방법 논문

괴사증 중 리소좀 막 투과화의 살아있는 세포 이미징

DOI:

10.3791/69495

⸱

2025년 11월 14일

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Medicine, Heart Institute, Department of Internal Medicine, Morsani College of Medicine, University of South Florida

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 리소좀 막 무결성 및 산성화의 변화를 감지하는 형광 프로브를 활용하여 괴사증 동안 리소좀 막 투과성을 모니터링하기 위한 살아있는 세포 이미징 방법을 설명합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

조절된 괴사의 한 형태인 괴사증은 세포막 파열로 절정에 이릅니다. 우리 연구실과 다른 연구실은 리소좀 막 투과화(LMP)가 막 파열에 앞서 이 과정에서 초기에 중요한 사건이라는 것을 발견했습니다. Rapid LMP는 강력한 리소좀 효소, 특히 프로테아제를 세포질로 방출하여 세포 사멸을 적극적으로 촉진합니다. 살아있는 세포 이미징은 네크로프토시스 동안 LMP를 실시간으로 검출하는 데 매우 유용한 도구를 제공합니다. 여러 형광 염료가 매우 효과적입니다. (1) pH에 민감한 LysoTracker 염료는 리소좀 pH의 변화를 추적합니다. 형광 신호의 감소는 리소좀 pH 구배의 손실을 나타내며, 이는 LMP의 전조 또는 직접적인 결과일 수 있는 리소좀 기능 장애의 주요 징후입니다. (2) 플루오레세인 표지 덱스트란 비드는 내재화되어 리소좀에 축적됩니다. 세포질로의 방출은 완전한 LMP 및 화물 누출을 나타냅니다. 여기에서 우리는 괴사폐쇄 유도 후 덱스트란 형광이 세포질로 확산되는 Lysotracker 형광의 점진적인 손실을 관찰했습니다. 따라서 살아있는 세포 이미징 방법론을 통해 연구자들은 리소좀 기능 장애의 시기와 정도를 정확하게 추적할 수 있으며, 괴사증 메커니즘에 대한 보다 포괄적인 이해에 기여하고 잠재적인 치료 개입을 밝힐 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

괴사증은 많은 염증성 질환, 신경퇴행성 질환, 폐, 간 및 심장 질환과 관련된 카스파제 독립적 형태의 조절된 세포 사멸입니다 1,2,3. 이 경로는 수용체 상호작용 단백질 키나아제 1(RIPK1)의 활성화로 절정에 달하는 복잡한 캐스케이드 반응에 의해 매개되며, 이는 동형 RIP 상호작용 모티프(RHIM) 도메인 4,5,6을 통해 수용체 상호작용 단백질 키나아제 3(RIPK3)과 상호 작용합니다. RIPK3는 차례로 혼합 계통 키나아제 유사 단백질(MLKL)을 모집하여 괴사체 7,8을 형성합니다. RIPK3에 의한 MLKL의 인산화는 올리고머화 및 후속 중합으로 이어집니다. 그런 다음 MLKL 중합체는 세포막으로 이동하여 결국 세포막 파열 및 세포 사멸을 초래합니다 9,10,11. 그러나 MLKL 폴리머가 막 구획으로 이동하여 막 파괴를 유도하는 메커니즘은 완전히 이해되지 않았습니다.

리소좀은 세포 물질의 분해 및 재활용을 담당하는 소기관입니다. 내강에는 거대분자 소화를 담당하는 프로테아제, 리파아제, 뉴클레아제 및 가수분해효소가 있어 세포 항상성을 유지합니다12,13. 따라서 리소좀 무결성과 적절한 기능의 유지는 효과적인 세포 제거, 스트레스에 대한 적응 및 전체 세포 생존을 보장하는 데 필수적입니다 14,15,16. 최근 연구는 괴사증과 리소좀막 투과화(LMP) 사이의 연관성을 나타냅니다17,18,19.

우리의 최근 관찰에 따르면 LMP는 세포막의 최종 파열에 앞서 괴사증 과정에서 초기에 중요한 사건입니다19. 구체적으로, 리소좀 막의 MLKL 중합은 빠른 LMP가 강력한 리소좀 효소, 특히 카텝신 B를 포함한 프로테아제를 세포질로 방출하도록 유도합니다. 그런 다음 이 프로테아제는 필수 단백질을 절단하여 세포 사멸을 촉진합니다. 중요한 것은 CTSB 활성을 억제하면 세포 사멸을 강력하게 보호한다는 것입니다19,20. 이 데이터는 LMP가 괴사성 경로의 중요한 조절제임을 시사합니다. 따라서 괴사증 중 LMP의 시기를 모니터링하는 것은 분자 메커니즘을 이해하고 잠재적인 치료 표적을 식별하는 데 필수적입니다.

