Method Article

바이오마커 발견에서 표적되지 않은 눈물액 지피도믹스를 위한 페놀 레드 실 샘플링 절차

DOI:

10.3791/69474

⸱

December 12th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Myopia Research, School of Optometry, The Hong Kong Polytechnic University, 2Centre for Eye and Vision Research (CEVR), 3Department of Food Science and Nutrition, The Hong Kong Polytechnic University, 4Research Centre for SHARP Vision (RCSV), The Hong Kong Polytechnic University, 5Department of Applied Biology and Chemical Technology, The Hong Kong Polytechnic University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 페놀 레드 스레드와 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법(LC-MS/MS) 기반 워크플로우를 사용하여 인간 눈물액 샘플을 수집하는 독특한 임상 프로토콜을 설명하여 눈물 지질 프로필을 발견합니다. 간단한 메틸 테르-부틸 에터(MTBE)/메탄올 이상 분리법은 눈물 바이오마커 발견을 위한 높은 회수율로 빠른 눈물 지질 추출을 가능하게 합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

눈물질 지질은 눈물막 안정성과 안구 표면 건강에 매우 중요합니다. 눈물 조성 변화는 마이보미안샘 기능 장애나 지질이상 같은 안구 및 전신 질환과 관련이 있을 수 있습니다. 눈물지질 프로파일링은 질병 진단 및 관리를 위한 바이오마커 발견에 도움이 될 수 있습니다. 그러나 일반적인 눈물 샘플링 방법에는 뚜렷한 한계가 있습니다: 쉬머 스트립은 눈 표면과 접촉하는 면적이 커서 자주 안구 자극과 불편함을 유발하며, 미세모세관 채취는 특히 다른 인력이 수행할 경우 조작자의 변동성으로 인해 재현성이 낮을 수 있습니다. 이러한 한계는 지피돔 데이터의 정확성과 일관성을 저하시킬 수 있습니다. 본 연구는 눈물 지질학에 최적화된 최소 침습 페놀 레드 스레드(PRT) 기반 샘플링 방법을 소개합니다. PRT의 얇은 구조는 안구 자극 위험을 최소화하고 빠르고 부드러운 눈물 수집을 가능하게 합니다. 이 사용자 친화적이고 수행하기 쉬운 방법은 눈물 양이 줄거나 이물질 감각에 대한 내성이 낮은 환자에게 적합하며, 조작자별 변동성을 줄여 샘플 채취를 더 재현 가능하게 합니다. PRT가 수집한 눈물 지질은 최적화된 메탄올/메틸 테르-부틸 에테르(MTBE) 상 분리 프로토콜을 사용하여 추출하였으며, 고해상도 LC-Orbitrap-IQX MS/MS와 LipidSearch 소프트웨어로 분석하였습니다. 이 워크플로우는 특정 지방산 유래 이온으로 특징지어지는 700종 이상의 독특한 눈물 지질 종을 확인했습니다. 이 결과는 PRT 기반 샘플링이 눈물 지질 분석을 위한 견고한 지질 회수를 제공함을 나타냅니다. 이 최소 침습적이고 재현 가능한 접근법은 임상 및 실험적 눈물 지질 연구를 위한 실용적인 기반을 제공합니다. 궁극적으로 이는 바이오마커 발견과 질병 모니터링을 촉진할 수 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

눈물막은 병원체로부터 안구 표면을 보호하고 안구 항상성을 유지하는 가장 바깥쪽 장벽입니다 1,2. 반면 눈물막 내 지질층은 눈물 증발을 방지하고 눈물막 안정성을 유지하는 핵심 구성 요소입니다 3,4. 눈물 지질 조성의 조절 장애는 안구건조증(DED), 마이봄샘 기능장애(MGD), 알레르기성 결막염 5,6,7,8 등 다양한 안과 연관되어 있습니다. 그 결과, 눈물 지질학의 상세한 특성 분석은 이러한 안구 질환의 분자 병리를 보다 포괄적으로 이해하는 데 있어 중요하고 주목받는 연구 방향이 되었습니다.

