시험관 내 박테리아 유비퀴틴화 재구성 및 VCP/p97 매개 제거

요약

이 프로토콜은 포유류 세포 용해액 또는 순수 유비퀴틴 효소 복합체를 이용해 폐렴 구균을 유비퀴틴화하는 방법을 설명하며, 이후 정제된 VCP/p97-UFD1-NPLOC4 단백질 복합체로 처리하여 박테리오리네이션 활성을 평가하여 유비퀴틴 의존성 면역 효과 연구를 가능하게 합니다.

초록

유비퀴틴화는 세포질 면역에 중요한 역할을 하는 다목적 번역 후 변형입니다. 숙주 세포가 침입하면 병원성 박테리아는 처음에 엔도좀 내에 갇히고, 이로부터 분리되어 세포질 속으로 빠져나가 리소좀 분해를 방지합니다. 세포질에 들어가면 숙주 E3 리가아제가 유비퀴틴 사슬을 빠르게 표지하여, 자가포식과 프로테아좀을 포함한 여러 효과 경로를 통해 제거 표시를 합니다. 개별 경로가 박테리아 제거에 기여하는 점을 명확히 하기 위해 시험관 내 재구성은 통제되고 명확한 접근법을 제공합니다. 여기서는 Streptococcus pneumoniae (SPN)를 모델 박테리아 병원체로 사용하여 포유류 세포 용해체 또는 순수 유비퀴틴 효소 복합체를 이용한 유비퀴틴화 프로토콜을 제시하고, 이후 정제된 VCP/p97-UFD1-NPLOC4 복합체로 처리하여 다른 세포 요인과 독립적으로 박테리아 생성 활성을 평가합니다. 전반적으로 이 절차는 면역 연관 유비퀴틴 리가아제와 이펙터의 기능을 세포 없는 환경에서 밝힐 잠재력을 지니고 있으며, 온전한 세포에서는 이러한 기전을 해부하기 어려운 상황에서 확인할 수 있습니다.

서론

유비퀴틴(Ub)은 8.6 kDa의 작은 단백질로, 표적 기질의 C-말단 글리신에 공유 결합하여 유비퀴틴화¹이라는 과정을 통해 라이신 잔기의 ε-아미노 그룹과 이소펩타이드 결합을 형성합니다. 이 현상은 E1 유비퀴틴 활성화 효소, E2 유비퀴틴 결합 효소, E3 유비퀴틴 리가아제 ^1,2,3을 포함하는 일련의 계획된 단계에 의해 지배됩니다. Ub는 단량체로 결합되거나 7개의 라이신 잔기(선형/M1, K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63^)를 통해 서로 다른 길이의 사슬로 결합될 수 있습니다. 이 독특한 Ub 사슬들은 프로테아좀 분해, 세포 수송, DNA 수리, 선택적 자가포식 등 다양한 세포 기능에 대한 분자 표지 역할을^합니다.

