방법 논문

다중 체학 차세대 시퀀싱 데이터에서 개체 간 오염 및 불일치 탐지

DOI:

10.3791/69428

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2026년 4월 17일

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1Genentech Research and Early Development, 2Rancho Biosciences, LLC, 3Roche Poland Sp. z o.o., 4Roche Pharma Research and Early Development, Data and Analytics, Roche Innovation Center Basel, F. Hoffmann-La Roche Ltd, 5Roche Pharma Research and Early Development, Genetics and Genomics, Roche Innovation Center Basel, F. Hoffmann-La Roche Ltd, 6Roche Pharma Research and Early Development, Genetics and Genomics, Roche Innovation Centre Welwyn, F. Hoffmann-La Roche Ltd, 7Computational Sciences Center of Excellence, Roche Diagnostics GmbH, 8Roche Pharma Research and Early Development, Early Development Oncology, Roche Innovation Center Zurich, F. Hoffmann-La Roche Ltd

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 개인 내 샘플 쌍의 유전적 동일성을 검증하여 차세대 시퀀싱 데이터에서 개인 간 오염과 불일치를 감지하기 위한 품질 관리 프레임워크를 구현하는 것을 설명합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

차세대 시퀀싱을 통한 환자 생체 샘플의 고처리량 처리와 분자 데이터와 환자 수준 및 샘플 수준 임상 데이터 비교는 생물 표본 관리 체인 전반에 걸쳐 샘플 식별자를 정밀하게 추적하고 매칭해야 하며, 이는 생물 표지 시험 결과의 견고한 해석을 가능하게 하는 데 매우 중요합니다. 샘플과 데이터 처리 워크플로우의 개별 단계를 추적하는 것 외에도, 생물정보학 솔루션을 통해 샘플이 동일한 환자로부터 유래했음을 확인할 수 있습니다. 여기서는 동일한 개체에서 유래한 일치 샘플을 식별하기 위한 생물정보학 워크플로우를 활용한 과정을 소개합니다. 분석 워크플로우는 환자 샘플 출처를 비교하고 검증할 두 쌍 이상의 NGS 데이터셋에 적합합니다. 유전체 샘플 비교를 기반으로 한 점수 알고리즘을 통해 사용자는 두 샘플이 동일 개체로부터 유래하는지 여부를 판단할 수 있습니다. 특히, 선택된 연관 비평형 블록 내 단일 염기다형성(SNP)을 사용하여 샘플을 식별하고 비교합니다. 일치 및 불일치 샘플의 허용적이고 엄격한 선택에 대한 임계값 조합이 확인되었습니다. 이 프로토콜의 유용성은 2,000명 이상의 환자에서 수집된 다양한 체학적 기법을 포함하는 임상 종양 조직 및 혈액 샘플의 품질 관리 및 검증에 적용됨을 통해 입증되었습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

임상 샘플의 대규모 수집 및 분석은 동일 또는 다른 모달리티의 분자 데이터와 임상 환자 및 샘플 수준의 데이터를 올바르게 일치시키는 것이 정확한 해석과 정보에 기반한 의사결정을 위해 필수적이기 때문에, 샘플의 보관 체인을 따라 정확한 추적이 필요합니다. 우수한 임상 실천 하에서 샘플 처리 프로토콜을 간소화하려는 엄격한 노력에도 불구하고, 샘플 교환이나 잘못된 라벨링은 생검/샘플 추출부터 준비 및 처리 단계, 데이터 분석 단계에 이르기까지 다양한 단계에서 발생할 수 있습니다(그림 1). 샘플 수와 처리 단계가 증가할수록 샘플 교환과 교차 오염 가능성이 증가합니다. 이로 인해 샘플-환자 관계가 잘못된 데이터를 분석할 수 있어 후속 분석과 결론에 영향을 미칠 수 있으므로 임상 유전체학 연구에서 중요한 고려 사항입니다. 임상 연구에서 샘플의 잘못된 식별은 특히 표본 크기가 적은 연구에서 전체 결과에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 개인 간 오염은 차이 식별에 대한 검정력 저하와 동일한 환자의 여러 샘플을 비교할 때 오탐성 결과를 초래할 수 있습니다. 샘플 교환은 유전적 연관성 탐지력에 영향을 미치며, 유전체 전체 연관 분석에서 복잡한 형질의 유전성을 과소평가할 수 있습니다2.