면역염색, 투과전자현미경(TEM) 또는 유세포 분석과 같은 많은 기존의 LMP 검출 방법은 고정된 샘플을 필요로 하거나 그렇지 않으면 종점 정보만 제공한다21,22,23, 특히 급속한 괴사증 진행의 맥락에서 리소좀 파괴의 동적 과정을 포착하지 못한다. 대조적으로, 살아있는 세포 이미징 방법은 괴사 중 LMP의 고해상도 실시간 시각화를 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서 우리는 2개의 상보적인 리소좀 마커를 결합하고 HT-29 세포에서 유도된 괴사증을 결합하여 리소좀 막 무결성을 실시간으로 분석했습니다19. 이 기술은 괴사증뿐만 아니라 특히 질병 또는 리소좀 표적 치료제의 사용과 관련하여 리소좀 무결성이 손상되는 다른 형태의 세포 스트레스에서도 잠재적으로 LMP를 연구하기 위한 강력하고 적응 가능한 플랫폼을 제공합니다 24,25,26.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 세포 배양 - 0일

  1. 멸균 유리 바닥 접시에 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린 및 스트렙토마이신(P/S)을 보충한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 2mL에 5,000개의 세포를 플레이트합니다.
  2. 세포를 37°C에서 5% CO2 와 함께 밤새 배양합니다.

2. 덱스트란 비드 로딩 - 1일차

  1. 2.5 mg/mL 원액 20 μL를 첨가하여 10% FBS 및 1% P/S가 보충된 신선한 DMEM에서 덱스트란 그린 비드를 25 μg/mL로 희석합니다.
  2. 오래된 배지를 제거하고 10% FBS 및 1% P/S가 보충된 2mL의 비드 함유 DMEM으로 교체합니다.
  3. 비드가 리소좀으로 내재화될 수 있도록 37°C에서 5% CO2 와 함께 세포를 24시간 동안 배양합니다.

3. Lysotracker 염색 - 2일차(실험일)

  1. 10% FBS 및 1% P/S가 보충된 신선한 DMEM 2mL에 1mM Lysotracker 원액 2μL를 첨가하여 염색 배지를 준비하여 최종 농도 1μM을 얻습니다. 기존 배지를 이 염색 용액으로 교체합니다.
  2. Life Technologies의 분자 프로브 사용 지침에 제공된 권장 배양 시간(30분에서 2시간)에 따라 5%CO2 와 함께 37°C에서 2시간 동안 배양합니다27. 우리의 실험에서 HT-29 세포에서 2시간의 배양은 덱스트란 비드와의 강한 공국소화와 함께 강력한 누점 염색을 가져왔고, 이는 안정적인 염료 형광을 나타냅니다.
    참고: 살아있는 세포 이미징 30분 전에 공초점 현미경을 켜십시오.

4. 공초점 현미경 설정

  1. 다음 순서로 Confocal 시스템 구성 요소를 켭니다: PC 현미경; 스캐너 전원; 레이저 출력; 레이저 방출; 라이카 파워.
  2. 환경 제어 켜기: 큐브 - 온도 컨트롤러; 브릭 - CO2 가스 혼합기 컨트롤러. CO2 및 O2 공급을 엽니다.
  3. 가스 매개변수 설정:
    1. 온도 조절기(큐브)를 37°C로 설정합니다.
    2. 가스 및 습도 컨트롤러(벽돌)를 5% CO2 및 95% 습도로 설정합니다.
  4. 그림 1과 같이 이미징 챔버를 조립합니다.
  5. 공초점 목표를 설정합니다.
    1. 63x/1.40 NA 오일 침지 대물렌즈를 사용하십시오.
    2. 여기 레이저를 488nm(녹색 형광단) 및 555nm(적색 형광단)로 설정합니다.
    3. 488nm 레이저의 경우 하이브리드(HyD) 검출기를 선택하고 555nm 레이저의 경우 PMT 검출기를 선택합니다.
      참고: 형광 누화는 공초점 소프트웨어에서 사전 정의된 게이트를 사용하여 최소화되었으며, 이는 채널 사이에 누화가 없음을 확인했습니다.