유비퀴틴화의 정전적 역할은 오랫동안 세포 항상성 유지와 연관되어 왔으며, 예를 들어 프로테아좀을 통해 잘못 접힌 단백질을 분해하거나 특정 화물을 선택적 자가포식으로 유도하는 등, ^{5,6 5,6} 하지만 이제는 유비퀴틴이 세포질 면역계가 세균 감염에 대해 감지하는 중요한 메커니즘으로도 기능한다는 점이 명백해졌습니다. 세포 내 박테리아는 세포외 면역 반응의 탐지를 피하고 안전한 환경에서 번식하기 위해 숙주 세포에 자주 침투합니다 ^7,8. 많은 병원체는 분비 시스템과 독소를 이용해 자신을 운반하는 공포를 돌이킬 수 없게 손상시키며, 세포질로 빠져나가 영양^{분을 얻}도록 ^합니다. 세포질에 들어가면, 이 박테리아들은 특정 E3 리가아제에 의해 폴리유비퀴틴 사슬로 장식되어 분자적 '죽음 태그' 역할을 하여 선택적 제거를 유도합니다. 예를 들어, E3 리가아제 SMURF1은 결핵균 표면에서 K48 결합 폴리우비퀴티네이션을 직접 시작하여 프로테아좀¹¹을 통해 분해시킵니다. 파킨은 박테리아가 포함된 액포에 축적되어 K63 연결 유비퀴틴 사슬을 형성^하며, ARIH1과 LRSAM1은 각각 K48과 K6 사슬로 박테리아 표면을 변형하여 박테리아 증식을 억제합니다^13,14. 대부분의 E3 리가아제는 주로 숙주 단백질 기질을 표적으로 하지만, 일부 리가아제는 미생물 성분에 대해 주목할 만한 특이성을 보입니다. RNF213은 Salmonella enterica serovar Typhimurium¹⁵에서 발견되는 지질다당류(LPS)를 식별하고 유비퀴틴화하며, SCF^FBXO2 복합체는 A 군 연쇄상구균에 존재하는 박테리아 당류를 유비퀴탄화^기질로 인식하여 이종 섭취를 촉진합니다. 반면 SCF^FBXW7 복합체는 폐렴구균(SPN) 표면 단백질 내 데그론 모티프를 인식합니다. 여기에는 β-갈락토시다제 A(BgaA)와 폐렴구균 표면 단백질 A(PspA)가 포함되며, K48 결합 폴리유비퀴틴 사슬로 태그 부착한 후 K48 결합 Ub 특이항체를 통해 확인되어 프로테아좀 시스템을 끌어들여 효과적인 박테리아 제거를 가능하게 하는 것으로 추정된다¹⁷.

이러한 세포질 침입자를 유비퀴틴으로 표지하는 과정은 잘 알려져 있지만, 프로테아좀 시스템이 이처럼 큰 미생물 개체를 제거하는 후속 메커니즘은 여전히 의문입니다. 최근 연구에 따르면 숙주 AAA+ ATPase인 VCP/p97(발로신 함유 단백질)이 이 과정에서 중요한 역할을 합니다. UFD1, NPLOC4와 같은 보조인자와 협력하여 VCP는 폴리유비퀴틴이 표시된 박테리아를 식별하고, 박테리아 막에서 유비퀴틴화된 단백질을 물리적으로 추출하여 단백질을 파열시키고, 프로테아좀 기계에 의존하지 않고도 세포질 환경에서 제거를 돕는다¹⁸.

숙주 세포질은 병행 및 실패 방지 방식으로 병원체를 제거하는 복잡한 면역 경로 네트워크를 포함하고 있습니다. 이러한 중복성은 강력한 방어에 매우 중요하지만, 개별^{면역 인자의} 역할을 식별하고 검토하는 노력을 복잡하게 만듭니다. 이와 관련해 시험관 내 재구성 시스템은 통제된 조건 하에서 특정 경로를 분석할 수 있는 유용한 플랫폼을 제공합니다. 여기서는 포유류 세포 용해액 또는 E1-E2-E3-Ub 효소와 정제된 숙주 이펙터 복합체를 사용하여 SPN의 유비퀴틴화 과정과 생존성 상실 과정을 재현하는 세포 자유 시스템을 소개합니다. 이 2단계 프로토콜에서는 먼저 박테리아 내 폴리유비퀴틴 사슬의 결합을 촉진한 후, UFD1 및 NPLOC4와 함께 VCP/p97에 의한 제거 효과를 평가합니다. 이 경로를 시험 관 내에서 재구성함으로써 세포의 복잡성을 우회하고 VCP가 병원체를 중화하는 능력을 구체적으로 조사합니다. 이 정밀한 설정은 기질 인식, 사슬 특이성, 효과기의 작용 기전 및 효과적인 반응을 시작하는 데 필요한 필수 구성 요소를 상세히 탐구할 수 있게 합니다.

