방법 논문

골수 간질 세포 이동을 안내하기 위해 마이크로스케일 강성 구배를 가진 기판의 미세 가공

DOI:

10.3791/69473

⸱

2025년 11월 14일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration, Key Laboratory of Oral Biomedicine Ministry of Education, Hubei Key Laboratory of Stomatology, School & Hospital of Stomatology, Wuhan University, 2School of Power and Mechanical Engineering, The Institute of Technological Science, Wuhan University, 3Department of Oral Implantology, School and Hospital of Stomatology, Wuhan University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 소프트 리소그래피를 통한 이중층 폴리디메틸실록산(PDMS) 기판의 제조를 자세히 설명합니다. 이 방법은 부드러운 평평한 최상층과 결합된 단단한 하부층에서 기하학적으로 변조된 미세 구조를 활용하여 마이크로 스케일의 효과적인 강성 구배를 생성하여 지형 간섭 없이 세포 기계생물학 연구를 가능하게 합니다.

초록

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세포가 기계적 신호에 어떻게 반응하는지 이해하는 것은 조직 발달 및 질병 진행과 관련된 메커니즘을 밝히는 데 중요합니다. 그러나 기존의 시험관 내 세포 배양 기질은 종종 세포 규모에서 생리학적 강성 구배를 복제하지 못하는 동시에 교란스러운 지형학적 단서를 제거합니다. 본 연구에서는 이중층 폴리디메틸실록산(PDMS) 기판을 활용한 분리된 강성 모델을 제시합니다. 이 기판은 릿지 앤 그루브 미세 구조를 특징으로하는 단단한 하부 층 위에 매달린 부드럽고 평평한 상단 필름으로 구성됩니다. 최상층은 세포 접촉 표면에서 균일한 지형과 화학적 성질을 유지하면서 기본 구조의 강성 변화를 효과적으로 전달합니다. 강성 변조는 동일한 간격으로 교대 능선과 홈의 너비를 변경하여 달성됩니다. 주사 전자 현미경은 평평한 표면 형태와 일관된 접촉 지형을 확인했습니다. 원자력 현미경은 강성 변화가 미세 구조에 따라 달라진다는 것을 입증했습니다: 20μm 패턴의 경우 탄성 계수는 능선의 경우 약 950kPa, 홈의 경우 850kPa였습니다. 50μm 패턴의 경우 이 값은 각각 약 1070kPa 및 950kPa였습니다. 마우스 일차 골수 세포는 기질에 잘 부착되고 퍼져 50μm 패턴(61.49%, p < 0.05)에서 더 단단한 능선 영역에 대한 핵 국소화에 대한 선호도를 보였고, 이에 따라 기계적 구배에 대한 효과적인 세포 인식을 확인했습니다. 요약하면, 이 프로토콜은 마이크로 스케일 강성 구배로 세포 배양 기질을 구성하는 재현 가능한 방법을 제공하여 화학적 또는 지형 간섭을 최소화하여 세포 기계 형질도입에 대한 조사를 가능하게 합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포는 외부 미세 환경 1,2,3 내에서 기계적 자극을 감지하고 반응하는 능력을 가지고 있으며, 이는 접착, 이동, 증식 및 분화를 포함한 다양한 세포 과정을 조절하는 데 중요합니다4. 생체 내에서, 조직 미세 환경의 기계적 특성은 뼈와 근육의 접합부와 같은 생리학적 맥락과 종양 내와 같은 병리학적 조건 모두에서 관찰되는 기질 강성의 변화와 함께 상당한 공간적 이질성을 나타냅니다 5,6,7. 이러한 기계적 요인에 대한 포괄적인 조사는 세포 행동을 지배하는 조절 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다. 이러한 메커니즘은 조직 발달, 질병 진행, 재생 및 복구 과정과 같은 과정에서 중추적인 역할을 합니다 8,9.