5. 염색 후 준비(LysoTracker 배양 후)

  1. 2mL의 PBS로 세포를 3회 조심스럽게 세척합니다.
  2. 10% FBS 및 1% P/S가 보충된 신선한 DMEM 2mL를 추가합니다.
  3. 이미징하기 전에 대물 렌즈에 침지 오일 한 방울을 바르십시오.
  4. 접시를 현미경 스테이지에 장착합니다.
  5. 레이저 강도와 배경을 조정합니다.
    1. 레이저 강도를 최대 3%까지 조정하되 5%를 넘지 않도록 조정하십시오.
    2. 현미경 소프트웨어에서 검출기 게인을 조정하여 신호를 최적화합니다.
    3. 배경을 최소화하려면 대비 막대를 조정합니다.
  6. 대조군 조건으로 사용되는 처리되지 않은 세포(T/S/Z 추가 전)의 기준선 이미지를 획득합니다.
  7. 플레이트를 층류 후드로 되돌리고 100ng/mL의 TNF-α(T), 500nM의 SMAC 모방물(S) 및 100μM의 Z-VAD-FMK(Z)를 포함하는 10% FBS 및 1% P/S가 보충된 DMEM 1mL를 추가합니다.
  8. 컨포칼 현미경에서 이미징을 계속합니다.
    참고: T/S/Z는 표준 프로토콜보다 더 높은 농도로 의도적으로 첨가되었습니다. 이 선택은 LMP와 세포 사멸을 가속화하여 실시간 이미징에서 초기 이벤트를 보다 안정적으로 캡처할 수 있도록 하기 위해 이루어졌습니다.

6. 이미지 획득 설정

  1. 획득 소프트웨어에서 매개변수를 다음과 같이 설정합니다. 모드: xyt; 형식: 512 x 512; 속도: 400; 줌: 3; 라인 평균: 1; 라인 축적: 3; 프레임 축적: 1; 시간 간격: 3분; 소요 시간: 8시간; 자동 초점을 활성화합니다.
  2. 시작을 클릭하여 타임랩스 획득을 시작합니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜에 설명된 절차를 통해 공초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포 이미지를 획득하여 LMP를 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 그림 1 은 세포 도금에서 이미지 획득에 이르기까지 실험 프로토콜의 개략도를 보여줍니다. 0일째, 5,000개의 HT-29 세포를 도금하고 37°C 및 5% CO2에서 24시간 동안 배양했습니다. 24시간(1일) 후, 세포를 동일한 조건에서 추가로 24시간 동안 플루오레세인 표지 덱스트란 비드(25μg/mL)와 함께 배양했습니다. 이 구슬은 엔도사이토시스와 리소좀으로의 이동에 의해 내면화되며, 그곳에서 축적되어 밝은 점점으로 나타납니다. 2일차(실험일)에 세포를 37°C 및 5%CO2에서 2시간 동안 pH에 민감한 LysoTracker 염료(1μM)로 처리했습니다. LysoTracker는 후기 엔도좀 및 리소좀과 같은 산성 구획 내에서 강한 형광을 집중하고 나타냅니다. 이미징 30분 전에 프로토콜의 4단계에 설명된 대로 온도, 가스 및 습도 컨트롤러를 포함하여 공초점 현미경 시스템의 전원을 켜고 안정화했습니다. 그림 2와 같이 이미징 챔버가 조립되었습니다. 488nm(녹색) 및 555nm(빨간색) 레이저를 사용했습니다.

LysoTracker와 배양한 후, 세포를 PBS로 3회 조심스럽게 세척하고, 10% FBS 및 1% P/S를 보충한 신선한 DMEM 2mL를 첨가하였다. 플레이트를 현미경으로 옮기고 63x/1.40 NA 오일 침지 대물렌즈에 침지 오일 한 방울을 도포했습니다. 그런 다음 5.5단계에서 설명한 대로 이미징 조건을 최적화하기 위해 레이저 강도 및 배경 수준을 조정했습니다. 프로토콜의. 우리의 초기 이미지는 Lysotracker 및 플루오레세인 표지 덱스트란의 안정적인 누점의 존재를 확인했으며, 이는 온전한 리소좀을 나타냅니다(그림 3). 기준선 이미지는 T/S/Z 이전에 획득되어 대조군으로 사용되었습니다. 차량은 적용되지 않았습니다.