눈물 지질세포 접근법이 임상적으로 중요한 역할을 하지만, 눈물 지질세포에서 중요한 과제는 표준화되고 재현 가능한 수집 및 분석 워크플로우를 구축하는 것입니다. 현재의 눈물 샘플링 방법인 쉬머 스트립과 미세모세관 등은 각각 뚜렷한 한계를 가지고 있습니다. 쉬머 스트립은 안구 표면과 접촉면이 넓어 종종 안구 자극과 반사 찢어짐을 유발합니다 9,10. 반면, 미세모세관 채취는 조작자의 기술에 크게 의존하며, 서로다른 인력이 수행할 경우 결과가 일관되지 않을 수 있습니다. 또한, 이러한 샘플링 도구의 부적절한 사용은 안구 표면 손상 위험도 초래할 수 있습니다. 이러한 한계는 하위 데이터의 정확성과 재현성을 저해할 수 있습니다12,13. 더불어, 복잡한 취급 절차가 필요한 눈물 수집 방법은 다양한 실험실과 임상 환경 간 접근성과 표준화를 제한할 수 있습니다. 따라서 자연스러운 눈물 지질 프로필을 보존할 수 있는 비침습적이고 견고하며 재현 가능한 눈물 수집 및 처리 워크플로우를 확립할 시급한 필요가 있습니다.

최근 연구들은 프로테오믹 및 대사체학적 응용 분야에서 LC-MS/MS 워크플로우 분석에 페놀 레드 스레드(PRT)의 유용성을 강조했습니다14,15. PRT는 눈물 수집 도구로서 고유한 장점을 제공합니다. 얇은 구조, 최소 침습적 특성, 단순한 샘플링 절차는 기술적 복잡성을 최소화하고 운영자별 변동성을 줄이면서도 대부분의 피험자가 잘 견딜 수 있을 것으로 보인다14,16. 그러나 PRT 기반 눈물 지질 분석을 위한 표준화된 워크플로우는 아직 확립되지 않았습니다.

이 프로토콜은 재현 가능한 눈물 지질학을 위한 통합 워크플로우를 도입합니다: 지질 분석에 적합한 사용자 친화적인 PRT 기반 눈물 수집 방법, 정의된 용매 대 샘플 비율과 저장 제어17,18을 가진 최적화된 메틸 테르트-부틸 에테르(MTBE)/메탄올 지질 추출 프로토콜, 그리고 고해상도 LC-MS/MS를 이용한 수정된 지질 식별 방법. 이 표준화된 접근법은 후속 바이오마커 발견과 질병 특성 분석을 위한 일관된 눈물 지질세포 프로파일링을 가능하게 합니다. 또한, 눈물량이 적거나 이물질 감각에 대한 내성이 낮은 피험자에게 특히 적합합니다(그림 1).

figure-introduction-1
그림 1: 인간 눈물 지질학을 위한 페놀 레드 스레드(PRT) 기반 워크플로우의 개도 개요. PRT 방식을 사용하는 피험자로부터 눈물액을 채취하여 최소한의 불편함으로 일관된 샘플 채취가 가능합니다. 샘플 처리는 순차적인 MTBE/메탄올 이상 추출, SpeedVac 매개 농도, 그리고 액체 크로마토그래피-텐덤 질량분석법(LC-MS/MS)을 위한 눈물 지질 추출물 재구성을 포함합니다. 이후 LC-MS/MS 를 통해 리피도믹 프로필을 획득하고 LipidSearch 소프트웨어를 사용해 주석 및 식별합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 홍콩 폴리테크닉 대학교의 기관심사위원회(IRB)의 승인을 받았습니다. 참가자들은 연구 참여 전에 서면 동의서를 제공했습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 페놀 레드 스레드(PRT) 기반 인간 눈물액 수집

