요할 경우 별도로 분석할 수도 있습니다. 첨가된 버퍼는 1 mL로, 좋은 회수를 위해 결합된 F1 분획은 ~850 μL 정도일 수 있습니다. 조잡한 혈장, 플로우 스루 및 용출 도데실 황산-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(SDS-PAGE)을 분석하여 플로우 스루에서 상위 14개의 고농도 단백질이 제거되었는지 확인한다. F1, 원플라즈마, 용출물을 통해 12.5 μL의 흐름을 사용해 겔에 적재하여 25 μL 용량의 웰 부피를 만듭니다 (Laemmli 샘플 버퍼: 샘플 비율 2:1)

3. 5 kDa 스핀 농축기를 이용한 단백질 농도

참고: 5 kDa 스핀 농축기를 이용한 샘플 농축은 크기 배제 및 분자 여과 원리에 기반하여 단일 튜브 내에서 목표 생체분자의 빠른 농도와 높은 회수를 달성합니다. 이로 인해 용매와 버퍼 교환 제거 또는 단백질 용액의 탈염을 통해 단백질 농축이 가능합니다.

1. 스핀 농축기에 최대 4mL의 단백질 샘플을 채우세요.
2. 스핀 농축기를 냉장 원심분리기에 넣으세요.
3. 원심분리기 온도는 5,000 g × 10 °C에서 30분간 또는 원하는 부피 감소(예: 30× 농도)가 달성될 때까지 유지합니다.
4. 원심분리기에서 스핀 농축기를 제거하고, 마이크로피펫을 사용해 보존 챔버 바닥에서 농축된 샘플을 회수합니다. 좋은 회수를 위해 총 850 μL 단백질 샘플에서 ~150 μL 농축액이 회수될 것으로 예상합니다.
   참고: 단백질의 완전성과 회수 효율을 유지하기 위해 원심분리 중 막이 건조하지 않도록 주의하세요.

4. 염분 제거 및 완충 교환

1. 농축기 하단 챔버에서 여과액을 버립니다.
2. 원심분리관에 50 mM 중탄산암모늄 버퍼(pH 7.2-7.4)를 같은 부피로 다시 채웁니다. (예를 들어, 유지액이 150 μL이라면 150 μL의 버퍼를 추가합니다)
3. 원심분리기를 다시 5,000 g × 10 °C에서 원심분리하여 원래 농도에 도달할 때까지 유지합니다.
4. 이 버퍼 교환 과정을 세 번 반복하면 염이나 요소와 같은 소분자 오염물질의 약 99%를 제거합니다.
5. 스피드 진공 동열건조기를 사용해 단백질 샘플을 농축합니다.
   참고: 하류 적용에 필요한 탈염 정도에 따라 사이클 수를 조정하세요.

5. 비신코닌산(BCA) 분석법을 이용한 단백질 정량

참고: 샘플의 단백질 농도는 BCA 단백질 분석법을 사용하여 측정되었으며, 표준 소 혈청 알부민(BSA)을 사용했습니다. BCA 분석법은 세제 호환 방식의 비신코닉산 기반 색도 측정법으로, 총 단백질을 검출하고 정량합니다. 이 방법은 알칼리 환경에서 단백질에 의해 Cu²⁺를 Cu⁺로 환원시키는 과정(비우렛 반응)에 의존하며, 이어서 비신코닉산이 포함된 시약을 사용해 구리 이온(Cu⁺)을 고민감도적이고 선택적으로 검출하는 방식입니다. 이 분석법은 하나의 구리 이온과 두 개의 BCA 분자를 킬레이션하여 형성된 보라색 복합체를 생성합니다. BCA 분석은 BSA와 일관되고 선형적인 반응을 제공하여 신뢰할 수 있는 표준 곡선 기준을 보장합니다. 서로 다른 단백질이 BCA 분석에서 서로 다른 반응을 보인다는 것은 알려져 있지만, BSA를 사용하면 다양한 샘플에서 재현 가능한 상대 정량을 제공합니다. 우리의 목표는 모든 종의 절대적 정량화가 아닌 균등한 단백질 부하에 대한 정규화였기 때문에, BSA 기반 보정이 가장 견고하고 재현 가능한 접근법을 제공했습니다.