암 연구는 대규모 게놈 및 전사체 분석이 이루어지는 분야 중 하나로, 특히 유전체 및 표현형의 환자 간 및 인내 이질성을 모니터링합니다. 암 연구의 한 측면은 동일한 환자의 샘플이 서로 다른 돌연변이와 복제수 변형을 가지고 있어 독립적인 변이 대립유전자 빈도를 나타낼 수 있다는 점입니다. 특히 여러 오믹스 유형의 데이터를 해석할 때는 동일한 개인의 다중 모달 데이터셋을 올바르게 통합하는 것이 중요하며, 따라서 개인 간 오염 모니터링이 필요합니다 5,6,7,8. 암 게놈 아틀라스 프로그램(TCGA)과 폐 유전체 연구 컨소시엄(LGRC)의 데이터셋에 대한 연구들은 샘플 오식별률이 평균 3%, 일부 연구(2,9,10,11)에서는 최대 ~20%에 달하는 것으로 확인되었습니다. 이러한 사례들은 샘플 교환과 교차 오염 발생 모니터링의 중요성을 보여줍니다. 모든 공정 단계에서 일상적인 모니터링과 품질 관리를 넘어, 시퀀싱 결과의 비교 분석은 최종 품질 점검 역할을 합니다. 이는 데이터 분석 및 해석으로 넘어가기 전에 정확한 샘플 매칭을 보장합니다.

샘플이 동일한 개체에서 유래하는지 확인하기 위해 여러 생물정보학 접근법이 확립되었습니다 1,4,13,14,15,16. 초기 접근법은 짧은 탠덤 반복 반응을 활용해 표본 동일성을 검증했습니다17. 차세대 RNA 및 DNA 시퀀싱 데이터는 이제 단일 염기체 다형성을 기반으로 한 샘플 쌍 간 비교를 가능하게 합니다18. 이들은 RNA 시퀀싱19 또는 전체 엑솜 시퀀싱 데이터5에 대한 적용 가능성, 시퀀싱 레인20 간 검사 등 구현 방식, 사용 편의성 등에서 차이가 있습니다. 동일 개체의 샘플은 20–45개의 단일 염기 다형성을 기반으로 식별할 수 있지만, 암 연구에서 일반적으로 사용되는 저중등 범위 시퀀싱 접근법은 많은 수의 SNP를 통합해야 합니다1.

여기서는 매칭된 샘플의 품질 관리를 위해 사용되는SNPs 15의 연관 비평형 블록을 이용한 이러한 접근법의 구현 및 조정을 설명합니다. 이 접근법은 낮은 거짓 플래그 발생률과 잘못된 일치율을 가진 것으로 나타났으며, 워크플로우는 전체 엑솜 시퀀싱과 RNA 시퀀싱 샘플 간 비교뿐만 아니라 다양한 데이터 형식에서의 비교도 가능하다. 임상시험 샘플 내 데이터셋 전반에 걸쳐 이 방법의 대규모 적용을 위해, 생물정보학 파이프라인은 공통 워크플로우 언어(CWL)21,22로 구현되었습니다. 가독성과 YAML과 유사한 문법 덕분에 프로그래밍 경험이 부족한 과학자들도 워크플로우와 분석 결과의 일반적인 구조를 쉽게 해석할 수 있습니다. CWL의 또 다른 핵심 기능은 산란/수집 기능으로, 할당된 계산 자원을 완전히 활용할 수 있도록 프로세스의 병렬화를 가능하게 합니다. 사용자는 특정 단계가 실행되는 조건을 지정할 수 있어 결과 분석의 유연성을 높일 수 있습니다. CWL은 데이터베이스 저장소, 그래픽 사용자 인터페이스, 작업 디스패처와 같은 완전한 워크플로우 관리 시스템의 다른 구성 요소와 통합될 수 있어, 재현 가능한 과학적 분석 세트를 생성, 실행 및 유지할 수 있는 강력한 플랫폼을 형성합니다. 따라서 이 구현은 정의된 워크플로우 관리 시스템 내에서 워크플로우에 대한 접근과 고처리량 데이터셋 처리를 가능하게 합니다.