  1. 장갑을 착용하고 작업대를 소독하여 샘플 오염을 방지하세요.
  2. PRT 패키지가 밀봉되어 있고 만료되지 않았는지 반드시 확인하세요.
  3. 구부러진 바늘 반대편 끝을 잡아 실을 잡으세요. 항상 PRT의 구부러진 훅 부분을 만지지 마세요.
  4. 피실험자에게 상부 비강 방향을 보라고 하세요.
  5. 피험자의 아까 눈꺼풀을 부드럽게 내리고, 구부러진 후크를 피험자 눈의 외안각 근처 측두두엽 결막에 위치시키면서 PRT를 삽입합니다(그림 2).

figure-protocol-1
그림 2: 눈물 수집 중 페놀 붉은 실의 위치. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

  1. 피실험자에게 눈을 부드럽게 감고 머리를 약간 앞으로 숙여 PRT가 얼굴 피부에 닿지 않도록 하세요.
    참고: 눈물 흡수는 점차 붉은 염료 전면을 유도하는데, 이는 pH에 민감한 페놀 레드 때문에 PRT가 샘플링된 영역임을 나타냅니다. 지질 분석을 위해 충분한 눈물액을 확보하기 위해 PRT 50mm에 해당하는 눈물량을 채취하는 것이 권장되며, 보통 2분 이내에 완료됩니다.
  2. 피실험자의 아래 눈꺼풀을 부드럽게 내리고 샘플링한 PRT를 꺼내세요. 샘플링된 영역을 만지지 마세요.
  3. PRT의 샘플링 영역 길이를 기록한 후 멸균 겸자를 이용해 PRT를 새로운 샘플 튜브로 옮깁니다.
    참고: 샘플링된 PRT 길이가 <50mm라면, 피실험자에게 1-3분간 휴식을 취하고 같은 눈으로 다시 채취해 주시기 바랍니다. 각 샘플링된 PRT를 별도의 샘플 튜브로 옮깁니다.
  4. 샘플 튜브에 라벨을 붙이고 뚜껑을 잘 막으세요.
  5. 장갑과 겸자를 메탄올로 꼼꼼히 닦고, 종이 물티슈를 깨끗이 닦아 눈물 잔여물이나 오염물을 제거한 후 건조시키세요.
  6. 반대쪽 눈에도 1.2-1.10 단계를 반복하세요.
  7. 샘플 튜브를 파라필름으로 밀봉한 후 즉시 -20°C에서 임시 보관, -80°C에서 장기 보관을 위해 보관합니다. 불필요한 냉동-해동 과정을 피하고, 샘플링한 PRT를 빛으로부터 보호하세요.

2. 샘플 PRT의 처리

  1. PRT 가공 전에 메탄올로 마이크로 가위를 미리 세척하세요.
  2. PRT의 휘어진 후크 끝(즉, 처음 3mm)은 버리세요(그림 3).

figure-protocol-2
그림 3: 페놀 레드 실(PRT)의 물리적 모습. (A) 구부러진 후크 끝이 있는 미사용 PRT. (B) 지질 추출을 위해 지정된 절면을 절단하고 채취한 PRT를 사용함. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

  1. PRT의 샘플 영역(즉, 페놀 레드 염료 전면 위 영역)을 2mm 조각으로 잘라내어 깨끗한 1.5mL 유기 용매 내성 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다.

3. 샘플 PRT에서 지질 추출을 위한 MTBE/메탄올 이상 분리

주의: MTBE와 메탄올은 가연성이고 휘발성이 있습니다. 환기가 잘 되는 곳이나 배기구 후드에서 사용하세요. 불꽃과 불꽃을 피하세요. 장갑과 실험복을 착용하세요. 손을 다룬 후에는 손을 씻으세요.