1. 절차
   1. 각 BSA 표준체(작업 범위 20-2000 μg/mL)를 25 μL과 미지의 단백질 샘플을 96웰 플레이트의 지정된 웰에 추가합니다.
   2. 각 웰에 200 μL BCA 작동 시약을 추가하세요.
   3. 마이크로플레이트 셰이커를 사용해 30초간 충분히 섞으세요.
   4. 플레이트를 덮고 37°C에서 30분간 배양하세요.
   5. 접시를 실온으로 옮기세요.
   6. 마이크로플레이트 리더기를 사용해 562nm에서 흡광도를 측정합니다.
2. 데이터 분석
   1. 모든 샘플과 표준 흡광도값에서 빈 단백질(0 단백질)의 평균 흡광도를 빼세요.
   2. 흡입도와 BSA 농도(마이크로그램/마이크로리터)의 표준 곡선을 그립니다.
   3. 곡선의 회귀 방정식을 이용해 미지의 샘플에서 단백질 농도를 계산하세요.

6. 단백질 농도의 정규화

1. 절차
   1. 적절한 정량 측정 방법을 사용하여 각 혈장 샘플의 단백질 농도를 측정하세요.
   2. 각 샘플의 농도와 총 부피를 기록하세요.
   3. 희석제로 50 mM 암모늄 중탄산염 버퍼(pH 7.8)를 준비합니다.
   4. 필요한 희석량은 C₁V₁ = C₂V₂ 공식 사용으로 계산합니다.
   5. 농도가 1.3 mg/mL이고 부피가 100 μL인 샘플의 경우, 1 mg/mL에 도달하는 데 필요한 최종 부피를 계산합니다: [V₂ = \frac{1.3 \ 곱하기 100}{1} = 130\ \mu L]
   6. 최종 부피에서 초기 부피를 빼서 추가할 버퍼 부피를 계산합니다: 버퍼 부피 = 130 μL − 100 μL = 30 μL.
   7. 100 μL 혈장 샘플에 50 mM 중탄산암모늄(pH 7.8) 30 μL을 추가합니다.
   8. 샘플을 피펫팅이나 짧은 소용돌이 방식으로 부드럽게 섞으세요.
   9. 최종 부피가 130 μL이고 1 mg/mL의 정규화 농도로 확인하세요.
   10. 하류 프로테옴 샘플 준비를 진행하세요.
       참고: BCA 검사 결과를 바탕으로 필요한 희석 인자를 계산하여 정확한 농도 조정을 보장하세요. 각 단계는 검증되며, 데이터는 보조 데이터로 제공됩니다(보충 표 1).