프로토콜

1. 세포 배양 및 용해물 준비

1. A549 세포를 해동하여 완전한 DMEM과 10% 태아 소 혈청(FBS)을 사용해 T25 플라스크에서 배양합니다. 5%_CO2가 포함된 가습 환경에서 37°C에서 배양합니다. 세포를 세 번의 통로를 거쳐 유지한 후, 2× 10개의⁶개 세포를 T75 플라스크로 옮깁니다. 세포 밀도가 8-10 ×^{10 6} 세포에 도달할 때까지 배양을 계속합니다.
2. T75 플라스크에서 200 mM HEPES, 100 mM MgCl₂, 1 M KCl, 5% 글리세롤이 포함된 반응 완충제를 사용해 pH 7.4에서 세포를 4°C에서 긁어냅니다. 긁은 세포를 120 × g에서 10 분간 원 심분리하여 펠릿으로 만든 후, 반응 버퍼에 재현탁하여 1.5mL 원심분리관에 약 0.6mL의 최종 부피를 만듭니다.
   참고: 전체 샘플은 얼음에서 처리해야 합니다.
3. 직경 2mm의 좁은 프로브(팁 직경 2mm)를 사용해 진폭 40 μm로 2초간 온/오프 펄스를 사용해 2-2.5분 동안 혼합물을 얼음 위에 보관합니다. 21,000 × g에서 초음파 검사 샘플을 45분간 원심분리한 후 상청액을 수집한 후 50배 프로테아제 억제제 칵테일 2-3배를 추가합니다.
   참고: 같은 날 즉시 용해물을 유비퀴틴화 반응에 사용하거나, 액체 질소로 급속 냉동하여 -80 °C에서 보관하세요; 하지만 효과적인 유비퀴틴화 효과를 위해서는 최대 3일 이내에 사용해야 합니다. 용해액 농도는 2에서 4 mg/mL 범위의 유비퀴틴화에 적합합니다.

2. 박테리아 배양

1. 세균인 Streptococcus pneumoniae (SPN) R6 균주(혈청형 II)를 Todd Hewitt 육수 가루(3.7g/100mL)와 효모 추출물 가루(1.5g/100mL)로 구성된 THY 배지에서 37°C에서 5%_CO2 와 함께 하룻밤 동안 배양합니다.
   참고: 배지가 짙은 갈색으로 변한 경우 박테리아 접종을 피하세요. 폐렴구균 은 생물안전성 2단계(BSL-2) 병원체로 분류되며; 예방 조치를 취하고 인증된 생물안전 캐비닛 사용을 포함한 올바른 BSL-2 격리 프로토콜을 준수하세요.
2. 다음 날, 1:10 배지에 신선한 THY 배지에 37°C에 5%_CO2 를 접종하고, SPN을 600nm(외경_600nm)에서 0.4까지 배양합니다. SPN 글리세롤 스톡(SPN 배양 900 μL 및 글리세롤 600 μL 50%)을 준비하여 -80 °C에 보관합니다.
3. 유비퀴틴화 실험 당일, -80 °C에서 새로 생성된 SPN 재고를 해동하여 5mL THY 배지에 완전히 접종한 후 OD_{600 nm} 가 0.4에 도달할 때까지 성장시킵니다.
   참고: 박테리아 배양은_{OD 600 nm} 0.4로 배양되었으며, 이는 약 10개의⁸ SPN 세포가 mL당 존재합니다. 이 상관관계는 집락형성 단위(CFU)를 열거하여 1x PBS로 배양물을 연속적으로 희석하여 박테리아 세포 농도를 낮추어 셀렉터 콜로니를 얻을 수 있게 하고, THY보다 더 농축된 배지인 BHI 한천 플레이트에 점검하여 확립되었습니다.