초기 이미징 및 현미경 설정을 설정한 후 플레이트를 층류 후드로 되돌리고 100ng/mL TNF-α(T), 500nM SMAC 모방체(S) 및 100μM Z-VAD-FMK(Z)를 포함하는 10% FBS 및 1% P/S가 보충된 DMEM 1mL를 첨가했습니다. 이미징은 프로토콜의 6단계에서 설명된 이미징 획득 매개변수를 사용하여 컨포칼 현미경에서 계속되었습니다. 그림 3, 보충 동영상 S1 및 보충 동영상 S2에서 볼 수 있듯이, T/S/Z 처리된 세포에서 LysoTracker 형광의 점진적인 감소는 리소좀 변화의 초기 지표로 작용했습니다. 이 손실은 리소좀에서 사이토솔로의 플루오레세인 표지 덱스트란의 유출(점상에서 확산 이동)으로 뒤따랐으며 때때로 동시에 발생하여 LMP를 나타냅니다. 8시간에서 거의 모든 리소트래커 신호가 사라졌지만, 많은 세포는 여전히 세포질 녹색 신호와 함께 녹색 점점을 유지했으며, 이는 리소좀 pH 구배의 손실이 완전한 LMP 및 화물 방출에 선행함을 시사합니다.

그림 1
그림 1: 실험 프로토콜의 개략도. (BioRender.com 년에 작성) 초기에 5,000개의 세포를 도금하고(0시간) 24시간 동안 배양했습니다. 그 후, 덱스트란 비드(25μg/mL)를 첨가하고 추가로 24시간 동안 배양했습니다. 48시간에 LysoTracker(1μM)를 첨가하고 2시간 동안 배양했습니다. 세포를 PBS로 3회 세척한 후(1단계) 10% FBS 및 1% P/S가 보충된 신선한 DMEM 2mL를 첨가하였다(2단계). 현미경 설정을 조정하고(3단계), 세포를 TNF-α(T), SMAC 모방체(S) 및 범-카스파제 억제제 Z-VAD-FMZ(Z)(4단계)로 처리한 후 살아있는 세포 이미지 획득(5단계)을 수행했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2: 이미징 챔버 설정 다이어그램. (A) 샘플 홀더, (B) 가스 배양 챔버 및 (C) 상단 뚜껑. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3: T/S/Z 처리 전후의 HT29 세포의 대표 이미지. 세포를 Lysotracker 빨간색 및 덱스트란 녹색 비드로 염색하고 TNF-α(T), SMAC 모방체(S) 및 판-카스파제 억제제 Z-VAD-FMZ(Z)로 처리했습니다. 스케일 바: 10μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 동영상 S1: 덱스트란 녹색 비드와 함께 배양하고 T/S/Z로 처리한 HT29 세포의 타임랩스. 세포 반응을 평가하기 위해 세포를 6시간 이상 모니터링했습니다. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 동영상 S2: LysoTracker red와 함께 배양하고 T/S/Z로 처리한 HT29 세포의 타임랩스. 세포 반응을 평가하기 위해 세포를 6시간 이상 모니터링했습니다. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 LysoTracker와 플루오레세인 표지 덱스트란 비드의 조합이 리소좀 pH와 화물 방출을 실시간으로 동시에 모니터링할 수 있음을 입증했습니다. 대표적인 결과(그림 3, 보충 동영상 S1 및 보충 동영상 S2)는 처리되지 않은 세포가 두 마커 모두에 대해 안정적인 점자 신호를 유지한다는 것을 확인합니다. 대조적으로, T/S/Z 치료는 LMP와 일치하는 Lysotracker 강도의 점진적인 손실과 누점에서 미만성 세포질 분포로의 덱스트란의 이동을 나타냅니다.

이 프로토콜의 중요한 첫 번째 단계는 이미지 획득을 위한 셀을 선택하는 것입니다. 우리의 이전 데이터는 T/S/Z 치료가 24시간 이내에 HT-29 세포의 약 80%를 사멸시키고 나머지 20%는19시간 동안 생존한다는 것을 보여줍니다. 실험 시작 시 LMP가 존재하지 않기 때문에 세포는 처음에 형태와 LysoTracker 및 덱스트란 비드 모두에 대한 이중 양성 신호를 기반으로 선택됩니다. 이 방법은 어떤 특정 세포가 LMP를 겪을지 예측할 수는 없지만, 모니터링된 집단의 약 60%가 8시간 이미징 기간 동안 결국 LMP를 나타내는 것을 일관되게 관찰했습니다. 또 다른 과제는 순차 이미징의 고유한 특성에서 비롯됩니다. 3분마다 이미지 획득 중에 발생하는 셀의 Z-위치에서 약간의 드리프트는 전체 실험에서 동일한 점자 신호를 지속적으로 추적하지 못하게 합니다. 또한, 세포는 T/S/Z-처리에 반응하여 이동하고 형태학적 변화를 겪습니다28. 결과적으로, 이미징 기간 동안 개별 리소좀의 역학을 추적하는 것은 불가능합니다. 장기 살아있는 세포 이미징에서 세포 사멸의 매개체로서 광독성의 잠재적 기여는 중요한 고려 사항입니다. 장시간 세션 동안 지속적인 흥분은 활성 산소종을 생성하고 세포 생존력을 손상시킬 수 있습니다.29, 잠재적으로 진정한 괴사 반응을 방해할 수 있습니다. 이러한 효과를 최소화하기 위해 낮은 레이저 출력과 짧은 노출 시간을 적용했습니다. 또한, 세포 사멸 과정을 가속화하기 위해 T/S/Z를 5회 농축하여 투여하였다. 그러나 관찰된 리소좀 변화에 대한 빛 유도 스트레스의 기여를 완전히 배제할 수는 없습니다.