7. 샘플 준비 및 트립틱 소화

1. 단백질 환원
   1. 적절한 환원제(예: 1,4-디티오트레이톨 [DTT])를 탄산암모늄 버퍼 내 단백질 용액에 최종 농도 100 mM까지 첨가합니다.
   2. 혼합물을 60°C에서 30분간 열믹서나 가열 블록에서 배양하세요.
      주의: DTT는 자극 물질이므로 연기 후드 안에서는 장갑을 끼고 다뤄야 합니다.
      참고: 소화에 사용되는 트립신에 대한 추가 정보는 재료표에 제공되어 있습니다. 간단히 말해, 시퀀싱 등급의 Tosyl Phenylalanyl Chloromethyl Ketone(TPCK) 처리된 트립신(키모트립틱 활성 제거)을 사용하여 라이신과 아르기닌 잔기의 절단에 대한 높은 특이성을 보장하였습니다. 효소 활성은 제조사 규격에 따라 검증되었으며, 단백질 1mg당 약 1단위의 N-벤조일-L-아르기닌 에틸 에스터(BAEE) 활성에 해당합니다. DTT 및 아이오도스 아세트아마이드(IAA) 농도와는 100 mM DTT와 200 mM IAA가 최종 반응 농도가 아닌 정액 용액을 의미한다는 것을 확인했습니다. 환원 및 알킬화 과정의 최종 작동 농도는 표준 범위 내에 있었으며(일반적으로 5-10 mM DTT와 10-20 mM IAA) 범위 내에 있었습니다.
2. 시스테인 잔기의 알킬화
   1. 환각 후 시료를 실온에서 5분간 식히세요.
   2. 튜브 바닥에 응축수를 모으기 위해 잠시 원심분리기를 사용했습니다.
   3. 50 mM 중탄산암모늄(ABC) 완충제에 200 mM IAA를 첨가하여 환원된 시스테인 잔기를 알킬화합니다.
   4. IAA 분해를 방지하기 위해 샘플을 실온에서 어두운 곳에서 30분간 배양하세요.
      참고: 요오도아세트아마이드는 빛에 민감하며 잠재적으로 독성이 있습니다; 노출을 피하고 어두운 빛에서 다루세요.
3. 효소 소화
   1. 사용 직전에 50 mM ABC 버퍼에서 시퀀싱 등급의 변형 트립신을 준비하세요.
   2. 각 샘플에 트립신을 1:25(w/w) 비율로 첨가합니다.
   3. 반응을 37°C에서 17시간 배양하여 완전한 효소 소화를 가능하게 합니다.
      참고: 소화 시간이 길어지면 과소화가 발생할 수 있습니다; 부화 기간 내내 온도 안정성을 보장하세요.
4. 반응 억제
   1. 각 샘플에 개미산을 첨가하여 최종 농도인 1.0%(v/v)를 달성하여 효소 반응을 멈춥니다.
   2. 37°C에서 20분간 배큐하여 잔류 트립신을 변성시키고 펩타이드 혼합물을 안정화합니다.
      주의: 개미산은 부식성이 있습니다; 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하고 화학 훈기 후드에서 작업하세요.
5. 펩타이드 회수
   1. 소화된 펩타이드 혼합물을 3500g에서 실온에서 12분간 원 심분리하여 불용성 물질을 제거합니다.
   2. 소화된 펩타이드가 포함된 투명한 상청액을 펠릿을 방해하지 않고 자동 샘플러 바이알에 조심스럽게 옮기세요.
   3. 펩타이드 용액은 추가 LC-MS/MS 분석이 진행될 때까지 -20°C에 보관합니다.
6. LC-MS 분석을 위한 준비
   1. 펩타이드 샘플을 이온 이동성이 장착된 LC-MS 시스템에 직접 적재하여 펩타이드 분리 및 분석을 수행합니다.
   2. 증발과 오염을 방지하기 위해 모든 바이알이 적절히 밀봉되었는지 확인하세요.