시험관 내에서 이러한 복잡한 기계적 미세 환경을 시뮬레이션하기 위해 하이드로겔 또는 엘라스토머는 가교 정도 또는 성분 비율 3,10,11,12,13을 조정하여 다양한 강성을 가진 기판을 만드는 데 널리 사용됩니다. 그러나 이러한 방법은 종종 생리학적 조건을 정확하게 모방하는 연속적인 마이크로 스케일 강성 구배를 재현하지 못하는 개별 강성 변화를 초래합니다 13,14,15,16,17. 최근 연구에서는 광학 가교(예: UV 노출을 조절하기 위해 포토마스크 사용)18, 미세유체 다중 채널 혼합(19,20) 및 강성 구배를 구성하기 위한 확산 구동 수단(21)과 같은 기술을 탐구했습니다. 불행히도 이러한 접근 방식은 기술적으로 복잡할 수 있으며 메쉬 크기22, 팽창23,24 및 지형25와 같은 추가 변수를 도입할 수 있습니다. 교란 요인의 도입은 경직에 대한 세포 반응의 해석을 복잡하게 만듭니다. 마이크로필러 어레이 또는 바둑판 패턴을 지지 구조로 활용하는 이중층 PDMS 시스템이 채택되어 강성 구배가26,27인 세포 배양 기질을 생성했습니다. 이러한 접근법은 화학적으로 균질한 멤브레인 아래의 개별 기본 지지체에 의존하여 등방성 강성 조절을 달성하여 세포 접착 및 확산을 조사하기 위한 귀중한 플랫폼을 제공합니다. 그러나 생체 내 천연 세포 미세 환경은 종종 기계적 특성에서 매우 이방성적입니다28,29. 이 방향성 기계적 신호는 근본적인 생물학적 사건에 깊은 영향을 미치는 것으로 가정됩니다. 따라서 현재의 바이오 제조 전략은 생체 내에서 관찰되는 미묘한 세포 강성 상호 작용을 복제하는 능력이 제한되어 있으며, 이는 세포 로딩 기질 내에서 마이크로 스케일 강성 구배 및 공간적 이질성을 정확하게 모방하는 데 의존합니다.

이전 연구에서는 세포가 직접 세포 접촉을 하지 않을 때에도 단단한 물체의 효과적인 강성을 인식할 수 있음을 입증했습니다30. 이 연구를 바탕으로 우리는 세포 내 및 단일 세포 메카노센싱과 관련된 크기 범위에 맞춰 5μm에서 50μm 범위의 공간 규모에서 제어된 강성 구배를 생성하는 새로운 이중층 폴리디메틸실록산(PDMS) 세포 배양 기질을 소개합니다. 기판은 두 개의 별개의 층으로 구성됩니다 : 조정 가능한 기하학적 미세 구조를 특징으로하는 단단한 PDMS 하층과 세포 접촉 표면 역할을하는 균일하고 평평한 부드러운 PDMS 오버 레이어. 이 설계는 일관된 표면 화학 및 지형을 유지하면서 하위 구조 형상의 변화를 통해서만 기계적 변조를 허용합니다. 결과적으로 강성 신호를 다른 물리적, 화학적 단서로부터 효과적으로 분리하여 강성 조절을 위한 보다 생물학적으로 관련된 시스템을 제공합니다.

기존의 하이드로겔 기반 기판과 달리 당사의 접근 방식은 팽창, 메쉬 크기 또는 표면 토폴로지의 간섭 없이 단일 변수 기계적 연구를 가능하게 합니다. 기판은 표준 소프트 리소그래피를 사용하여 제작하기 쉽고 재현성이 높습니다31. 또한 고해상도 현미경과 호환되며, 이는 마이크로 스케일 강성 단서에 대한 세포 반응에 대한 실시간 이미징 및 정량적 연구에 특히 적합합니다. 이 원고는 완전한 제조 프로토콜을 제시하고, 매개변수 제어 전략을 자세히 설명하며, 대표적인 세포 배양 실험을 통해 기질의 유용성을 보여줍니다. 궁극적으로 이 접근 방식은 마이크로 스케일 강성 구배에 대한 세포 반응을 탐색하기 위한 강력하고 접근 가능한 시험관 내 도구를 제공합니다.

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프로토콜

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일차 마우스 골수 간질 세포(mBMSC)를 마우스의 경골과 대퇴골에서 분리했습니다(No. WP20230204, 우한대학교 동물실험센터 윤리위원회 승인).

1. 마스터 금형 준비

참고: 당사의 프로토콜은 이 연구 중에 사용된 에폭시 기반 네거티브 포토레지스트에 특정합니다.