  1. 샘플을 얼음 위에 올려놓으세요.
  2. 각 샘플에 232μL의 얼음 냉각 메탄올(MS 등급)을 추가하고 15초간 소용돌이 선을 이룹니다.
  3. 샘플을 미리 냉각된 초음파 세척기에서 15분간 초음파 처리하세요.
  4. 각 샘플에 774 μL MTBE(HPLC 등급)와 194 μL 탈이온수를 추가하고 15초간 소용돌이로 돌립니다. 샘플 내 MTBE:메탄올:물의 부피 비율은 4:1.2:1 (v/v/v)여야 합니다.
  5. 샘플을 다시 15분간 미리 냉각된 초음파 세척기로 초음파 처리합니다.
  6. 샘플을 4°C에서 8시간 동안 인큐브하며, 1,200rpm에서 흔듭니다.
  7. 혼합물을 실온에 10분간 두세요.
  8. 결과 혼합물을 10,000 × g에서 4°C에서 10 분간 원 심분리합니다.
  9. 원심분리 후 혼합물은 두 단계로 분리됩니다(그림 4).
    참고: 상 분리가 완료되면 샘플을 두 개의 뚜렷한 층으로 검사하세요: 상층 유기상(MTBE가 풍부함)은 투명하고 약간 우유빛 불투명도를 띠며, 하부 수용상은 페놀 레드 지표의 존재로 인해 노란색을 띱니다. 그림 4에 나타난 것처럼 이러한 상 특성이 관찰될 때만 진행하세요.

figure-protocol-3
그림 4: MTBE-메탄올-물을 이용한 지질 추출의 상 분리: 상부 유기상과 하부 수상. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

  1. 지질을 포함한 상부 유기 분획 700 μL를 조심스럽게 수집하여 미리 냉각된 1.5 mL 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다.
  2. 잔류 MTBE와 메탄올이 포함된 하부 수상은 유해 화학 폐기물로 폐기합니다. 폐기물을 라벨이 붙고 밀봉된 용기에 담아 기관의 유해 폐기물 프로토콜과 지역 규정에 따라 폐기하세요. 용제를 배수구에 부어버리지 마세요.
  3. 지질 추출물을 냉장 SpeedVac 농축기로 4 °C에서 4시간 건조하세요.
    참고: 완전한 건조를 위해 샘플 건조 정도를 2시간부터 주기적으로 확인하세요. 샘플이 완전히 마를 때까지 건조 시간을 필요 시 연장하세요.
  4. 건조된 지질 추출물을 단기 저장은 -20°C, 장기 저장은 -80°C에 보관하세요.

4. 추출한 눈물 지질의 재구성, LC-MS/MS 분석용

  1. 건조된 지질 추출물을 50 μL 얼음 냉각 메탄올(MS 등급)/클로로포름(HPLC 등급) 혼합물(1:1, v/v)으로 용매로 재구성하고, 1 mm의 PRT에 1 μL 용매를 사용해 15분간 초음파 검사를 진행합니다.
  2. 재구성된 지질 추출물을 14,000 × g , 4 °C에서 10분간 원심분리합니다.
  3. 상정액 40 μL를 유리 인서트가 설치된 자동 샘플러 유리 바이알에 조심스럽게 옮기세요.
  4. 비슬릿 비중격 뚜껑으로 뚜껑을 단단히 닫고 LC-MS/MS 분석을 준비하세요.

5. LC-MS/MS를 이용한 샘플 채취

  1. 액체 크로마토그래피의 경우, 컬럼 챔버와 샘플러 온도를 각각 50 °C와 4 °C로 설정하세요.
  2. 각 주입마다 5 μL의 샘플을 역상 LC 컬럼(C18; 1.7 μm, 100 mm × 2.1 mm)에 적재하고, 24분 간격 구배 중 0.3 mL/min의 유량으로 지질을 분획합니다.
    1. 이동상 A는 60:40 아세토니트릴(MS 등급): 물(v/v)과 5 mM 암모늄 포마트(MS 등급), 0.1%(v/v) 개산(MS 등급), 이동상 B(90:10 이소프로판올(MS 등급): 아세토니트릴(v/v)과 5 mM 암모늄 포마트, 0.1% (v/v) 개산을 혼합한 혼합물을 사용합니다.
    2. 다음 구배를 사용하세요: 0-2분: 40% B; 2-2.5분: 40% B; 2.5-3분: 58% B; 3-18분: 99% B; 18-20분: 99% B; 20-20.1분: 40% B; 20.1-24분: 40% B.
  3. 오비트랩 질량분석기의 경우, 양극 모드는 분무 전압 +3.5 kV 또는 음극 모드는 -2.5 kV로 설정합니다.
  4. 외피 가스 유량을 45 Arb로, 보조 가스 유량을 10 Arb로 조정하세요.
  5. 스윕 가스 유량을 2 Arb로 설정하세요.
  6. 이온 전달관 온도를 300 °C, 증기 온도 320 °C로 설정하세요.
  7. 데이터 의존 획득(DDA) 모드를 사용하세요.
  8. MS1의 경우 해상도를 120,000, 스캔 범위 100-2000 m/z, 표준 AGC 타겟, 자동 주입 시간, 동적 배제는 6초, 강도 임계값을 5.0e4로 설정하세요.
  9. MS2의 경우 해상도를 15,000, 자동 스캔 범위, 표준 AGC 타겟, 동적 주입 시간, 격리 창 1.6 m/z, 충돌 에너지 유형(HCD), 그리고 정규화 충돌 에너지(NCE)를 15, 30, 40의 단계별 값으로 설정하세요.
  10. LipidSearch 소프트웨어나 기타 호환 플랫폼으로 원시 데이터를 분석하세요.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