이 생세포 이미징 프로토콜의 중요한 장점은 리소좀 pH 변화와 LMP를 실시간으로 모니터링하여 TEM, 유세포 분석 및 면역염색과 같은 종점 분석에서 놓친 동적 이벤트를 캡처할 수 있다는 것입니다. TEM은 고해상도 구조적 통찰력을 제공하지만 LMP의 시간적 진행을 포착할 수는 없습니다. 아크리딘 오렌지 재배치 분석(30) 또는 갈렉틴-천점 형성(31)과 같은 대체 생세포 방법도 리소좀 무결성을 모니터링하는 데 유용한 도구이지만 각각을 단독으로 사용할 때 한계가 있습니다. 아크리딘 오렌지 분석은 산성 소기관에서 세포질로의 염료 재분포를 보고하며, 이는 리소좀 pH 변화와 막 투과화의 영향을 모두 받으므로 화물 방출과 직접적인 상관관계가 없습니다. 유사하게, 갈렉틴-점점 형성은 내강 글리칸이 세포질에 노출되는 것을 반영하여 리소좀 막 손상을 표시하지만31,32, 부분 투과화와 완전한 리소좀 파열을 구별하지 않습니다.

이 프로토콜의 핵심 강점은 LysoTracker와 덱스트란 비드를 결합하여 리소좀 산성화와 화물 누출을 동시에 조사할 수 있다는 것입니다. 이것은 리소좀 기능과 구조적 무결성 모두에 대한 고유한 이중 판독값을 제공합니다. LysoTracker 페이딩은 리소좀 pH 변화의 지표 역할을 하는 반면, 덱스트란 방출은 리소좀 함량의 물리적 누출을 직접 보고합니다. 이 두 마커를 함께 사용함으로써 부분 및 전체 LMP의 검출을 크게 향상시킵니다. 따라서 이 살아있는 세포 이미징 전략은 광범위하게 적용 가능합니다. 연구자들은 약리학적 또는 유전적 교란을 포함한 다양한 실험 조건에서 리소좀 무결성을 연구하기 위해 다른 세포 유형 및 다양한 형광 프로브와 함께 사용하도록 조정할 수 있습니다. 이 기능은 괴사증 메커니즘에 대한 이해를 높이고 잠재적인 치료 개입을 식별하는 데 핵심입니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zhigao Wang 박사의 연구실에서의 연구는 NIH 보조금 R35GM158455 및 R01GM147474의 지원을 받습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
HT-29 셀ATCCHTB-38대장암 세포
35mm 유리 바닥 접시맷텍 코퍼레이션P35G-1.5-14-C-GRD
CO2 인큐베이터PHCBIMCO-170AICUVL
공초점 현미경라이카SP8WLL
덱턴 그린 비즈서모피셔D1820덱스트란, 플루오레세인, 10,000 MW, 음이온, 라이신 고정 가능
둘벡코의 변형 독수리 미디엄(DMEM)코닝 10-013-CV
태아 소 혈청 (FBS)시티바와 nbsp;SH30910.03
라이소트래커 레드 DND-99인비트로젠L7528
오일 침수형 HF전자현미경 과학16915-01
페니실린과 스트렙토마이신 (P/S) 시그마-올드리치P4333
인산염 완충 식염수(PBS)코닝21-040-CV
스맥 모방 (S)BV6, ApexBio, 카탈로그B4653최종 농도, 1 mM
브릭앤앤비스핀;생명 영상 서비스13685가스 믹서 CO2 컨트롤러
큐브생명 영상 서비스CBO2A온도 제어 챔버 현미경
종양 괴사 인자 알파 (TNF-&α; - T)페프로텍30001A100UG최종 농도, 20 ng/ml
z-VAD-FMK (Z)에이펙스바이오A1902최종 농도, 20 mM

참고문헌

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