  1. 두 개의 깨끗한 실리콘 웨이퍼(50.8 ± 0.2mm, <100> 방향, 525 ± 25μm)를 핫플레이트에 몇 분 동안 놓아 탈수합니다.
  2. 핫플레이트에서 실리콘 웨이퍼 하나를 꺼내 실온으로 식힌 후 스핀 코팅을 진행합니다. 웨이퍼 중심에 3-5mL의 포토레지스트를 도포합니다.
  3. 20μm의 특징 높이를 얻으려면 다음 스핀 프로토콜을 적용합니다: 7.1 × g에서 10초 동안 스핀한 다음 30초 동안 410 × g 에서 스핀합니다. 30μm의 특징 높이를 얻으려면 다음 스핀 프로토콜을 적용합니다: 7.1 × g에서 10초 동안 스핀한 다음 30초 동안 170 × g 에서 스핀합니다. 메스를 조심스럽게 사용하여 스핀 코팅 중에 형성될 수 있는 가장자리 비드를 제거하십시오.
  4. 다음 방식으로 소프트 베이크: 핫플레이트를 95°C로 설정하고 웨이퍼를 핫플레이트에 13분 동안 그대로 둡니다. 핫플레이트에서 웨이퍼를 제거하고 급격한 온도 강하를 피하면서 자연적으로 실온으로 식히십시오.
  5. 포토 esist 코팅 웨이퍼에 포토 마스크를 정렬하고 총 선량이 120 mJ/cm2 인 UV 광선에 노출시킵니다.
  6. 다음과 같은 방식으로 노출 후 베이크: 두 개의 핫플레이트(65°C 및 95°C)를 사용하여 포토레지스트 코팅된 웨이퍼를 65°C 핫플레이트에 1분 동안 놓은 후 95°C 핫플레이트로 옮기고 5분 동안 그대로 둡니다. 웨이퍼를 극세사 조직 스택으로 옮기고 실온으로 식히십시오.
  7. PGMEA로 채워진 페트리 접시에 웨이퍼를 옮겨 현상하고 전체 웨이퍼를 현상액에 담그십시오. 수동 교반으로 개발을 가속화합니다.
    참고: PGMEA는 가연성이며 눈과 호흡기를 자극합니다. 전용 용기에 "가연성 유기 폐기물"로 폐기하십시오.
  8. 현상 후 현상액에서 웨이퍼를 꺼내 이소프로판올로 세척합니다. 샘플 표면에 가까운 이소프로판올에 유백색 흐름이 형성되는 경우(현상이 완료되지 않은 경우) 시료를 현상액에 다시 담가 현상 프로세스를 완료합니다. 현상된 시료를 이소프로판올로 세척하여 시료 표면 가까이에 유백색 흐름이 형성되지 않을 때까지 세척합니다. 완전히 현상되면 웨이퍼를 150°C 핫플레이트에 15분 동안 놓아 포토레지스트를 하드 베이크합니다.
  9. 다음과 같은 소프트 리소그래피 공정을 위해 웨이퍼를 불소화합니다: 웨이퍼를 진공 상태에서 산소 플라즈마에 30초(100W) 동안 노출시켜 표면을 활성화한 다음 진공 데시케이터에 넣습니다. 30μL의 트리클로로(1H,1H,2H,2H-트리데카플루오로-n-옥틸) 실란을 진공 데시케이터 내부에 놓인 유리 슬라이드에 떨어뜨립니다. 데시케이터를 2분 동안 비우고 30분 동안 진공 상태를 유지합니다. 웨이퍼를 90°C에서 1시간 동안 구워 실란화 공정을 완료합니다.
    알림: 프로세스 전반에 걸쳐 주변 상대 습도를 60% 미만으로 엄격하게 제어하십시오. 과도한 수분은 실란의 빠른 가수분해를 유도하여 흰색 비휘발성 폴리실록산 침전물을 생성할 수 있습니다. 침전물은 실란 증기 분포의 균일성을 손상시켜 실란화에 실패합니다. 트리클로로(1H,1H,2H,2H-트리데카플루오로-n-옥틸) 실란이 물과 격렬하게 반응하여 독성 HCl 연기를 방출하므로 후드에서 처리를 수행합니다. 불소화/염소화 유기 폐기물로 폐기하기 전에 묽은 알칼리로 중화하십시오. 실리콘화 공정은 90%의 성공률을 달성합니다.