복합 찢어진 샘플은 2주 간격으로 세 차례 독립 방문(R1, 가장 오래된 배치; R2, R3는 각각 2주 후에 순차적으로 수집되었습니다. 엄격한 기준(예: 신호 대 잡음비 ≥100, 등급 C 이상, 이온 강도≥30,000)을 적용한 지질검색을 사용하여, 각각 R1-R3에서 773, 890, 1,025종의 고유 지질종을 확인했습니다(그림 5A). 양성 이온 모드는 1,302종의 지질종을 확인했으며, 26.0% 등급 A(즉, 지질 클래스와 특정 지질에 속하는 모든 지방산 사슬이 모두 완전히 확인됨; 338개의 지질), 13.2% B등급(즉, 지질 클래스 완전 식별 및 부분 지방산 사슬 식별), 60.8% 등급 C(즉, 지질 클래스 특이이온 또는 지방산 유래 생성물 이온이 검출됨)을 포함했습니다. 음이온 모드는 8.2% A등급(21개 지질), 22.9% B 등급, 68.9% C 등급을 가진 257종의 고유 지질을 확인했습...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PRT 기반 눈물 샘플링과 지질 추출의 장점
여기서 제시된 PRT 기반 눈물 지질학 워크플로우는 포괄적인 눈물 지질 프로파일링을 위한 최소 침습적이고 실용적인 샘플링 방법을 제공합니다. 장시간 접촉과 더 큰 샘플 부피가 필요한 Schirmer 스트립과 비교할 때, PRT 샘플링은 빠르고 2분 이내에 완료할 수 있으며, 눈물 부피가 감소하거나 안구 민감도가 높은 다양한 집단에 잘 견디고, 고해상도 LC-MS 지피도믹스와 호환되는 눈물 샘플을 제공합니다14,20. 시간이 많이 걸리고 정밀한 기술적 취급과 조작자의 전문성이 필요한 미세모세관 채취와 달리, PRT 기반 샘플링은 최소한의 교육이 필요하며 임상 환경에서 높은 재현성과 사용 용이성을 가지고 쉽게 수행할 수 있습니다14. 지질 추출 방...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 InnoHK 이니셔티브와 홍콩 특별행정구 정부, 홍콩 폴리테크닉 대학교 SHARP 비전 연구센터의 지원을 받았습니다. 저자들은 또한 홍콩 폴리테크닉 대학교의 화학 및 환경 분석 대학 연구 시설(UCEA)과 생명과학 대학 연구 시설(ULS)으로부터 기술 지원에 감사를 표합니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
아세토니트릴(ACN), LC-MS 등급RCI LabscanLM1005
액퀴티 UPLC CSH C18 컬럼워터스 코퍼레이션186005297130Å, 1.7 µ m, 2.1 mm X 100 mm
암모늄 포마트, LC-MS 등급시그마-올드리치55674
오토샘플러 유리 바이알웰 리치 사이언티브2ML-9-V10022mL 투명 유리 12*32mm 평평한 베이스 9-425 나사산 바이알, 라벨 포함 (필기 패드 포함)
파란색 9-425 오픈 탑 리브 스크류 캡;웰 리치 사이언티브9-SP10039mm, 흰색 PTFE/빨간색 실리콘 Septa 1mm
클로로포름, HPLC 등급덕산 시약들1271
에펜도르프 세이프락 튜브, 1.5 mL에펜도르프30120086
개미산(FA)과 nbsp; LC-MS 등급서모피셔 사이언티픽A117-50
유리 마이크로 인서트웰 리치 사이언티브2ML-N2002250 & 마이크로; L 인서트, 투명 유리, 폴리스프링 원뿔형 베이스, 크기: 5.8*28.5mm
이소프로판올, LC-MS 등급RCI LabscanLM1162
LipidSearch 소프트웨어서모피셔 사이언티픽OPTON-30879버전 5
메탄올, 그리고 nbsp; LC-MS 등급RCI LabscanLM1115
페놀 레드 스레드  (PRT)톈진징밍 신기술개발유한회사20192160086
냉장 원심분리기서모피셔 사이언티픽75007200
냉장 CentriVap 원심 농축기 및 CentriVap 콜드 트랩Labconco16108335
스크류 캡 마이크로 튜브서모피셔 사이언티픽3488
터트-부틸 메틸 에테르(MTBE), HPLC 등급덕산 시약들1070
써모 사이언티브 다이오넥스 얼티메이트 3000 HPLC서모피셔 사이언티픽ULTIM3000RSLCNANO
서모 사이언티픽 오비트랩 IQ-X 트라이브리드 MS서모피셔 사이언티픽FSN05-10001
서모믹서 C에펜도르프5382000015
초음파 세척기크레스트 초음파P500D-45
보텍스 믹서벤치마크BV1003