3 . 포 유류 용해액에서 유비퀴틴화 시험관 내 분석법

1. 약 10^개의 SPN 셀을 반응 버퍼(200 mM HEPES, 100 mM MgCl 2, 100 mM MgCl₂, 1 M KCl, 5% 글리세롤, pH 7.4)로 최소 세 번 이상 세척한 후 다음 버퍼에 다시 현탁시키고, 21,000 × g에서 5 분간 원 심분리한 후 마지막으로 21,000 × g에서 실온에서 5 분간 원 심분리하여 박테리아를 제거합니다.
2. SPN 펠릿을 A549 포유류 세포 용해액과 정제된 유비퀴틴(350 μM), 1 mM ATP와 함께 재현탁하여 27 °C에서 1-2시간 배양합니다.
   참고: 포유류 세포 용해액을 냉동 및 해동하는 것은 피해야 합니다. 용해액은 유비퀴틴화 분석과 같은 날 준비하는 것이 가장 좋습니다.
3. 배양 후에는 1M 요소 성분이 포함된 반응 완충제로 박테리아를 한 번 세척하고, 반응 완충제만으로 두 번 세척한 뒤, 1% 파라포름알데히드(PFA)로 고정합니다. 고정 후에는 글리신이 함유된 PBS(1 mg/mL)로 세포를 15분간 배양한 후, 1회 PBS 세척을 두 번 합니다.
   참고: 1 M 요소 세척은 비공유 상호작용을 약간씩 방해하여 공유 공유 유비퀴틴 박테리아만 남도록 하는 데 사용됩니다. 그 후에는 잔여 요소(rea)를 제거하기 위해 반응 버퍼로 철저히 세척하는 것이 중요한데, 이는 체외 내 살상 분석에 방해가 될 수 있기 때문입니다.
   음성 대조군으로는 전체 반응 혼합물을 준비하고 얼음 위에 박테리아와 함께 배양하여 효소 활성을 억제합니다. 배양 직후에는 샘플을 씻고 1% PFA로 고정하여 반응 상태를 유지하세요.

4. E1-E2-E3 효소 복합체로부터 의 시험관 내 유비퀴틴화 분석법

1. 먼저 유비퀴틴(350 μM), UBE1(400-800 nM), UbE2C(3-5 μM), Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 복합물(500 nM), 2 mM ATP(200 mM HEPES, 100 mM MgCl₂, 1 M KCl, pH 7.4 5% 글리세롤)로 구성된 반응 혼합물을 준비하여 총 반응 부피를 100-150 μL로 만듭니다.
   참고: 모든 효소는 -80°C에 보관하세요. 여러 번의 동결-해동 사이클로 인한 활성 손실을 피하려면 작은 알리코트를 만들고 유비퀴틴화 반응마다 새로운 알리코트를 활용하세요.
2. 박테리아(10⁷ CFU)를 이 유비퀴틴 효소 함유 반응 혼합물에 재현탁하여 27 °C에서 2시간 배양합니다. 그 후 1M 요소가 포함된 반응 버퍼로 박테리아를 최소 3회 세척한 후, 1% 파라포름알데히드(PFA)로 고정합니다. 고정 후에는 글리신이 함유된 PBS(1 mg/mL)로 세포를 15분간 배양한 후, 1회 PBS 세척을 두 번 합니다.
   참고: 세포 손실이 과도하면 세척 횟수를 줄일 수 있습니다.

5. 유비퀴틴화된 박테리아의 시각화

1. 샘플을 1% PFA로 고정한 후, 3% BSA에서 27°C에서 1시간 배양한 후 1x PBS로 두 번 세척합니다.
2. 면역형광 분석법에서 일반적으로 사용되는 농도보다 높은 농도로 1차 항체를 사용해 유비퀴틴화된 박테리아를 재현탁합니다. 박테리아 특이적 항체와 항유비퀴틴 항체(1:100)를 사용하며, 1% BSA가 포함된 PBS로 희석하여 27°C에서 1시간 동안 염색합니다.
   참고: 최적의 항체 염색을 위해서는 저단백질 결합 원심분리관을 사용해 항체 손실을 최소화하거나, 더 높은 항체 농도를 사용해 최상의 결과를 얻으세요.
3. 그 후 박테리아를 1x PBS로 두 번 세척한 후, 각각 Alexa Fluor 488과 555와 결합된 2차 항체로 27°C에서 1시간 동안 재현탁합니다.
4. 라벨이 붙은 박테리아 샘플을 약 10-20 μL 드롭캐스팅으로 적용하고, DAPI 유무 매춘 매체 5-10 μL에 섞은 후 커버 슬립을 덮고 휴지로 남은 액체를 흡수합니다. 마지막으로, 같은 날 공초점 현미경으로 샘플을 관찰합니다.