2. 제작

참고: 이중층 폴리디메틸실록산(PDMS) 기판을 제조하는 데 사용되는 연질 리소그래피 공정은 두 가지 단계로 나눌 수 있습니다: 1) 구조화된 하부층과 최상층의 준비, 2) 두 PDMS 층의 결합. 전체 제조 수율은 80% 이상입니다.

  1. PDMS 준비
    1. 구조화된 하부층의 경우 프리폴리머와 경화제를 10:1 중량의 비율로 혼합한 후 진공 상태에서 가스를 제거하여 PDMS 전구체를 준비합니다. 1.5mL의 PDMS 전구체(10:1)를 SU8 마스터 몰드에 붓고 전체 표면을 덮은 다음 진공 상태에서 가스를 제거하고 30분 동안 휴지시킨다. 조심스럽게 오븐으로 옮기고 90°C에서 1시간 동안 경화시킵니다. 마스터 금형에서 구조화된 PDMS 하부층을 탈형합니다.
    2. 최상층의 경우 프리폴리머와 경화제를 30:1 중량비로 혼합하고 진공 상태에서 가스를 제거하여 PDMS 전구체를 준비합니다. 불소화 실리콘 웨이퍼에 PDMS 전구체를 붓습니다. 9μm의 두께를 얻으려면 다음 스핀 코팅 프로토콜을 적용합니다: 7.1 × g 에서 10초 동안 스핀한 다음 2,300 × g 에서 60초 동안 스핀합니다.
    3. 스핀 코팅 후 주변광 아래에서 PDMS 필름을 육안으로 검사하여 균일성을 확인하고, 특히 줄무늬, 기포 또는 고르지 않은 가장자리 축적과 같은 눈에 보이는 결함이 있는지 검사합니다. 필름이 전체 웨이퍼 표면에 걸쳐 일관된 반사율로 균일하게 투명하게 나타나면 다음 단계로 진행합니다. 그렇지 않은 경우 새 웨이퍼로 스핀 코팅 공정을 반복합니다. 코팅된 웨이퍼를 평평한 표면에 놓아 균일한 PDMS 필름 두께를 보장합니다. 조심스럽게 오븐으로 옮기고 90°C에서 3시간 동안 경화시킵니다.
      참고: 두께가 9.11 ± 0.34μm인 필름을 얻었습니다.
  2. 접합
    1. 패턴이 있는 면이 아래를 향하도록 구조화된 PDMS 하부층(10:1)을 PDMS 최상층 필름에 놓아 인터페이스에서 기포 없이 두 층 사이에 양호한 접촉을 보장합니다.
    2. 어셈블리를 오븐으로 옮기고 90°C에서 3시간 동안 경화시킵니다.
    3. 극세사 티슈 스택에서 어셈블리를 실온으로 식히십시오. 웨이퍼에서 최종 이중층 구조를 분리하고 추가 사용을 위해 페트리 접시에 보관합니다.
      알림: 박리 중에 최상층과 하층 사이에 기포가 형성되면 일반적으로 두 층 사이에 접착이 불완전함을 나타냅니다. 스핀 코팅 전에 PDMS 전구체의 철저한 가스 제거를 확인하고 완전한 접촉을 위해 PDMS 하부층을 적용하기 전에 필름 표면에 먼지나 오염 물질이 없는지 확인하십시오. 스핀 코팅, 조립 및 경화 중에 실리콘 웨이퍼가 수평인지 확인하십시오. 웨이퍼의 고르지 않은 실란화 또는 불균일한 PDMS 두께로 인해 필름 찢어짐이 발생할 수 있습니다. 문제를 해결하려면 실리콘화 중 환경 습도를 60% RH 미만으로 엄격하게 제어하십시오. 실리콘화 공정은 90%의 성공률을 달성합니다.