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Esam, S., Singh, S., Konda, N., Gandhi, R., Vemuganti, G. K. Tear film lipid layer thickness: Measurement techniques, normative values and alteration in ocular surface diseases. Curr Eye Res. , (2025).
  2. Ambaw, Y. A., et al. Profile of tear lipid mediator as a biomarker of inflammation for meibomian gland dysfunction and ocular surface diseases: Standard operating procedures. Ocul Surf. 26, 318-327 (2022).
  3. Sheppard, J. D., Nichols, K. K. Dry eye disease associated with meibomian gland dysfunction: Focus on tear film characteristics and the therapeutic landscape. Ophthalmol Ther. 12 (3), 1397-1418 (2023).
  4. Lam, S. M., et al. Lipidomic analysis of human tear fluid reveals structure-specific lipid alterations in dry eye syndrome. J Lipid Res. 55 (2), 299-306 (2014).
  5. Borchman, D., Ramakrishnan, V., Henry, C., Ramasubramanian, A. Differences in meibum and tear lipid composition and conformation. Cornea. 39 (1), 122-128 (2020).
  6. Miyamoto, M., Sassa, T., Sawai, M., Kihara, A. Lipid polarity gradient formed by ω-hydroxy lipids in tear film prevents dry eye disease. eLife. 9, 53582(2020).
  7. Zhao, H., et al. Lipidomics profiles revealed alterations in patients with meibomian gland dysfunction after exposure to intense pulsed light. Front Neurol. 13, 827544(2022).
  8. Bland, H. C., Moilanen, J. A., Ekholm, F. S., Paananen, R. O. Investigating the role of specific tear film lipids connected to dry eye syndrome: A study on o-acyl-ω-hydroxy fatty acids and diesters. Langmuir. 35 (9), 3545-3552 (2019).
  9. Khanna, R. K., et al. Metabolomics and lipidomics approaches in human tears: A systematic review. Surv Ophthalmol. 67 (4), 1229-1243 (2022).
  10. Winiarczyk, M., Biela, K., Michalak, K., Winiarczyk, D., Mackiewicz, J. Changes in tear proteomic profile in ocular diseases. Int J Environ Res Public Health. 19 (20), 13341(2022).
  11. Bertram, M., et al. Influence of Schirmer strip wetness on volume absorbed, volume recovered, and total protein content in canine tears. Vet Ophthalmol. 24 (4), 425-428 (2021).
  12. Zhan, X., Li, J., Guo, Y., Golubnitschaja, O. Mass spectrometry analysis of human tear fluid biomarkers specific for ocular and systemic diseases in the context of 3p medicine. EPMA J. 12 (4), 449-475 (2021).
  13. Gijs, M., et al. Pre-analytical sample handling effects on tear fluid protein levels. Sci Rep. 13 (1), 1317(2023).
  14. Kecskeméti, G., Tóth-Molnár, E., Janáky, T., Szabó, Z. An extensive study of phenol red thread as a novel non-invasive tear sampling technique for proteomics studies: Comparison with two commonly used methods. Int J Mol Sci. 23 (15), 8647(2022).
  15. Barmada, A., Shippy, S. A. Quantifying sample collection and processing impacts on fiber-based tear fluid chemical analysis. Transl Vis Sci Technol. 9 (10), 23(2020).