6. 단백질 발현 및 정제

1. 야생형 VCP/p97의 발현을 위해, VCP를 포함한 pET28a 플라스미드를 표준 대장균 형질전환 프로토콜²⁰을 통해 대장균 BL21-DE3 균주로 전환합니다. 37°C에서 루리아 육수(LB)에서 하룻밤 사이에 인큐베이트 군락이 형성되었습니다. 다음 날, LB가 들어 있는 잘 공기화된 플라스크에 1:50 배양물을 접종하고, OD_{600 nm}가 0.7-0.8에 도달할 때까지 배양합니다. IPTG 200 μM을 배양액에 추가하고 37°C에서 5시간 배양하며 180rpm에서 흔들며; SDS-PAGE를 사용하여 단백질 발현을 확인합니다.
   참고: 박테리아 증식 및 발현 전 단계에서 카나마이신(50 μg/mL)을 선택 압력으로 사용하였습니다.
2. 야생형 UFD1 발현을 위해, UFD1 함유 pET41b 플라스미드를 표준 대장균 형질전환 프로토콜²⁰에 따라 대장균 BL21-로제타 균주로 전환합니다. 37°C에서 루리아 육수(LB)에서 하룻밤 사이에 인큐베이트 군락이 형성되었습니다. 다음 날, LB가 들어 있는 잘 공기화된 플라스크에 1:50 배양물을 접종하고, OD_{600 nm}가 0.7-0.8에 도달할 때까지 배양합니다. 1 mM IPTG를 배양액에 추가하고 37°C에서 5시간 배양하며 180rpm 진동 상태에서 배양; SDS-PAGE를 사용하여 단백질 발현을 확인합니다.
3. 야생형 NPLOC4를 발현시키기 위해, 표준 대장균 형질전환법²⁰을 사용하여 NPLOC4 함유 pET41b 플라스미드를 대장균 BL21-로제타 균주에 도입하라. 루리아 육수(LB)에서 형질변환으로 생성된 군집을 37°C에서 하룻밤 동안 부양시킵니다. 다음 날, 배양물을 1:50 희석한 상태로 LB가 채워진 잘 기성 있는 플라스크에 옮겨 외경_{600 nm}에서 광학 밀도가 0.7-0.8에 도달할 때까지 성장시킵니다. 그 다음, 1mM IPTG를 배양액에 추가하고 180rpm에서 18°C에서 16시간 배양을 계속합니다; SDS-PAGE 분석을 수행하여 단백질 발현을 검증합니다.
   참고: 대장균 BL21-로제타 균주에서 전체 박테리아 성장 및 발현 단계에서는 카나마이신(50 μg/mL)과 클로람페니콜(20 μg/mL)이 선택 압력으로 사용되었습니다. pET28a-p97과 pET41b-NPLOC4의 서열은 보충 파일 1에 제공되어 있습니다.
4. 단백질 발현 후, 박테리아 세포를 21,000 × g에서 10분간 원심분리한 후, 50 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 5 mM β-머캅토에탄올, 1 mM PMSF, 5% 글리세롤, pH 8가 포함된 용해 버퍼에 펠릿을 재현탁합니다.
5. 좁은 프로브(팁 직경 6mm)를 사용해 1시간 동안 진폭 50 μm, 4 °C에서 20초 펄스 온/오프 펄스로 세포를 초음파 처리합니다. 15,000 × g을 사용해 1시간 동안 이물질을 제거하고 상원액을 수집합니다.
   참고: 총 초음파 검사는 1시간 동안 수행되었으며(30분 켜짐, 30분 꺼짐, 20초 펄스), 탁한 세포 현탁액이 투명에서 투명로 변할 때까지 이 과정을 계속했습니다. 세포 잔해가 펠릿 상태로 유지되고 용해액이 단백질 정제 컬럼에 적재될 때 밀려나지 않도록 하기 위해 고속 원심분리가 필요합니다.
6. 상청액을 0.4 μm 필터를 통과시킨 후, 정화 완충제(50 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 5 mM β-머캅토에탄올, 5% 글리세롤, pH 8)로 미리 평형화된 Ni-NTA 비드로 채워진 컬럼에 적재합니다.
7. 단백질이 풍부한 컬럼을 50 mM 트리스-클, 300 mM NaCl, 5 mM β-머캅토에탄올, 5% 글리세롤, pH 8, 약 400 mL의 30-60 mM 이미다졸 30-60 mM 이미다졸을 포함한 세척 버퍼로 단백질을 용출한 후, 50 mM 트리스-클, 300 mM NaCl, 5 mM β-머캡토에탄올, 5% 글리세롤, pH 8, 250 mM 이미다졸을 포함한 용출 버퍼로 단백질을 용출합니다.
   참고: 이미다졸의 농도와 세척액의 양은 분석하는 특정 단백질에 따라 다를 수 있습니다. 순도를 평가하기 위해서는 SDS-PAGE를 수행해야 합니다. 블래드포드 시약과 부정적인 반응을 보일 때까지 컬럼을 철저히 세척하는 것이 필수적입니다. 용출된 분획은 표적 단백질의 두드러지고 농축된 띠를 보여주며, 이는 주로 샘플을 대표하고, 다른 단백질의 흔적은 거의 없어야 합니다.
8. 다양한 분획을 수집하여 SDS PAGE로 분석하여 순수 단백질이 포함된 분획을 확인한 후, PD-10 컬럼을 이용해 반응 버퍼(200 mM HEPES, 100 mM MgCl 2, 100 mM MgCl₂, 1 M KCl, 5% 글리세롤, pH 7.4)로 교환합니다.
   참고: 단백질 농도는 브래드포드 시약(Coomassie Brilliant Blue G-250)을 사용하여 측정하세요. 모든 단백질은 액체 질소에 급속 냉동하여 -80°C에서 보관해야 합니다.