3. 특성화

  1. 주사 전자 현미경(SEM)
    1. 깨끗한 가장자리를 얻기 위해 날카로운 칼날로 샘플을 자릅니다.
    2. 전도성 탄소 테이프를 사용하여 샘플을 90° 및 0° SEM 스테이지에 장착하여 각각 단면 및 표면 특성화를 가능하게 합니다.
    3. SEM 이미징 품질을 향상시키고 샘플의 SEM 이미지를 수집하기 위해 120초 동안 샘플을 금으로 스퍼터링합니다.
  2. 원자력 현미경(AFM)
    참고: 모듈러스의 정량적 나노역학적 매핑을 위해 ScanAsyst-Air 프로브를 선택하십시오.
    1. AFM 캔틸레버 팁을 시야 중앙에 배치합니다. 광학 레버 시스템을 정렬하여 캔틸레버의 맨 끝에 레이저 스폿을 배치합니다.
    2. PeakForce 정량적 나노기계적 매핑(PeakForce QNM) 측정 전에 AFM 캔틸레버를 교정하여 다음과 같은 필수 매개변수를 결정합니다. 캔틸레버 스프링 상수: 0.40135N/m; 편향 감도: 28.993nm/V (단단한 기준 샘플에서 힘 곡선을 수행하여 결정됨); 팁 반경: ~21 nm (알려진 계수를 가진 참조 샘플에 대해 상대 방법을 사용하여 보정됨).
    3. 스캔 매개변수 목록의 스캔 패널에서 다음 초기 스캔 설정을 구성합니다. 50μm 간격의 주기적인 줄무늬가 있는 샘플의 경우 스캔 크기를 70μm로 설정합니다. 20μm 간격의 주기적인 줄무늬가 있는 샘플의 경우 스캔 크기를 50μm로 설정합니다. 샘플/선 및 선을 256으로 설정합니다(256 x 256 픽셀 이미지 생성).
    4. 현미경에서 Engage Settings(맞물림 설정)를 열고 Engage Parameters(맞물림 매개변수)에서 기기의 기본 Peak Force Engage Setpoint를 설정합니다.
    5. 워크플로 도구 모음에서 참여 아이콘을 클릭하고 자동화된 접근 방식 중에 실시간 신호를 계속 모니터링합니다.
    6. ScanAsyst 자동 제어가 개별 모드로 설정되어 있는지 확인합니다. 원하는 변형 범위를 달성하기 위해 PeakForce 설정값을 적절한 값으로 조정합니다. 최상위 레이어의 경우 PeakForce 설정값은 0.020nN입니다. 구조화된 하부층의 경우 PeakForce 설정값은 5nN입니다.
    7. 위에서 아래로 또는 아래에서 위로 버튼을 클릭하여 스캔을 시작합니다.
    8. 힘 곡선 모니터링 및 수정: 힘 곡선이 왜곡되거나 동기화 문제(예: 불규칙한 모양, 일관되지 않은 기준선)가 관찰되는 경우 힘 모니터 창 내에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 자동 구성을 선택하여 힘 곡선 정렬 및 감도를 자동으로 수정합니다.
    9. 계수 계산 채널 설정 내에서 DMT 모형을 선택하여 탄성 계수 계산을 위해 힘 곡선의 후퇴 부분을 맞춥니다.
    10. 캡처 버튼을 클릭하여 고해상도 지형 및 나노기계적 특성 맵을 획득하고 저장합니다.
    11. AFM 이미지 처리 및 분석 소프트웨어를 사용하여 획득 후 분석을 수행합니다. 저장된 AFM 데이터 파일을 열고 샘플 표면을 가로질러 영역을 선택하여 모듈러스 값을 추출합니다. 소프트웨어에 내장된 통계 분석 도구를 사용하여 최상층과 하층 모두에 대한 평균 계수, 표준 편차 및 분포 프로파일을 계산합니다. 처리된 모듈러스 맵 및 정량적 데이터를 내보냅니다.
    12. 샘플당 AFM 스캔 수: 각 샘플에 대해 3개의 독립적인 전체 영역 스캔을 수행합니다. 각 스캔이 샘플의 구조적 특징 크기와 일치하는 영역(50μm 간격의 주기적 줄무늬가 있는 샘플의 경우 70μm × 70μm, 20μm 간격의 줄무늬가 있는 샘플의 경우 50μm × 50μm)을 커버하는지 확인합니다. 기본 구조(10:1 PDMS)와 최상층 필름(30:1 PDMS)의 모듈러스 측정의 경우 데이터 신뢰성을 보장하기 위해 다음 샘플링 전략을 구현합니다.
      1. 최상층 필름(30:1 PDMS): 겹치지 않는 5 μm × 5 μm 스캔으로 구성된 각 측정으로 모듈러스를 독립적으로 2배 측정합니다.
      2. 기본 구조(10:1 PDMS): 두 가지 뚜렷한 주기적 스트라이프 구성(20μm 및 50μm 간격)을 감안할 때 각 구성에 대해 모듈러스를 2배 독립적으로 측정합니다.