더 나아가, 일치 표본과 비일치 표본 간 선택 매개변수 임계값 조정의 효과를 조사하고, 불일치 사례에 대해 허용적이고 엄격한 선별에 대한 임계값을 결정하였습니다. 이러한 매개변수를 수정함으로써 표본 쌍 선택에 미치는 영향과 다양한 오믹스 모달리티 내에서 그리고 그 적용 가능성이 제시되었습니다. 이 매개변수들을 효과적으로 미세 조정하면 사용자가 해석의 엄격성을 조정할 수 있습니다. 이 워크플로우는 수천 개의 샘플을 가진 대규모 임상 데이터셋에 적용되었습니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

윤리 진술: 이 교차 개인 오염 분석은 Roche의 책임 있는 데이터 재사용 절차와 각 연구의 마스터 인포드 동의서를 준수하여, 완료된 1상 및 2상 임상 연구의 개별 환자 수준 데이터를 사용하여 후향적으로 수행되었습니다. 각 연구는 수행 전에 윤리 위원회/기관심사위원회(Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다. 참가자들은 이 연구에 참여하기 위한 사전 동의서를 제출하고 서명했습니다.

생물정보학 워크플로우
참고: 생물정보학 워크플로우 구현은 차세대 시퀀싱 데이터(예: 전체 유전체, 전체 엑솜, 전사체 시퀀싱)에서 파생된 원시 fastq 파일에서 시작합니다. 여기서 설명된 개별 단계들은 CWL 워크플로우에 통합되어 있습니다.

1. 필요한 참고 자료

  1. 생물정보학 워크플로우를 위해 다음 사항을 제공하세요:
    1. 인간 참조 게놈(GRCh38)은 . Fasta 포맷.
    2. 해당 인덱싱 파일은 .fasta.fai로 설정되어 있습니다.
    3. . dict 형식의 해당 사전.
    4. SNP와 연결 불균형 블록(예: Picard build_fingerprint_maps, SCR_006525)에 대해 관심 있는 유전체 영역을 일치하는 하플로타입 지도입니다.
  2. 하플로타입 맵의 헤더가 참조 게놈과 일치하는지 확인하세요.

2. 참조 게놈에 대한 정렬, 정렬 및 색인

  1. CWL 워크플로우를 실행하여 아래에 설명하는 단계( 재료표의 도구 목록) 출력을 제공합니다(그림 2).
  2. fastq 파일이나 정렬된 bam 파일 디렉터리를 제공하여 CWL 워크플로우를 시작하세요.
  3. 예를 들어 R1/R2 같은 패턴을 CWL 명령어에서 입력 정규식으로 제공합니다.
  4. 또한, 워크플로우가 실행될 위치, 유전체 참조, 하플로타입 매핑 파일도 제공하세요.
    참고: 전부 비교를 위해서는 전체 입력 디렉터리를 사용합니다. 일부 파일을 비교할 경우, 비교를 위해 쉼표로 구분된 파일 이름을 제공하세요. 고급 옵션은 임의 접근 메모리와 프로세스를 실행할 중앙 처리 장치의 수를 선택할 수 있게 합니다.
  5. mapping 알고리즘을 사용해 fastq 파일을 인간 참조 게놈에 매핑합니다.
    참고: 염기서열 분석 방식에 따라 BWA-MEM은 DNA 시퀀싱 결과23에 사용되며, 스플라이스 인식 매퍼 STAR는 RNA 시퀀싱 결과24에 사용됩니다. STAR 정렬의 예시 코드는 아래에 제공됩니다:
    스타 \
    --readFilesCommand zcat \
    --runThreadN 8 \
    --아웃 SAMmapq고유 60 \
    --아웃SAM속성 모두 \
    --out읽기Unmapped Fastx \
    --아웃TmpDir /tmp/STARtmp/ \
    --runDirPerm All_RWX \
    --아웃SAM타입 BAM 정렬 미 \
    --outFileNamePrefix /FILENAME_ \
    --아웃 SAMattrRGline ID:FILEID. L001 SM:샘플 \
    --genomeDir /REF/GENOME/DIR \
    --readFilesIn /path/to/FILENAME. R1.fastq.gz /path/to/FILENAME. R2.fastq.gz
  6. 생성된 정렬된 이진 정렬 행렬(BAM) 파일을 SAMtools 정렬 정렬(samtools sort -o FILENAME_OUT.bam FILENAME_IN.bam)을 사용하여 읽기 좌표로 정렬합니다.
  7. SAMtools 인덱스(samtools index FILENAME_OUT.bam)를 사용하여 정렬된 BAM 파일을 인덱싱합니다.
  8. Picard MarkDuplicates를 사용하여 중복 항목을 표시하고 제거하세요.
  9. SAMtools를 사용하여 BAM 파일을 재인덱싱하고 읽기 그룹(RG)을 포함합니다.
    참고: BAM 파일은 워크플로우가 제대로 작동하려면 RG 태그가 있어야 합니다.