8. LC MS-MS 분석

1. 펩타이드 로드 및 탈염
   1. 부분 루프 주입 모드에서 펩타이드 샘플 1 μg을 샘플 루프에 적재합니다.
   2. C18 트랩 컬럼을 이용해 0.1% 개미산이 함유된 수용 용매로 15 μL/min 유량으로 1분간 세척하여 탈염 펩타이드를 제거합니다.
      참고: 런 내내 0.1% 개산이 용매 A로, 아세토니트릴과 0.1% 개양산이 포함된 용매 B를 사용하세요.
2. 펩타이드 분리
   1. 트랩 컬럼을 분석용 역상 C18 컬럼과 인라인으로 연결합니다.
   2. 3%에서 40% 용매 B의 선형 구배를 사용하여 55분 동안 300 nL/분의 유량으로 용매 펩타이드를 용출합니다.
   3. 80% 용매 B로 7.5분간 컬럼을 헹구어 남은 성분을 제거합니다.
   4. 다음 주입 전에 3% 용매 B로 컬럼을 다시 평형화하세요.
   5. 작동 중에는 컬럼 오븐을 35°C, 오토샘플러를 4°C로 유지하세요.
      참고: 이월을 최소화하기 위해 샘플 사이에 빈 주입을 포함하세요.
3. 질량분석법 획득 설정
   1. 용출 펩타이드의 질량 스펙트럼 분석
      1. UPLC 시스템을 설정하고 고화질 MS에 직접 연결하세요.
      2. MS 소프트웨어를 사용해 시스템을 제어하세요.
      3. 질량분석기가 하이브리드 쿼드러폴-이온 이동도-직교 가속-비행 시간(oa-TOF) 기기로 구성되었는지 확인하세요.
      4. 작동을 시작하기 전에 모든 질소 및 잠금-분무기 가스 연결부가 안전하게 누수가 없는지 확인하세요.
         주의: 고전압 연결 및 가압 가스는 실험실 안전 기준을 준수하여 다루십시오.
   2. 이온화 설정
      1. 이중 전기분무원 이온원을 사용하여 양성 전기분무 이온화(ESI) 모드로 질량 분석기를 작동시킵니다.
      2. 나노-ESI 모세관 전압을 3.4 kV로 설정하세요.
      3. 샘플 콘 전압을 40 V로, 추출 콘 전압을 4 V로 조절합니다.
      4. 이온 이동도 분광법(IMS) 질소 가스 흐름을 90 mL/min로 설정하세요.
      5. 분사 안정성을 점검하고 이온 전류가 일정한지 확인한 후 진행하세요.
   3. 이온 이동성 분리
      1. 이온 전송 시 IMS 이온 가이드 펄스 높이를 40V로 설정하세요.
      2. IMS 이온 가이드 속도를 800 m/s로 조정하세요.
      3. 이동파 높이를 IMS 사이클 전체 동안 8V에서 20V로 선형적으로 증가시켜 이동도를 통한 최적의 이온 분리를 달성합니다.
         주의: IMS 가스 흐름을 안정적으로 유지하세요; 변동은 이온 분리와 드리프트 시간 재현성에 영향을 줄 수 있습니다.
   4. 잠금질량 교정
      1. 2 μg/μL 요오화나트륨(NaI) 용액을 사용하여 비행 시간(TOF) 분석기를 보정합니다.
      2. 보정 범위를 50 m/z에서 2000 m/z 사이의 이온을 감지하도록 설정하세요.
      3. 실시간 질량 보정을 위해 듀얼 전기분무원 채널을 사용해 45초마다 잠금 질량 기준 스펙트럼을 획득합니다.
      4. 데이터 수집에 들어가기 전에 보정 곡선이 ± ppm 내에서 질량 정확도를 달성하는지 확인하세요.
4. 데이터 수집
   1. 연속체 모드에서 데이터를 획득하며, 두 가지 기능을 번갈아 가며 수행합니다:
      1. 기능 1 (저에너지 MS): 저에너지 전구체 이온 스펙트럼을 기록합니다.
      2. 기능 2 (고에너지 HDMSE): 이온 이동성 분리와 함께 충돌 에너지가 높아진 파편 이온 스펙트럼을 기록합니다.
   2. 함수 2에서 트랩 영역의 충돌 에너지를 4 eV로 설정하세요.
   3. 전이 영역의 충돌 에너지를 20 eV에서 45 eV로 증폭하여 제어된 펩타이드 분편화를 달성합니다.
   4. 각 함수별 스펙트럼 획득 시간을 0.9초, 인터스캔 지연을 0.024초로 설정하세요.
   5. 전체 이온 크로마토그램(TIC)을 모니터링하여 작동 내내 기기의 일관된 반응을 확인하세요.
   6. 원시 데이터를 프로테오믹스 분석 소프트웨어(예: Progenesis QI 또는 동등한 소프트웨어)로 가져오세요.
   7. 기본 정렬 참조 또는 수동으로 선택한 참조 실행을 사용하여 크로마토그램을 연속 정렬하세요.
   8. 큐레이션된 데이터베이스(예: UniProt Human - 검토된 항목만 포함)를 사용하여 펩타이드와 단백질을 식별합니다.
   9. 다음 검색 조건을 설정하세요:
      효소: 트립신
      고정 변형: 카바미도밀화 (C)
      가변 변형: 산화 (M)
      펩타이드 내성: 기기 결의에 따라
      허용되는 절벽골: 1
      허위 증거개시율(FDR): ≤ 1%
   10. 정규화 방법을 사용하여 모든 단백질로 정규화 를 수행합니다.
   11. 필터링 임계값을 적용하세요: 단백질당 ≥2개의 펩타이드, ≥개의 고유한 펩타이드, 접힘 변화 ≥1.5, 그리고 조정된 p값 <0.05.
       참고: 이 지침은 일반적인 실험실 안전 지침이며, 항상 기관의 EHS(환경보건안전) 규정과 지역 법적 요건을 준수해야 합니다.
5. 품질 관리
   1. NaI 표준을 사용하여 질량 정확도를 확인하기 위해 실행 전후 교정 검사를 수행합니다.
   2. 분석 내내 잠금 질량 기준이 안정적으로 유지되도록 하세요.
   3. 복제 주입을 평가하여 보존 시간, 드리프트 시간, 스펙트럼 강도의 재현성을 확인합니다.
      주의: 요오화나트륨은 자극 물질입니다. 다룰 때는 장갑을 착용하고 흡입이나 피부 접촉을 피하세요.
      참고: 폐기물 처리 지침은 보충 파일 1 을 참조하십시오. 혈장 샘플을 다룰 때는 단백질 분해를 방지하기 위해 항상 추운 환경이나 얼음 위에서 작업하세요. 생물학적 샘플과 완충제를 다룰 때는 니트릴 장갑, 실험복, 안구 보호구를 착용하세요. 4°C로 미리 냉각된 냉장 원심분리기를 사용하여 원심분리 과정을 수행합니다. 사용되는 모든 원심분리기 튜브와 주사기는 멸균되어 있고 교차 오염을 방지하기 위해 적절히 라벨이 붙어 있는지 확인하세요. 완충제를 준비할 때는 항상 프로테오믹 등급의 물을 사용하세요.