4. 체외 세포 배양 실험

참고: PDMS는 세포 배양 전에 세포 접착을 촉진하기 위해 코팅해야 하는 소수성 물질이며, 세포 유형에 따라 적절한 코팅 방법을 선택해야 합니다. 세포 실험에 일차 세포를 사용하는 경우 윤리적 승인을 받아야 합니다.

  1. 폴리-D-라이신(PDL) 코팅
    1. 10분 동안 알코올 침지로 기판을 멸균합니다. 그런 다음 PBS로 3 x 5분 동안 세척합니다.
    2. 0.1 mg/mL 농도의 PBS를 사용하여 PDL(분자량 150,000 내지 300,000 Da)을 용해시킵니다. 24웰 플레이트 크기 기질의 경우 PDL 작업 용액 1mL를 추가하고 37°C 인큐베이터에 4시간 동안 넣어 기질 표면을 완전히 코팅합니다.
    3. 코팅이 완료되면 PDL 작업 용액을 제거하고 PBS로 3회 세척하여 잔류 PDL을 제거합니다. 후속 세포 실험에 기질을 사용하십시오. 코팅을 즉시 사용하지 않을 경우 건조시켜 4°C에서 보관하십시오.
      참고: 성공적인 코팅은 위상차 현미경 검사에서 눈에 보이는 결정질 침전물이나 건조 아티팩트 없이 균질하고 특징이 없는 표면을 나타냈습니다. 결정화 징후가 있거나 코팅이 불균일한 기판은 폐기되었습니다.
  2. 일차 마우스 골수 간질 세포(mBMSC)의 분리 및 배양
    1. 생쥐의 경골과 대퇴골에서 일차 마우스 골수 간질 세포(mBMSC)를 분리합니다.
    2. 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% 항생제-항진균제 및 1% 피루브산나트륨이 보충된 α-MEM으로 구성된 성장 배지에서 세포를 배양합니다.
    3. 5,000 cells/cm2 의 밀도로 단계 4.1.3에서 얻은 기질에 계대 3에서 세포를 종종하여 세포-세포 접촉으로 인한 잠재적 교란 효과를 최소화합니다.
  3. 면역형광 염색 및 이미징
    1. 배양 16시간(37°C, 5% CO2) 후, 실온에서 10분 동안 4% 파라포름알데히드로 세포를 고정하고 PBS로 3회 세척합니다. 그런 다음 실온에서 15분 동안 0.1% Triton X-100으로 세포를 투과화하고 PBS로 3회 세척합니다.
    2. 세포골격 시각화를 위해 팔로이딘(1:500 희석)을 사용하여 F-액틴을 실온에서 20분 동안 염색하고 충분한 PBS로 3회 세척하여 잔류 염료를 제거합니다.
    3. 세포 핵의 동시 염색으로 기질을 장착합니다. DAPI와 함께 글리세린 한 방울을 바르고 세포를 덮습니다. 그런 다음 기판 위에 커버슬립을 조심스럽게 놓고 매니큐어를 사용하여 여백을 밀봉합니다. 가능한 한 거품을 피하십시오.
    4. 도립 형광 현미경을 사용하여 세포 형태 및 핵 위치를 캡처하는 형광 이미지를 획득합니다.

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결과

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포토리소그래피는 평행 능선 및 홈 미세 구조를 특징으로 하는 재사용 가능한 실리콘 마스터 몰드를 제작하는 데 사용되었습니다. 각각 20μm와 50μm의 홈 너비(능선 너비는 홈 너비와 동일)를 특징으로 하는 두 가지 디자인이 생성되었습니다. 각 패턴 영역은 7mm× 7mm로 측정되었습니다. 실리콘 몰드의 정밀도와 재사용성은 반복적인 기판 제조 공정을 크게 단순화했습니다. 그런 다음 마스터 몰드를 사용하여 PDMS의 미세 구조를 복제했습니다. 단단한 PDMS 제형을 실리콘에 대해 성형하여 하층을 만든 후 그 위에 얇고 부드러우며 평평한 PDMS 필름으로 접착하여 이중층 시스템을 생성했습니다.

그림 1은 강성 구배를 포함하는 중앙 정사각형 영역을 포함하는 제작된 이중층 기판을 보여주며, 강성 제어 역할을 하는 평평한 영역으로 둘러싸여 있습니다. SEM 이미지는 구조 전달의 충실도를 확인하고 기울기 영역에서 평평하고 지형적으로 특징...