3. 지문 추출

  1. Picard ExtractFingerprints를 사용하여 정렬되고 인덱싱된 BAM 파일을 사용하여 SNP 지문을 식별할 수 있습니다.
  2. 샘플 간 비교를 위해 생성된 변형 호출 형식(VCF) 파일을 중간 저장 상태로 사용합니다.

4. 유사도 점수 계산

  1. Picard CrossCheckFingerprints를 사용하여 연관 불균형 블록을 기반으로 로그 오즈비 점수(LOD)를 계산하며, 이는 crosscheck_metrics 파일 형식으로 crosscheck_metrics.txt 제공됩니다.
    참고: 워크플로우 구현은 미리 정의된 리스트에서 샘플 쌍의 모든 가능한 조합을 교차 비교하거나 샘플 간 선택된 비교를 가능하게 합니다.
  2. 중간 VCF 파일을 삭제하세요.
  3. crosscheck_metrics 파일은 검사된 샘플 쌍마다 네 가지 비교를 제공합니다. LOD 점수의 해석은 다음과 같습니다:
    LOD 점수 > 0: 샘플이 동일 개인으로부터 유래할 가능성 (샘플 일치)
    LOD 점수 ≤ 0: 샘플은 서로 다른 개인으로부터 유래할 가능성이 높습니다
  4. 샘플 일치의 컷오프 값을 검증하려면 LOD 점수 분포를 히스토그램(예: R이나 Python)으로 시각화하여 검증합니다(그림 3).
  5. 경험 많은 생물정보학 전문가가 포함된 협력 팀이 샘플 정체성을 명확히 식별하고, 예를 들어 세 가지 LOD 점수를 모두 포함하거나 서로 다른 개인에서 유래한 것으로 알려진 샘플의 LOD 점수 분포와 비교하는 등 사용된 임계값을 조정할 수 있는 증거가 충분한지 판단하는 것이 제안됩니다.
    참고: 샘플 혼동은 여러 번의 예상치 못한 일치(동일 기증자 샘플의 경우 LOD 점수 < 0)와 불일치(서로 다른 기증자의 샘플 > LOD 점수 0)를 초래할 수 있습니다. 복잡한 해석은 교차 기능 팀과 생물정보학 전문가 간의 긴밀한 교류가 필요합니다.

