이 프로토콜은 페놀 레드 스레드와 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법(LC-MS/MS) 기반 워크플로우를 사용하여 인간 눈물액 샘플을 수집하는 독특한 임상 프로토콜을 설명하여 눈물 지질 프로필을 발견합니다. 간단한 메틸 테르-부틸 에터(MTBE)/메탄올 이상 분리법은 눈물 바이오마커 발견을 위한 높은 회수율로 빠른 눈물 지질 추출을 가능하게 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
눈물질 지질은 눈물막 안정성과 안구 표면 건강에 매우 중요합니다. 눈물 조성 변화는 마이보미안샘 기능 장애나 지질이상 같은 안구 및 전신 질환과 관련이 있을 수 있습니다. 눈물지질 프로파일링은 질병 진단 및 관리를 위한 바이오마커 발견에 도움이 될 수 있습니다. 그러나 일반적인 눈물 샘플링 방법에는 뚜렷한 한계가 있습니다: 쉬머 스트립은 눈 표면과 접촉하는 면적이 커서 자주 안구 자극과 불편함을 유발하며, 미세모세관 채취는 특히 다른 인력이 수행할 경우 조작자의 변동성으로 인해 재현성이 낮을 수 있습니다. 이러한 한계는 지피돔 데이터의 정확성과 일관성을 저하시킬 수 있습니다. 본 연구는 눈물 지질학에 최적화된 최소 침습 페놀 레드 스레드(PRT) 기반 샘플링 방법을 소개합니다. PRT의 얇은 구조는 안구 자극 위험을 최소화하고 빠르고 부드러운 눈물 수집을 가능하게 합니다. 이 사용자 친화적이고 수행하기 쉬운 방법은 눈물 양이 줄거나 이물질 감각에 대한 내성이 낮은 환자에게 적합하며, 조작자별 변동성을 줄여 샘플 채취를 더 재현 가능하게 합니다. PRT가 수집한 눈물 지질은 최적화된 메탄올/메틸 테르-부틸 에테르(MTBE) 상 분리 프로토콜을 사용하여 추출하였으며, 고해상도 LC-Orbitrap-IQX MS/MS와 LipidSearch 소프트웨어로 분석하였습니다. 이 워크플로우는 특정 지방산 유래 이온으로 특징지어지는 700종 이상의 독특한 눈물 지질 종을 확인했습니다. 이 결과는 PRT 기반 샘플링이 눈물 지질 분석을 위한 견고한 지질 회수를 제공함을 나타냅니다. 이 최소 침습적이고 재현 가능한 접근법은 임상 및 실험적 눈물 지질 연구를 위한 실용적인 기반을 제공합니다. 궁극적으로 이는 바이오마커 발견과 질병 모니터링을 촉진할 수 있습니다.
서론
눈물막은 병원체로부터 안구 표면을 보호하고 안구 항상성을 유지하는 가장 바깥쪽 장벽입니다 1,2. 반면 눈물막 내 지질층은 눈물 증발을 방지하고 눈물막 안정성을 유지하는 핵심 구성 요소입니다 3,4. 눈물 지질 조성의 조절 장애는 안구건조증(DED), 마이봄샘 기능장애(MGD), 알레르기성 결막염 5,6,7,8 등 다양한 안과 연관되어 있습니다. 그 결과, 눈물 지질학의 상세한 특성 분석은 이러한 안구 질환의 분자 병리를 보다 포괄적으로 이해하는 데 있어 중요하고 주목받는 연구 방향이 되었습니다.
눈물 지질세포 접근법이 임상적으로 중요한 역할을 하지만, 눈물 지질세포에서 중요한 과제는 표준화되고 재현 가능한....
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프로토콜
이 연구는 홍콩 폴리테크닉 대학교의 기관심사위원회(IRB)의 승인을 받았습니다. 참가자들은 연구 참여 전에 서면 동의서를 제공했습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.
1. 페놀 레드 스레드(PRT) 기반 인간 눈물액 수집
- 장갑을 착용하고 작업대를 소독하여 샘플 오염을 방지하세요.
- PRT 패키지가 밀봉되어 있고 만료되지 않았는지 반드시 확인하세요.
- 구부러진 바늘 반대편 끝을 잡아 실을 잡으세요. 항상 PRT의 구부러진 훅 부분을 만지지 마세요.
- 피실험자에게 상부 비강 방향을 보라고 하세요.
- 피험자의 아까 눈꺼풀을 부드럽게 내리고, 구부러진 후크를 피험자 눈의 외안각 근처 측두두엽 결막에 위치시키면서 PRT를 삽입합니다(그림 2).