7. 시험관 내 박테리아 살해 분석법

1. VCP/p97 6 μM과 NPLOC4 및 UFD1 각각 1 μM을 혼합한 후, 약 90 μL까지 반응 버퍼로 채웁니다. 이 반응 혼합물을 얼음 위에서 2시간 배양합니다.
2. p97-UFD1-NPLOC4를 포함한 반응 혼합물에 1-2 mM의 ATP를 첨가한 후, 유비퀴틴화된 SPN(10,7 세포)과 37 °C에서 2시간 동안 결합합니다.
3. 박테리아의 생존 가능성을 평가하기 위해, 처리 직후 반응 혼합물의 1 μl 알리코트를 취해 연속 희석(1:1, 1:10, 1:100, 1:100, 1:1000)을 수행한 후 각 희석액의 10-2 μL을 뇌심장 주입(BHI) 한천 플레이트에 점검합니다. 이 과정을 반응에서 추출한 1 μL 알리코트로 2시간 배양 후 반복합니다.
   참고: 더 나은 결과를 위해 모든 희석 상태를 확인하세요.
4. 0시간과 2시간 시간 사이의 군집 형성 단위(CFU)를 평가합니다. 박테리아 생존력(%)을 2시간의 CFU 수치를 0시간의 CFU 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 계산합니다.
   참고: 더 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해서는 열변성 VCP/p97, UFD1-NPLOC4 보조인자가 없는 VCP/p97, 또는 ATPase 결핍 변이체의 VCP/p97을 음성 대조군으로 비교할 수 있습니다.