5. 코드 가용성

계산 워크플로우는 Github에 공개될 예정입니다: https://github.com/Roche/sample-matching-workflow.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CWL 워크플로우 구현
샘플 일치 식별을 위한 워크플로우가 구현되었으며, 이는 단일 염기체 다형성의 연관 비평형 블록을 이용한 기존 접근법을 기반으로 하며,15. 저자들은 이 방법에 대해 0% FMR, 0.01% FFR의 분류율을 보여주었습니다. 다른 접근법과의 비교 결과, 높은 및 중간 범위에서 NGSCheckmate와 유사한 성능이 나타났고, 낮은 범위와 최소한의 지역 유전체 겹침에서 NGSCheckmate보다 성능이 향상되었습니다. Conpair와 BAMixChecker13, 15, 25와 비교했을 때 결정적인 결과는 나오지 않았습니다. 여기서 워크플로우는 CWL에 구현되었고, LOD 임계값이 조사 및 최적화되었으며, RNA 시퀀싱 쌍과 DNA 시퀀싱 쌍 또는 조직에서 추출된 샘플 내, 조직과 말초혈액 샘플 간의 모달리티 간 비교에 적용되었습니다(그림 3, 표 1). 워크플로우 구현은 미리 정의된 목록에서 샘플 쌍의 모든 가능한 조합을 교차 비교하거나 샘플 간 선택된 비교를 가능하게 했습니다.

워크플로우 입력은 선택된 하플로타입 집합을 사용합니다. 이들은 연관 비평형 블록에서 단일 염기체 다형성을 계산하는 데 사용됩니다. 샘플 쌍에 걸쳐 이 SNP 블록들의 로그-오즈비(LOD) 점수를 계산하면 일치한 샘플과 미매칭 샘플을 구분할 수 있습니다. 이전에는 LOD < -5와 LOD > 5 범위의 LOD 점수가 일치하는 표본쌍을 올바르게 분류하는 것으로 나타났습니다. 추가적인 LOD 점수(LOD_SCORE_TUMOR_NORMAL, LOD_SCORE_NORMAL_TUMOR)는 두 샘플 중 하나에서 종양 샘플에서 이형접합 손실 가능성을 고려하여 계산됩니다(한 샘플의 이형접합 영역이 다른 샘플에서는 동형접합으로 검출됨).

입력 매개변수와 임계값이 일치/불일치율에 미치는 영향
이 워크플로우에 대한 평가는 성능과 정확성에 영향을 미치는 세 가지 중요한 측면을 강조했습니다. 첫째, 하플로타입 지도가 다루는 유전체 영역의 선택이 중요한 단계임이 입증되었습니다. 이 영역들의 선택은 매칭 과정의 구별력에 직접적인 영향을 미칩니다. 둘째, 리드 정렬 전략과 지문 추출에 사용된 특정 하플로타입 맵의 조합이 최종 분석 결과에 큰 영향을 미쳤습니다. 이러한 상류 처리 단계의 변동은 미묘한 편향을 초래하여 매칭 점수로 전파될 수 있습니다(그림 4A–B). 셋째, 표본 일치를 결정하기 위한 신중한 평가와 임계값 선택이 필수적이었습니다. 최적 임계값은 특정 데이터 방식(예: 전체 엑솜 시퀀싱 대 전체 전사체 시퀀싱)과 평가하는 유전체 영역에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 서로 다른 임계값이 접근법의 엄격도를 조절할 수 있습니다(높은 위양성율 vs 높은 위음성률)(그림 4C). 이를 해결하기 위해, 이 방법은 사용한 LOD 점수와 비교 대상의 조합을 기반으로 허용적이고 엄격한 샘플 매칭 점수 조합을 모두 정의하도록 조정되었습니다. 첫 번째 임계값 접근법(I)은 세 가지 LOD 점수(LOD_SCORE, LOD_SCORE_TUMOR_NORMAL, LOD_SCORE_NORMAL_TUMOR)에 걸쳐 양의 값을 고려하여 달성되었습니다. TUMOR_NORMAL 및 NORMAL_TUMOR 점수 정보를 포함함으로써, 암 샘플의 복제수 변화로 인한 이형접합성 손실 효과를 완화할 수 있습니다. 반대로, 불일치에 대한 더 엄격한 기준(II)은 거짓 양성을 줄이기 위해 두 가지 대체 필터링 기준을 적용하여 구현되었습니다: (a) 양성일 LOD_SCORE때만 매칭으로 분류, b) 특정 샘플에 대해 LOD_SCORE가 해당 샘플의 다른 쌍별 LOD_SCOREs의 최대 점수보다 높을 때(기록된 원산 환자 기준) LOD_SCORE 자체가 음성이라 해도 말이죠.