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결과
복합 찢어진 샘플은 2주 간격으로 세 차례 독립 방문(R1, 가장 오래된 배치; R2, R3는 각각 2주 후에 순차적으로 수집되었습니다. 엄격한 기준(예: 신호 대 잡음비 ≥100, 등급 C 이상, 이온 강도≥30,000)을 적용한 지질검색을 사용하여, 각각 R1-R3에서 773, 890, 1,025종의 고유 지질종을 확인했습니다(그림 5A). 양성 이온 모드는 1,302종의 지질종을 확인했으며, 26.0% 등급 A(즉, 지질 클래스와 특정 지질에 속하는 모든 지방산 사슬이 모두 완전히 확인됨; 338개의 지질), 13.2% B등급(즉, 지질 클래스 완전 식별 및 부분 지방산 사슬 식별), 60.8% 등급 C(즉, 지질 클래스 특이이온 또는 지방산 유래 생성물 이온이 검출됨)을 포함했습니다. 음이온 모드는 8.2% A등급(21개 지질), 22.9% B 등급, 68.9% C 등급을 가진 257종의 고유 지질을 확인했습.......
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토론
PRT 기반 눈물 샘플링과 지질 추출의 장점
여기서 제시된 PRT 기반 눈물 지질학 워크플로우는 포괄적인 눈물 지질 프로파일링을 위한 최소 침습적이고 실용적인 샘플링 방법을 제공합니다. 장시간 접촉과 더 큰 샘플 부피가 필요한 Schirmer 스트립과 비교할 때, PRT 샘플링은 빠르고 2분 이내에 완료할 수 있으며, 눈물 부피가 감소하거나 안구 민감도가 높은 다양한 집단에 잘 견디고, 고해상도 LC-MS 지피도믹스와 호환되는 눈물 샘플을 제공합니다14,20. 시간이 많이 걸리고 정밀한 기술적 취급과 조작자의 전문성이 필요한 미세모세관 채취와 달리, PRT 기반 샘플링은 최소한의 교육이 필요하며 임상 환경에서 높은 재현성과 사용 용이성을 가지고 쉽게 수행할 수 있습니다14. 지질 추출 방.......
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공개 사항
저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.
감사의 글
이 연구는 InnoHK 이니셔티브와 홍콩 특별행정구 정부, 홍콩 폴리테크닉 대학교 SHARP 비전 연구센터의 지원을 받았습니다. 저자들은 또한 홍콩 폴리테크닉 대학교의 화학 및 환경 분석 대학 연구 시설(UCEA)과 생명과학 대학 연구 시설(ULS)으로부터 기술 지원에 감사를 표합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아세토니트릴(ACN), LC-MS 등급 | RCI Labscan | LM1005 | |
| 액퀴티 UPLC CSH C18 컬럼 | 워터스 코퍼레이션 | 186005297 | 130Å, 1.7 µ m, 2.1 mm X 100 mm |
| 암모늄 포마트, LC-MS 등급 | 시그마-올드리치 | 55674 | |
| 오토샘플러 유리 바이알 | 웰 리치 사이언티브 | 2ML-9-V1002 | 2mL 투명 유리 12*32mm 평평한 베이스 9-425 나사산 바이알, 라벨 포함 (필기 패드 포함) |
| 파란색 9-425 오픈 탑 리브 스크류 캡; | 웰 리치 사이언티브 | 9-SP1003 | 9mm, 흰색 PTFE/빨간색 실리콘 Septa 1mm |
| 클로로포름, HPLC 등급 | 덕산 시약들 | 1271 | |
| 에펜도르프 세이프락 튜브, 1.5 mL | 에펜도르프 | 30120086 | |
| 개미산(FA)과 nbsp; LC-MS 등급 | 서모피셔 사이언티픽 | A117-50 | |
| 유리 마이크로 인서트 | 웰 리치 사이언티브 | 2ML-N2002 | 250 & 마이크로; L 인서트, 투명 유리, 폴리스프링 원뿔형 베이스, 크기: 5.8*28.5mm |
| 이소프로판올, LC-MS 등급 | RCI Labscan | LM1162 | |
| LipidSearch 소프트웨어 | 서모피셔 사이언티픽 | OPTON-30879 | 버전 5 |
| 메탄올, 그리고 nbsp; LC-MS 등급 | RCI Labscan | LM1115 | |
| 페놀 레드 스레드 (PRT) | 톈진징밍 신기술개발유한회사 | 20192160086 | |
| 냉장 원심분리기 | 서모피셔 사이언티픽 | 75007200 | |
| 냉장 CentriVap 원심 농축기 및 CentriVap 콜드 트랩 | Labconco | 16108335 | |
| 스크류 캡 마이크로 튜브 | 서모피셔 사이언티픽 | 3488 | |
| 터트-부틸 메틸 에테르(MTBE), HPLC 등급 | 덕산 시약들 | 1070 | |
| 써모 사이언티브 다이오넥스 얼티메이트 3000 HPLC | 서모피셔 사이언티픽 | ULTIM3000RSLCNANO | |
| 서모 사이언티픽 오비트랩 IQ-X 트라이브리드 MS | 서모피셔 사이언티픽 | FSN05-10001 | |
| 서모믹서 C | 에펜도르프 | 5382000015 | |
| 초음파 세척기 | 크레스트 초음파 | P500D-45 | |
| 보텍스 믹서 | 벤치마크 | BV1003 |
참고문헌
- Esam, S., Singh, S., Konda, N., Gandhi, R., Vemuganti, G. K. Tear film lipid layer thickness: Measurement techniques, normative values and alteration in ocular surface diseases. Curr Eye Res. , (2025).
- Ambaw, Y. A., et al.
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재인쇄 및 허가