결과

우리 프로토콜은 포유류 A549 세포를 이용해 유비퀴틴화 과정을 시작하는 데 필요한 구성 요소가 풍부한 세포 해해액을 생산하는 과정을 상세히 설명합니다(그림 1A). 이 용해액은 농축 상태이거나 UBE1(E1 유비퀴틴 활성화 효소), UbE2C(E2 유비퀴틴 결합 효소), Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 복합체(E3 유비퀴틴 리게아제)와 같은 정제 성분으로 대체되든, 정제된 유비퀴틴 및 ATP와 혼합되어 박테 리아의 시험관 내 유비퀴틴화를 촉진합니다(그림 1B)). 유비퀴틴화 후 박테리오리오리티 반응을 평가하기 위해, 정제된 VCP/p97과 그 보조인자 UFD1, NPLOC4를 반응에 포함시켰습니다(그림 1C).

토론

여기서 설명한 시험관 내 재구성 시스템은 박테리아 유비퀴틴화 및 제거의 분자적 복잡성을 탐구할 수 있는 견고한 틀을 제공하지만, 몇 가지 중요한 한계점도 고려해야 합니다. 정제된 단백질의 초생리적 농도에 의존하는 점(유비퀴틴화 기구(E1, E2, E3 리가아제, 유비퀴틴)과 숙주 효과기 복합체(VCP/p97, UFD1, NPLOC4)는 병원체 유소화와 제거에 관한 중요한 메커니즘적 통찰을 제공하지만, 살아있는 세포 내 생리적 조건을 완전히 반영하지는 않을 수 있습니다.

세포 자율 면역계는 여러 효과 단백질과 유비퀴틴 리가아제로 구성되어 있으며, 이들이 병행하여 감염을 제거하는 실패 방지 메커니즘으로 작용합니다. 마찬가지로, VCP/p97은 단독으로는 작용하지 않을 수 있으며, 다른 요인이나 추가적인 분해 경로에 의존할 수 있습니다. 우리의 시험관 내 재구성 결과는 각각 박테리아 유비퀴틴화...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
50X 프로테아제 억제제 칵테일	프로메가	G6521
6배-히스-유비퀴틴	UBPBio	E1100
A549 세포주	ATCC	ATCC CCL-185
알렉사 플루어 488	인비트로젠	A21202
알렉사 플루어 555	인비트로젠	A-31572   그리고 nbsp;
항유비퀴틴 항체	엔조	BML-PW8810-0100
항유비퀴틴 K48 특이적 클론 Apu2 항체	시그마 올드리치	ZRB2150
ATP	시그마 올드리치	A6419
비	HiMedia	M210
DMEM(고혈당)	HiMedia	AL251
FBS	깁코 (미국에서 기원)	38220090
글리세롤	PureSynth	PSR37325
젠장	시그마 올드리치	H4034-100G
KCl	시그마 올드리치	P3911
MgCl2	시그마 올드리치	TC006
파라포름알데히드	시그마 올드리치	E6148
pET28a-p97 플라스미드	우리 연구실		플라스미드는 요청 시 제공 가능
pET41b-NPLOC4 플라스미드	우리 연구실		플라스미드는 요청 시 제공 가능
pET41b-UFD1 플라스미드	애드진	플라스미드 #117107
Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7	시그마 올드리치	23-030
폐렴구균 R6 균주	ATCC	ATCC BAA-255	위험군 -2 병원체, BSL-2 시설에서 다뤄야
토드 휴잇 육수 가루	HiMedia	M313
UBE1	UBPBio	B1100
UbE2C	UBPBio	C1300
요소	HiMedia	MB032
효모 추출물 분말 & nbsp;	HiMedia	RM027