이 애플리케이션에서는 허용 임계값을 생성하기 위해 위 기준(I, IIa, IIb) 중 하나에 따라 매칭으로 지정된 표본 쌍을 매칭으로 간주했습니다. 이로 인해 모든 확인된 불일치에 대한 높은 신뢰도를 제공했으나, 일부 잠재적 진짜 불일치는 일치(즉, 거짓 음성)로 지정되는 것을 희생했습니다. 허용 임계값과 더 엄격한 임계값을 비교한 결과, 불일치로 분류되는 쌍의 비율이 변동하는 것이 나타났다. 분석된 모든 연구에서 접근법 간 차이는 3.9%(세 가지 LOD 점수 중 어느 하나 양성(I)), 13.3%(LOD_SCORE 양성이어야 함(IIa)), 9.2%(비일치 쌍(IIb)와 비교해 LOD_SCORE), 3.6%(위 중 하나라도 고려하여 일치를 결정)였습니다(그림 4C).

유전체 영역 범위의 영향
일치 및 불일치 샘플의 음성과 양의 LOD 점수 차이는 전체 유전체 시퀀싱(WGS) 또는 WGS 샘플을 다른 방식과 비교하는 등 광범위한 유전체 영역을 다룰 때 가장 커져 임계값 선택이 용이해집니다(그림 5A). 전체 엑솜 시퀀싱과 RNA 시퀀싱 비교에서는 LOD 점수가 0에 가깝게 떨어지며, 임계값 접근법이 결과에 영향을 미치므로, 게놈 커버리지가 낮은 모달리티에 대한 임계값의 엄격성 평가가 중요함을 강조합니다. 양성 LOD 점수를 가진 알려진 쌍 샘플의 결과 분포는 그림 5B에 표시되어 있습니다. Javed 등(2020)은 연관 비평형 블록15를 사용할 때 0.02%의 유전체 중복률이 매칭된 샘플과 매칭되지 않은 샘플을 구분하기에 충분함을 보여주었습니다.

검증
이 접근법은 동일한 개인에서 유래할 것으로 예상되는 유방암, 대장암, 폐암 전엑솜 시퀀싱(WES) 및 RNA 시퀀싱 데이터셋에서 검증되었습니다(그림 6A). 동일 개체의 샘플 쌍은 100% 일치율을 보였으며(그림 6B), 다른 개체에서 유래한 것으로 알려진 다른 샘플과의 추가 비교에서는 100% 불일치율이 나타났습니다. 이 데이터셋들 중 어느 곳에서도 위양성이나 위음성은 관찰되지 않았습니다.

요약하자면, 품질 관리 워크플로우를 구현하면 표준화되고 재현 가능한 접근법을 제공하여 차세대 시퀀싱 샘플 쌍의 개인 간 비교를 용이하게 합니다. 결과적으로 생성된 LOD 점수 임계값은 유전체 영역 중복이 큰 샘플에서 낮은 위양성 및 거짓 음성률을 제공하며, 시퀀싱 깊이가 낮거나 유전체 중복이 적은 샘플에 대해서는 추가 임계값 최적화가 적용될 수 있습니다.

figure-results-1
그림 1: 샘플 교환 및 오명 표시 발생 현상의 도식적 표현. (A) 두 개인 간 각각 샘플 하나씩 교환. (B) 생검 추출부터 시퀀싱 데이터 분석까지의 샘플 처리 단계를 표현합니다. BioRender로 제작되었습니다. 보이트 폰 보이텐베르크, L. (2026) https://BioRender.com/xhbp178. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

figure-results-2
그림 2: CWL에서 샘플 매칭 품질 관리 워크플로우를 실행하는 데 필요한 입력 파일 및 매개변수의 사용자 인터페이스 표현. 파일 및 매개변수 입력을 위한 그래픽 사용자 인터페이스. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