  16. Hao, Y., et al. Validation of the phenol red thread test in a Chinese population. BMC Ophthalmol. 23 (1), 498(2023).
  17. Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. J Lipid Res. 49 (5), 1137-1146 (2008).
  18. Ulmer, C. Z., Jones, C. M., Yost, R. A., Garrett, T. J., Bowden, J. A. Optimization of Folch, Bligh-Dyer, and Matyash sample-to-extraction solvent ratios for human plasma-based lipidomics studies. Anal Chim Acta. 1037, 351-357 (2018).
  19. Lam, S. M., et al. Extensive characterization of human tear fluid collected using different techniques unravels the presence of novel lipid amphiphiles. J Lipid Res. 55 (2), 289-298 (2014).
  20. Quah, J. H., Tong, L., Barbier, S. Patient acceptability of tear collection in the primary healthcare setting. Optom Vis Sci. 91 (4), 452-458 (2014).
  21. Saini, R. K., Prasad, P., Shang, X., Keum, Y. S. Advances in lipid extraction methods-a review. Int J Mol Sci. 22 (24), 13643(2021).
  22. Chen, J., Nichols, K. K., Wilson, L., Barnes, S., Nichols, J. J. Untargeted lipidomic analysis of human tears: A new approach for quantification of o-acyl-omega hydroxy fatty acids. Ocul Surf. 17 (2), 347-355 (2019).
  23. Köfeler, H. C., et al. Recommendations for good practice in MS-based lipidomics. J Lipid Res. 62, 100138(2021).
  24. Ulmer, C. Z., et al. A review of efforts to improve lipid stability during sample preparation and standardization efforts to ensure accuracy in the reporting of lipid measurements. Lipids. 56 (1), 3-16 (2021).
  25. Sens, A., et al. Pre-analytical sample handling standardization for reliable measurement of metabolites and lipids in LC-MS-based clinical research. J Mass Spectrom Adv Clin Lab. 28, 35-46 (2023).
  26. Salem, M., Bernach, M., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. A simple fractionated extraction method for the comprehensive analysis of metabolites, lipids, and proteins from a single sample. J Vis Exp. (124), e55802(2017).
  27. Fong, P. Y., et al. Role of tear film biomarkers in the diagnosis and management of dry eye disease. Taiwan J Ophthalmol. 9 (3), 150-159 (2019).
  28. Sanroque-Muñoz, M., et al. Tear-derived extracellular vesicles as diagnostic biomarkers for ocular and neurodegenerative diseases: Opportunities and challenges. Extracell Vesicles Circ Nucl Acids. 6 (3), 609-625 (2025).
  29. Vera-Montecinos, A., et al. High throughput tear proteomics with data independent acquisition enables biomarker discovery in allergic conditions. Sci Rep. 15 (1), 31181(2025).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tear LipidomicsPhenol Red ThreadTear Fluid SamplingLipid BiomarkersOcular Surface HealthMethanol MTBE ExtractionLC MS Lipid AnalysisTear Film StabilityMinimally Invasive SamplingLipid Species Identification

Related Articles