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토론

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이 연구는 지형적으로 균일한 특징이 없는 표면을 유지하면서 국부적인 강성 변화를 도입하도록 설계된 이중층 PDMS 기반 기판을 설계하는 새로운 접근 방식을 제시합니다. 이 접근 방식은 일관된 표면 화학과 지형을 유지하면서 하부 구조 형상의 변화를 통해서만 기계적 변조를 허용합니다. 결과적으로 강성 신호를 다른 물리적, 화학적 단서로부터 효과적으로 분리하여 강성 조절을 위한 보다 생물학적으로 관련된 시스템을 제공합니다.

이 연구에서 강성 변조는 뻣뻣한 하단 PDMS 레이어의 형상을 조정하여 달성되며, 상단의 얇고 부드러운 PDMS 레이어는 평평한 접촉 인터페이스를 보장하여 다양한 셀 유형 및 이미징 시스템과의 광범위한 호환성을 보장합니다. 완전히 가교된 하이드로겔 또는 개별 강성 수준의 벌크 PDMS 기판에 의존하는 기존 방법과 비교할 때 이 접근 방식은 더 높은 공간 해상도와 연속성을 제공합니다. 단일 기판에서 여러 강...

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 중국 중앙 대학 기초 연구 기금(No. 2042024YXB018 to W. Ji)의 재정 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
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안티-앤티깁코15240-062항생제-항균류
DAPI를 이용한 안티페이드 마운팅 매체비요타임 바이오테크놀로지컬P0131글리세린과 DAPI 
세포 배양 플레이트둥지70200124개의 우물
건조기쓰촨 슈보(그룹) 유한회사913354-30SN내경=180mm
태아 소 혈청하이클론SV30208.02
역형광현미경올림푸스DP74
이소프로파놀상하이 알라딘80109218GC≥ 99.7%
마스크 얼라이너쓰촨 난광 진공 기술 유한회사H94-37
MEM 알파 수정하이클론SH30265.01
나노스코프 분석브루커버전 3.0AFM 이미지 처리 및 분석 소프트웨어.
오페라 페닉스 플러스 하이 컴포트 이미징 시스템퍼킨 엘머2400L23248 10개의 공중 목표물 장착
PGMEA쑤저우 나노마이크로 테크놀로지 유한회사171011-1현상액 네거티브 포토레지스트; 사양: UL; 퍼센트: 최소 99.7%
팔로이딘Uelandy YP0052L594-팔로이딘
인산염 완충 식염수 용액하이클론SH30256.01
플라즈마 클리너플라즈마 기술 (독일)플렉토 10번과 nbsp;
폴리-D-라이신비요타임 바이오테크놀로지컬ST508CAS 번호 27964-99-4
주사 탐침 현미경브루커차원 아이콘PeakForce 정량적 나노기계 매핑(PF-QNM) 및 포인트 앤 슛 램프 실험 작업 공간을 포함한 나노스코프 제어 소프트웨어를 사용합니다.
질화물 레버에 실리콘 팁브루커스캐나시스트-에어프로브는 단일 V자형 알루미늄 반사 코팅 캔틸레버를 특징으로 합니다; k= 0.4 N/m (명목상), f0 = 70 kHz.
실리콘 웨이퍼선전 리거러스 테크놀로지 유한회사-50.8 이상; 직경 0.3mm, 방향 (100) 525 이상; 25 & mu; 두께 m
피루브산나트륨깁코11360-070
스핀 코팅기중국과학원 마이크로전자연구소KW-4A
SU-8 3025쑤저우 나노마이크로 테크놀로지 유한회사-네거티브 포토레지스트; 고형물 72.3%; 점도는 4400; 밀도 1.143g/ml
SYLGARD 184 실리콘 엘라스토머 키트다우 케미컬 컴퍼니01673921
트리클로로(1H, 1H, 2H, 2H-트리데카플루오로-n-옥틸) 실란상하이 알라딘78560-45-9
트리톤 X-100바이오프록스1139ML100투과성을 위한 0.1% Triton X-100
트립신-EDTA깁코25200-0720.25% 트립신-EDTA (1배)
진공 오븐멤머트(독일) VO 200 

참고문헌

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