figure-results-3
그림 3: 샘플 매칭 워크플로우에서 얻은 결과들. 모범적인 DNA 시퀀싱(전체 유전체 및 전체 엑솜 시퀀싱) 샘플 집합(왼쪽), DNA 시퀀싱과 RNA 시퀀싱 간 비교(가운데)를 위한 LOD 점수 분포, 그리고 서로 다른 개인에서 유래한 것으로 알려진 데이터가 알려진 더 큰 RNA 시퀀싱 쌍(오른쪽)의 모범적인 코호트(불일치, 연한 빨간색)과 같은 개체(성냥, 연한 초록색)에서 온 것. 약어; LOD = 로그 오즈비. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

figure-results-4
그림 4: LOD 점수의 예시적 차이가 관찰되었습니다. (A) 알려진 불일치 및 일치 샘플 집합에 대해 서로 다른 서열 정렬 접근법과 하플로타입 맵을 결합했을 때, (B) 종양 및 정상 정보를 통합하여 점수를 매겼을 때. (C) 서로 다른 엄격성을 가진 임계값 접근법에 의해 정의된 표본 일치 및 불일치 수의 발생. 약어; LOD = 로그 오즈비. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

figure-results-5
그림 5: 다양한 차세대 시퀀싱 방식을 비교하기 위한 LOD 점수의 예시 분포. (A) 혈액 및 종양 조직의 DNA 시퀀싱과 종양 조직의 RNA 시퀀싱 간 예상 불일치 및 일치 샘플의 LOD 점수 분포. (B) 서로 다른 모달리즘 조합에 대한 일치 샘플의 LOD 점수 분포. 약어; LOD = 로그 오즈비. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

figure-results-6
그림 6: 유방암 WES 및 RNA 시퀀싱 데이터셋 분석을 위한 LOD 점수 분포. 비식별화된 유방암 데이터셋은 Caris Life Sciences에서 수집되었으며, 포괄적인 종양 프로파일링을 통해 도출되었습니다. (A) 종양 WES 샘플(왼쪽)과 RNA 시퀀싱 샘플(오른쪽) 간 비교를 위한 LOD 점수의 로그 발생. (B) 동일 개인의 예상 샘플 쌍에 대한 LOD 점수 분포(WES 상단 행, RNA 시퀀싱 하단 행). 약어; LOD = 로그 오즈비. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

LEFT_GROUP_VALUERIGHT_GROUP_VALUE결과LOD_SCORELOD_SCORE_
TUMOR_NORMAL		LOD_SCORE_
NORMAL_TUMOR
샘플 1샘플 1EXPECTED_MATCH38.11926629.64948529.649485
샘플 1샘플 2EXPECTED_MISMATCH-2.552644-4.574225.283698
샘플 2샘플 1EXPECTED_MISMATCH-2.5526445.283698-4.57422
샘플 2샘플 2EXPECTED_MATCH12.3287378.7964578.796457

표 1: 교차 지문 검사 실행에서 얻은 모범적인 결과. 표는 표 매칭 접근법으로 비교한 샘플 쌍의 모범적인 결과를 보여줍니다.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

샘플 일치를 식별하는 다양한 방법이 1,4,13,14,15,16이 있습니다. 여기서는 여러 오믹스 모달리티에 적용 가능한 SNP 연관 비평형 블록을 이용한 접근법을 사용하며, 낮은 위양성 및 위음성률을 적용하는 방법을 설명했다15. 표준화된 워크플로우 환경 내에서 데이터셋 간 고처리량 처리를 용이하게 하기 위해 CWL에서 구현되었습니다. 워크플로우 평가에서는 이 접근법을 적용할 때 고려해야 할 세 가지 핵심 측면이 확인되었습니다. 이 과정의 핵심 단계는 하플로타입 지도가 포함하는 유전체 영역을 선택하는 것입니다. 또한, 서로 다른 하플로타입 맵을 이용한 리드 정렬과 지문 추출을 결합하면 분석 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 더불어, 데이터 모달리티와 커버되는 영역에 따라 달라질 수 있는 임계값의 신중한 평가와 선택이 필수적이며, 이는 더 관대한 샘플 매칭 호출을 가능하게 할 수 있습니다.