결과

혈장 샘플은 스핀 카트리지를 사용해 알부민, IgG, IgA, 트랜스페린, 하프토글로빈, 항트립신, 피브리노겐, 알파2-크로글로불린, 알파1산 당단백질, IgM, 아포지단백질 AI, 아포지단백질 AII, 보체 C3, 트랜스티레틴 등 14가지 고농도 단백질을 선택적으로 제거했습니다. 이 고갈 단계는 하위 프로테오믹 분석에서 저함량 바이오마커 검출을 향상시키는 데 매우 중요했습니다. 각 혈장 샘플(8-10 μL)은 희석되어 0.22 μm 스핀 여과를 통해 정액화된 후, 통제된 원심분리 조건 하에 친화력 카트리지를 통과시켰습니다. 저농도 단백질 풍부 혈장을 나타내는 흐름 통과 분획(F1과 F2)이 모여 추가 처리를 진행했습니다. 풀린 플로우 스루 샘플은 50 mM 암모늄 중탄산염(pH 7.2-7.4)과의 호환성을 보장하기 위해 5 kDa 스핀 농축기를 사용하여 완충 교환/탈염을 거쳤습니다. 이 과정을 세 차례 반복하여 전도도 측정으로 99% 이상의 간섭 염분과 소분자를 제거...

토론

생물학적 매트릭스로서 플라즈마의 본질적 복잡성은 단백질체 분석에 큰 도전 과제를 제시합니다. 단백질 농도의 엄청난 동적 범위와 몇몇 고함유수 종의 우세함은 임상적으로 중요한 저함유 단백질의 검출을 가릴 수 있습니다. 이번 연구에서는 중간 및 저 풍부도 단백질을 선택적으로 농축하고 샘플 간 분석 일관성을 유지하도록 설계된 다단계 표준화된 샘플 준비 파이프라인을 사용하여 이러한 단점을 완화했습니다. 혈장 단백질체학 워크플로우의 각 단계는 기술적 잡음을 관리하고, 민감도를 높이며, 전신 염증성 및 기타 임상적으로 중요한 질병의 프로테오믹 범위를 강화하도록 최적화되었습니다.

면역 고갈은 파이프라인의 첫 단계로, 가장 풍부한 14개의 혈장 단백질을 효과적으로 고갈시킵니다. 고갈의 효능은 비교 SDS-PAGE 분석을 통해 검증되었으며, 전체 단백질 농도가 현저히 감소하고 플로우스루 분획에서 강한 띠가 제거되어 알부민, 면역글로불린...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
5 kDa 분자량 차단 스핀 농축기	애질런트 테크놀로지스	5185 이하; 5991	완충 교환과 염분 제거에 사용되며; 5 kDa 이상의 단백질을 보유함
탄산암모늄(ABC)	시그마 올드리치	카탈로그 번호: T6567	트립틱 소화에 사용
버퍼 A 에퀴/로드/세척 및 nbsp;	애질런트 테크놀로지스	5185-5987
버퍼 B 용출	애질런트 테크놀로지스	5185-5988
냉각 원심분리기	CPR-30 플러스 냉장 원심분리기	해당 없음	저온에서 단백질 샘플을 원심분리하는 데 사용됩니다
DTT	시그마 올드리치	그리고 nbsp; CASNo: 3483-12-3	트립틱 소화에 사용
전기영동 장치	바이오 래드	1658004	SDS 페이지에 사용
IAA	시그마 올드리치	CAS 번호: 144-48-9	트립틱 소화에 사용
IMS T-Wave	수역	https://www.waters.com/content/dam/waters/en/library/white-papers/2012/water-whitepapers-Triwav<브레/> eMoreMi xturesandMolecules-720004176.pdf 완전 캐릭터 묘사	이온 이동성 분리(IMS)
인피니트 M 플렉스 멀티 모드 리더	테칸		멀티플레이트 리더
LC-MS 시스템	수역	https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/liquid-chromatography-ms-systems.html
MassLynx 4.1 SCN781 소프트웨어	수역	https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/informatics-and-software/mass-spectrometry-software/masslynx-mass-spectrometry-software.html	질량분석법 소프트웨어
다중 친화력 제거 스핀 카트리지 휴먼 14 (MARS Hu-14)	애질런트 테크놀로지스	5188 이하; 6560	알부민, IgG, IgA, 트랜스페린 등 14개의 고농도 혈장 단백질을 고갈시키는 데 사용되었습니다.
나노액퀴티 UPLC 시스템	수역	https://www.waters.com/nextgen/en/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-m-class-system.html
나노락스프레이	수역	https://www.waters.com/nextgen/us/en/services/instrument-services/instrument-upgrades/mass-spectrometry-ms-upgrades/nanolockspray-exact-mass-ionization-source-upgrade.html
오페론 FDU-7003	오페론	http://www.operon.co.kr/en/pro2-FDU.html	스피드 진공 동염기
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총 회복 바이알	수역	https://www.waters.com/nextgen/us/en/shop/vials-containers--collection-plates/186004631-clear-glass-12-x-32-mm-screw-neck-total-recovery-vial-preassembl.html
트립신	시그마 올드리치	그리고 nbsp; 카탈로그 번호: T6567	트립틱 소화에 사용