대규모 임상 샘플 평가를 위해 이 방법은 허용 및 엄격한 샘플 매칭 점수의 임계값 조합을 정의하도록 조정되었습니다. 이 방법은 LOD 점수(LOD_SCORE, LOD_SCORE_TUMOR_NORMAL, LOD_SCORE_NORMAL_TUMOR) 중 하나로 구성된 결합 점수 또는 두 가지 대체 필터링 기준을 고려하여 허용적 임계값 접근법을 포함하도록 조정하여, 보다 엄격한 표본 선택을 가능하게 했습니다. 이 접근법의 적용 가능성은 다양한 유전체 영역에 걸쳐 SNP 정보가 제공되는 샘플, 예를 들어 차세대 시퀀싱 데이터에 한정됩니다. 더불어, 비교 분석과 표본 매칭을 위해서는 동일한 개체의 최소 쌍이 필요합니다. 표적 방법으로 얻은 돌연변이 상태나 성별과 같은 환자 메타데이터와 같은 추가 임상 정보는 고차원 분자 데이터와 환자 수준 임상 데이터 간의 추가 일치 증거를 제공하는 데 활용될 수 있습니다.

워크플로우 관리 환경에서 이 접근법을 병렬 데이터 저장 가능성을 적용하면, 개별 간 오염에 대한 샘플의 고처리량 품질 관리 분석이 가능합니다. 따라서 데이터셋과 샘플 전반에 걸쳐 접근성과 재현성을 높입니다. 이 접근법에서 임계값 기준의 적응성은 종양 돌연변이 부담과 복사수 변화가 낮거나 높은 암 샘플을 처리하고 분석할 수 있게 하여 이형접합 손실로 이어져 유전자형 가능성에 영향을 미칠 수 있습니다.

이 방법은 인간 개인의 차세대 시퀀싱 데이터가 포함되고 개인당 단일 이상의 샘플이 있는 모든 유형의 프로젝트에 폭넓게 적용될 수 있습니다. 이는 개별 환자에 맞춘 맞춤형 접근법부터 다양한 질병 영역에 대한 고차원 분자 데이터를 수집하는 대규모 임상시험까지 다양할 수 있습니다. 이는 품질 관리 워크플로우, 종 간 오염 조사, 고차원 분자 데이터셋과 임상 정보를 연결하여 차세대 시퀀싱 데이터를 위한 품질 관리 파이프라인에 통합하는 접근법과 결합할 수 있습니다.

공개 사항

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모든 저자는 F. Hoffmann-La Roche Ltd의 직원 또는 외부 계약자이자 주주입니다. 또한 Zachary Whitfield는 Rancho Biosciences의 직원이며, Ana Teixeira는 A4Pbio의 직원입니다. 저자들은 상충하는 이해관계가 없다고 선언한다.

감사의 글

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샘플을 제공해 주신 환자분들과 그 가족분들께 진심으로 감사드립니다. 임상 연구에 참여한 모든 분들, 특히 연구팀, 연구팀, 임상 연구 기관의 프로젝트 팀 구성원들에게 깊은 감사를 표합니다. 그들의 귀중한 기여에 감사드립니다. 저자들은 원고를 비판적으로 읽어주고 귀중한 의견을 남겨준 N. Nair와 E. Guarin에게 감사를 표합니다. 추가 데이터셋 접근 가능하게 해준 A. Cosolo에게도 감사드립니다. 우리는 데이터 큐레이션과 조화에 기여한 로슈 전역의 향상된 데이터 및 인사이트 공유(EDIS) 네트워크에 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
패스트퀄리티v0.11.9SCR_014583
멀티QCv1.8SCR_014982
비와멤v0.7.17SCR_010910
별v2.7.9aSCR_004463
SAMtoolsv1.12, v1.19.2SCR_005227
-  파이덱스
-  정렬
-  색인
- 애드레스레스토르
피카드V2.25.5, v3.0.0SCR_006525
- CreateSequenceDictionary
- 마크 중복
- build_fingerprint_maps
- 추출 지문
- 교차 확인 지문
CWLv1.2SCR_015528
RR v4.3.1SCR_001905
DPLYR v1.1.4

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